李亞璞，張小兵，閆靜輝

（河北省科學(xué)院生物研究所，河北石家莊 050081）

西洋參懸浮細(xì)胞的超低溫保存研究

李亞璞，張小兵，閆靜輝＊

（河北省科學(xué)院生物研究所，河北石家莊 050081）

對西洋參懸浮細(xì)胞的超低溫保存進(jìn)行了初步的研究，結(jié)果表明，首先將西洋參懸浮細(xì)胞在含8%蔗糖的西洋參液體培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)2天，然后經(jīng)過10%DMSO＋8%萄葡糖的冷凍保護(hù)劑處理，以4℃（60min）、0℃（30min）、－20℃（2h）、－70℃（30min）的降溫程序處理，最后投入液氮中，西洋參懸浮細(xì)胞可以生長為愈傷組織，且愈傷組織長勢旺盛。

西洋參；懸浮細(xì)胞；超低溫保存

西洋參（Panax quinquefolium）是五加科（Araliaccae）多年生草本名貴藥材，原產(chǎn)于北美洲，一般需4－6年才能收獲入藥，其有效成分是人參皂甙，具有強(qiáng)心、鎮(zhèn)定等功效。組織培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用于西洋參是解決其皂甙資源供應(yīng)不足的一條有效途徑［1］。但是在植物組織和細(xì)胞的長期培養(yǎng)過程中，不斷的繼代培養(yǎng)可能會引起染色體和基因型的變異，導(dǎo)致植物的一些寶貴的特殊性狀的丟失。利用液氮（－196℃）超低溫凍存是進(jìn)行植物組織和細(xì)胞長期、穩(wěn)定保存的一種有效方法。在液氮低溫條件下，所有的細(xì)胞分裂和代謝活動停止，植物材料在超低溫保存過程中應(yīng)該不會產(chǎn)生遺傳性狀的改變。因此它不僅可以解決組織、細(xì)胞培養(yǎng)過程中的變異問題，還可用于長期保存植物培養(yǎng)物的優(yōu)良株系［2，3］。該項(xiàng)工作始于20世紀(jì)70年代，迄今為止，國內(nèi)外已對近200種植物材料進(jìn)行了超低溫保存實(shí)驗(yàn)的研究。但是，關(guān)于藥用植物超低溫保存的研究還很缺乏，這種技術(shù)已在銀杏［4］、紅景天［5］、三分三［6］等藥用植物的離體培養(yǎng)物種質(zhì)保存中獲得了成功，但有關(guān)西洋參組織或細(xì)胞的超低溫保存研究少見報道。本文在西洋參懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的研究中，開展了對西洋參懸浮細(xì)胞超低溫保存的初步嘗試。

1 材料和方法

1.1 材料

本室經(jīng)過多次篩選獲得的優(yōu)質(zhì)西洋參懸浮細(xì)胞系，選擇處于旺盛對數(shù)分裂期的懸浮細(xì)胞作為冷凍材料。

1.2 方法

（1）預(yù)培養(yǎng)：在無菌條件下，將冷凍材料分為兩部分，一部分材料轉(zhuǎn)入到含8%蔗糖的西洋參液體培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)1、2、3天，另一部分材料未經(jīng)預(yù)培養(yǎng)作為對照。

（2）冷凍保護(hù)劑處理：參考文獻(xiàn)［7］，本次實(shí)驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)了5種組合的冷凍保護(hù)劑：①10%DMSO＋8%葡萄糖；②10%DMSO＋8%蔗糖；③10%DMSO＋10%葡萄糖；④10%DMSO；⑤對照組。將西洋參懸浮細(xì)胞分別置于冷凍保存管中，加入預(yù)冷的冷凍保護(hù)劑，使之浸沒細(xì)胞，密封保存管，靜置預(yù)處理30min.

（3）降溫冷凍處理：將冷凍保護(hù)劑處理的材料經(jīng)過以下3種方式的降溫冷凍處理后投入液氮中保存。①0℃→LN（液氮）；②0℃（30min）→－20℃（2h）→－70℃（30min）→LN（液氮）；③4℃（60min）→0℃（30min）→－20℃（2h）→－70℃（30min）→LN（液氮）。

（4）解凍和洗滌：實(shí)驗(yàn)材料在液氮中凍存7天后，然后將材料從液氮取出，采用37℃水浴化凍。待冷凍管內(nèi)的冰剛?cè)诨?，立即加入正常的西洋參液體培養(yǎng)基進(jìn)行沖洗，吸去培養(yǎng)液，同樣的方法洗滌三次，每次停留5min。冷凍保護(hù)劑對植物細(xì)胞可能存在毒害作用，解凍后的植物材料在培養(yǎng)之前應(yīng)除去冷凍劑。

（5）冷凍保存后細(xì)胞的恢復(fù)生長：將冷凍材料轉(zhuǎn)移到西洋參固體培養(yǎng)基上進(jìn)行再培養(yǎng)，在再培養(yǎng)過程中，觀察愈傷組織恢復(fù)生長的時間及生長狀況，35天測定生長速率。（生長速率＝收獲的愈傷組織量／接種的懸浮細(xì)胞量＊100%）

2 結(jié)果和分析

2.1 不同預(yù)培養(yǎng)時間條件下西洋參懸浮細(xì)胞的恢復(fù)生長情況

本實(shí)驗(yàn)將西洋參液體培養(yǎng)基的糖濃度提高到8%作為預(yù)培養(yǎng)基，然后將西洋參懸浮細(xì)胞經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)1、2、3天，再經(jīng)過相同的冷凍保護(hù)劑處理和降溫程序處理，結(jié)果見表1。由表1可以看出，與對照相比，經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)處理的懸浮細(xì)胞，其愈傷組織出現(xiàn)時間早，生長速度快?？梢?，預(yù)培養(yǎng)對西洋參懸浮細(xì)胞的超低溫保存有一定的影響。但是，預(yù)培養(yǎng)1、2、3天沒有顯著區(qū)別。這可能是將培養(yǎng)基的糖濃度提高對細(xì)胞的抗冰凍能力有一定的影響，從而使細(xì)胞的存活率得到提高。

表1 不同預(yù)培養(yǎng)時間條件下西洋參懸浮細(xì)胞的恢復(fù)生長情況

2.2 不同冷凍保護(hù)劑組合條件下西洋參懸浮細(xì)胞的恢復(fù)生長情況

選擇預(yù)培養(yǎng)2天的西洋參懸浮細(xì)胞作為研究對象，經(jīng)過不同的冷凍保護(hù)劑處理后，結(jié)果差異較大。由表2可以看出，經(jīng)過10%DMSO＋8%葡萄糖冷凍保護(hù)劑組合處理的西洋參懸浮細(xì)胞出現(xiàn)愈傷組織時間早，愈傷組織形態(tài)較好，生長速率最高；其它幾種組合的冷凍保護(hù)劑效果較差，沒有經(jīng)過冷凍保護(hù)劑處理的對照組沒有表現(xiàn)出愈傷組織的生長。可見，冷凍保護(hù)劑處理是西洋參懸浮細(xì)胞超低溫保存的關(guān)鍵步驟。

表2 不同冷凍保護(hù)劑組合條件下西洋參懸浮細(xì)胞的恢復(fù)生長情況

2.3 不同冷凍降溫程序處理西洋參懸浮細(xì)胞的恢復(fù)生長情況

冷凍降溫程序處理對西洋參懸浮細(xì)胞的影響見表3。由表3看出，降溫程序?qū)ξ餮髤腋〖?xì)胞的超低溫保存影響差異較大。采用分步冷凍法，西洋參懸浮細(xì)胞的成活率較高，出現(xiàn)愈傷組織的時間較早，愈傷組織形態(tài)較好，生長速率較高。經(jīng)過4℃（60min）預(yù)處理，西洋參愈傷組織生長速率最高。直接從0℃投入液氮保存的西洋參懸浮細(xì)胞，其凍后出現(xiàn)愈傷組織的時間較晚，愈傷組織褐變嚴(yán)重，基本上沒有生長。在超低溫保存中，預(yù)凍的目的是使細(xì)胞內(nèi)的水分脫出，形成對細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷不大的細(xì)胞外結(jié)冰，這樣就可以避免細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰對原生質(zhì)的損害。結(jié)果表明，細(xì)胞經(jīng)過分步降溫要比一步直接投入液氮中對細(xì)胞的傷害小。從0℃直接投入液氮，對西洋參懸浮細(xì)胞的超低溫保存是不適宜的，懸浮細(xì)胞復(fù)蘇后細(xì)胞活力太低，而在分步降溫過程中，在4℃環(huán)境中停留1 h預(yù)凍要比直接從0℃預(yù)凍的效果好。

表3 不同冷凍降溫程序處理下西洋參懸浮細(xì)胞的恢復(fù)生長情況

3 討論

超低溫（－196℃）保存是目前長期而穩(wěn)定地保存植物種質(zhì)資源的最好方法，在液氮低溫下，所有的細(xì)胞分裂和代謝活動停止，因而植物材料在超低溫保存過程中不會產(chǎn)生遺傳性狀的改變。除一些對脫水不敏感的材料以外，幾乎所有的植物材料都需經(jīng)過冰凍保護(hù)劑處理，超低溫保存后都能存活。到目前為止，利用超低溫保存的植物材料涉及到懸浮細(xì)胞、原生質(zhì)體、愈傷組織、莖尖、芽、花粉、胚或體胚、種子等，大部分已成功地實(shí)現(xiàn)了植株再生［8］.

本試驗(yàn)表明，冷凍保護(hù)劑處理和降溫程序處理在西洋參懸浮細(xì)胞的超低溫保存中起著關(guān)鍵的作用。西洋參懸浮細(xì)胞的超低溫保存中較好的冷凍保護(hù)劑組合是10%DMSO＋8%葡萄糖，較好的冷凍降溫程序是4℃（60min）→0℃（30min）→－20℃（2h）→－70℃（30min）→LN（液氮）。文獻(xiàn)［9］提出，超低溫保存材料在化凍時，再次結(jié)冰的危險溫度區(qū)大約是－5～10℃，因此化凍一般在30～40℃溫水浴中進(jìn)行，借助迅速的化凍速度通過此溫區(qū)，避免細(xì)胞內(nèi)次生結(jié)冰對細(xì)胞的破壞。實(shí)驗(yàn)證明，本實(shí)驗(yàn)對保存材料直接采用37℃水浴化凍是可行的。

目前，國內(nèi)外關(guān)于西洋參超低溫保存的研究較少，僅有張連學(xué)等［10］對西洋參花粉超低溫保存的研究報道。超低溫保存是一個非常復(fù)雜的過程，不同植物和同一植物不同類型的材料，其超低溫保存的難易可能有不同，因此一定要根據(jù)植物材料不同的特性，對影響超低溫保存的因素進(jìn)行研究。

本文對西洋參懸浮細(xì)胞的超低溫保存做了初步的探索性研究，僅是從形態(tài)學(xué)方面對生成的愈傷組織進(jìn)行了觀察，結(jié)果表明：西洋參懸浮細(xì)胞經(jīng)過一定時間的預(yù)培養(yǎng)，然后經(jīng)過合適的冷凍保護(hù)劑處理和冷凍降溫程序處理，西洋參懸浮細(xì)胞可以生長為愈傷組織，證明了西洋參懸浮細(xì)胞的超低溫保存是可行的。這就為西洋參懸浮細(xì)胞的保存提供了一條新途徑，從而解決了長期繼代保存的繁瑣性，減輕了工作量。但是種質(zhì)保存的根本目的是為了保持植物遺傳基因的穩(wěn)定及所控制的遺傳性狀不發(fā)生變化，這就要從細(xì)胞學(xué)和生理、生化方面對其進(jìn)行測定。細(xì)胞學(xué)主要鑒定染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)的變化；生理、生化方面主要采用同工酶譜分析和RFLP、RAPD、AFLP等分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行鑒定。另外，選擇的凍存材料及其所處的生長狀態(tài)，其它的冷凍保護(hù)劑組合和化凍方式以及在液氮中的凍存時間都是西洋參懸浮細(xì)胞超低溫保存的影響因素，因此對西洋參懸浮細(xì)胞的超低溫保存還需做更深入的研究。

［1］閆靜輝，張小兵，李亞璞，等，西洋參細(xì)胞培養(yǎng)的研究進(jìn)展［J］.河北省科學(xué)院學(xué)報，2006，23（2）：79－83.

［2］Matsumoto T，Mochida K，Itamura H，et al.Cryopreservation of persimmon（Diospyros kaki Thunb.）by vitrification of dormant shoot tips.Plant Cell Rep，2001，20：398－399.

［3］Sakai A，Kobayashi S，Qiyama I.Cryopreservation of nucellar cells of navel orange（Citrus sinensis Osb.var.brasiliensis Tanaka）by vitrification.Plant Cell Rep，1990，9（1）：30－33.

［4］徐剛標(biāo)，易文，李美娥，等.銀杏愈傷組織超低溫保存的研究［J］.林業(yè)科學(xué)，2001，37（3）：30－34.

［5］郭燕霞，劉玉軍.長鞭紅景天懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的玻璃化法超低溫保存研究［J］.西北植物學(xué)報，2006，26（8）：1605－1611.

［6］鄭光植，何靜波，王世林.三分三愈傷組織及其懸浮細(xì)胞的冰凍貯藏［J］.植物學(xué)報，1983，25（6）：513－517.

［7］羅士韋，唐惕.植物組織和細(xì)胞的超低溫保藏及其種質(zhì)庫建立的研究現(xiàn)狀［J］.細(xì)胞生物學(xué)雜志，1983，5（1）：1－7.

［8］鄧旭，雷新濤，成明昊.超低溫保存果樹種質(zhì)資源研究進(jìn)展［J］.熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，26（4）：50－54.

［9］陳品良.植物組織培養(yǎng)物的超低溫保存［J］.武漢植物學(xué)研究，1989，7（4）：390－398.

［10］張連學(xué)，常維春，魏云潔，等.人參、西洋參花藥超低溫保存對花粉存活的影響［J］.植物學(xué)通報，1993，10（2）：58－59.

The study on cryopreservation technique for Panax quinquefolium

LI Yapu，ZHANG Xiao－bing，YAN Jing－h(huán)ui

（InstituteofBiology，HebeiAcademyofSciences，ShijiazhuangHebei050081，China）

The cryopreservation for suspension cells of panax quinquefolium is studied.The result shows that it is probable for the cryopreservation for suspension cells of panax quinquefolium.First，they are precultured for 2 days in MS with 8%Sucrose，and cryoprotectants processing with 10% DMSO and 8%Glucose，and are freezed with 4℃（60min）、0℃（30min）、－20℃（2h）、－70℃（30min），they were immersed immediately into liquid nitrogen directly at last.They can regenerate calli showing vigorous growth.

Panax quinquefolium；Suspension cells；Cryopreservatio

Q418

：A

1001－9383（2011）04－0032－04

2011－05－25

李亞璞（1980－），女，助理研究員，研究方向：細(xì)胞工程.

閆靜輝