馬玉珍, 任 宇, 周雪原 , 劉東軍, 旭日干

(1. 內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院, 呼和浩特 010017; 2. 內(nèi)蒙古大學(xué) 哺乳動(dòng)物繁殖生物學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 呼和浩特 010017)

體細(xì)胞核移植生產(chǎn)綿羊轉(zhuǎn)hALR基因囊胚

馬玉珍1,2,*, 任 宇2, 周雪原2, 劉東軍2, 旭日干2

(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院,呼和浩特010017; 2.內(nèi)蒙古大學(xué) 哺乳動(dòng)物繁殖生物學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,呼和浩特010017)

擴(kuò)增人肝細(xì)胞再生增強(qiáng)因子(human augmenter of liver regeneration,ALR)基因, 利用質(zhì)粒pIRES2-EGFP構(gòu)建新霉素(Neo)、增強(qiáng)綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescence protein, EGFP)雙標(biāo)記基因且EGFP和ALR基因?yàn)殡p順?lè)醋拥恼婧吮磉_(dá)載體。LipofectAMINETM介導(dǎo)其轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的綿羊胎兒成纖維細(xì)胞(sheep fetal fibroblast cells, sFFCs); 經(jīng)G418篩選轉(zhuǎn)基因細(xì)胞; 激光共聚焦顯微鏡挑選綠色熒光單克隆細(xì)胞。PCR、RT-PCR和免疫組織化學(xué)方法進(jìn)一步檢測(cè)ALR基因及其表達(dá); 穩(wěn)定表達(dá)外源基因的sFFCs作供體, 移入去核的綿羊卵母細(xì)胞中, 進(jìn)行體細(xì)胞核移植。通過(guò)激光共聚焦顯微鏡和ALR抗體檢測(cè)EGFP、ALR基因在胚胎水平上的表達(dá)，其結(jié)果表明：由IRES連接的EGFP和ALR基因可在綿羊胎兒成纖維細(xì)胞內(nèi)同時(shí)表達(dá)，由此細(xì)胞核移植產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因胚胎在發(fā)育的各階段均可見(jiàn)綠色熒光; 囊胚中所有細(xì)胞表達(dá)EGFP基因; 發(fā)綠色熒光的胚胎中ALR基因同時(shí)存在。因此，由IRES連接標(biāo)記基因和目的基因, 以標(biāo)記基因指示目的基因的表達(dá), 可簡(jiǎn)化檢測(cè)目的基因的繁瑣手段; 用篩選的轉(zhuǎn)基因早期胚胎進(jìn)行移植, 可提高制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的效率。

綿羊; 轉(zhuǎn)基因; 體細(xì)胞; 核移植

1997年 Wilmut et al (1997)利用核移植技術(shù),成功的克隆了綿羊(Ovis aries)Dolly, 促進(jìn)了體細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移和克隆技術(shù)的結(jié)合, 利用這一技術(shù)1997年英國(guó)的PPL Therapeutics公司和羅斯林研究所的科學(xué)家率先培育出表達(dá)人凝血因子Ⅸ(FⅨ)的轉(zhuǎn)基因克隆綿羊(Schnieke et al, 1997), 但是用該方法研制的轉(zhuǎn)基因綿羊具有Neo抗性基因存在和表達(dá), 以及目的基因FⅨ缺失或不表達(dá)等問(wèn)題。鑒于由脊髓灰質(zhì)炎病毒內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)IRES(Internal ribosome entry site)連接的兩個(gè)不同的基因可以共同轉(zhuǎn)錄、各自翻譯。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了熒光蛋白、新霉素基因雙標(biāo)記選擇載體, 并且利用IRES將增強(qiáng)綠色熒光蛋白基因(Enhanced green fluoresceng protein, EGFP)與目的基因人肝細(xì)胞再生增強(qiáng)因子hALR(human Augmenter of liver regeneration,ALR)連接, 構(gòu)建成EGFP、ALR雙順?lè)醋诱婧吮磉_(dá)載體;探討EGFP和ALR基因在細(xì)胞水平上共表達(dá)的概率和可行性，并且將轉(zhuǎn)基因細(xì)胞進(jìn)行核移植, 實(shí)現(xiàn)在胚胎水平上通過(guò)綠色熒光篩選轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性胚胎的目的。Kato et al (1999 )研究表明, 用表達(dá)EGFP的小鼠胚胎移植產(chǎn)生的后代中, 77%為EGFP陽(yáng)性。因此，在細(xì)胞和胚胎水平上對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物進(jìn)行篩選,可減少移植的盲目性、節(jié)約代孕母畜、降低成本, 對(duì)于提高轉(zhuǎn)基因動(dòng)物效率具有非常重要的意義。

1材料與方法

1.1 材料

人血液來(lái)自?xún)?nèi)蒙古中心血站。質(zhì)粒pIRES2-EGFP購(gòu)自Clontech公司, 質(zhì)粒提取純化試劑盒購(gòu)自Promega公司。RNA提取試劑盒、SuperSciptTMfirst-strand synthesis system、細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM、G418、PBS粉、LipofectamineTM等購(gòu)自Gibco BRL公司。 限制性?xún)?nèi)切酶和T4連接酶購(gòu)自華美生物工程公司。鼠抗人ALR單克隆抗體IC3由解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射二所惠贈(zèng)。免疫組化試劑盒購(gòu)自邁新生物技術(shù)公司。

1.2 方法

1.2.1 pIRES2-EGFP/ALR雙順?lè)醋诱婧吮磉_(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)ALR基因組序列設(shè)計(jì)引物(P1: 5′-AGAGACGTGGATGCGGACG-3′/P2: 5′-GACTGGCTGTGATGCACTTTAA-3′ ), 預(yù)期產(chǎn)物為1 786 bp。 利用淋巴細(xì)胞分離液梯度離心分離人血液白細(xì)胞, 提取總DNA為模板, PCR擴(kuò)增ALR基因。反應(yīng)體系(1×反應(yīng)緩沖液、1 mmol/L dNTP、0.5 μmol/L上下游引物、1.5 mmol/L MgCl2、1 U Taq酶、100 ng DNA模板)總體積為25 μL。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 min后進(jìn)入循環(huán), 94 ℃ 30 s, 56 ℃ 40 s, 72 ℃ 2 min, 30個(gè)循環(huán), 反應(yīng)結(jié)束后72 ℃延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析。用膠回收試劑盒回收目的片斷, 連接于T載體, DNA測(cè)序確定目的基因ALR的序列, 測(cè)序正確的質(zhì)粒經(jīng)SalI 和EcoRI酶切回收ALR片段, 定向連入由相同酶切的pIRES2-EGFP質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)中, PCR和酶切檢測(cè)載體構(gòu)建是否正確。AflⅡ酶切使質(zhì)粒pAIE線(xiàn)性化, 試劑盒純化回收線(xiàn)性化的質(zhì)粒, 溶于滅菌超純水中, 用于轉(zhuǎn)基因。

1.2.2 綿羊胎兒成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)基因及陽(yáng)性克隆篩選

取冷凍保存第3代根據(jù)性別基因判斷為雌性的綿羊胎兒成纖維細(xì)胞(Sheep fetal fibroblast cells, sFFCs), 復(fù)溫培養(yǎng)。LipofectamineTM用于把pIRES2-EGFP/ALR轉(zhuǎn)入sFFCs, 轉(zhuǎn)基因步驟參見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。為了獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染子, 轉(zhuǎn)染后的sFFCs在含800 μg/mLG418的DMEM培養(yǎng)液持續(xù)篩選14 d?？剐钥寺⌒纬? 熒光顯微鏡下觀察, 大部分克隆表達(dá)綠色熒光; 挑選3個(gè)綠色熒光克隆擴(kuò)大培養(yǎng); 一部分細(xì)胞用于轉(zhuǎn)基因檢測(cè)；一部分細(xì)胞經(jīng)0.5% FCS的DMEM饑餓培養(yǎng)3～5 d, 用于核移植。

1.2.3 單克隆細(xì)胞中ALR基因的PCR檢測(cè) 各組取約2～3×103細(xì)胞離心收集, 置于20 μL細(xì)胞裂解液中, 37 ℃消化3 h, 離心, 取5 μL上清液進(jìn)行PCR反應(yīng), 反應(yīng)體系中加入ALR基因引物, 反應(yīng)條件同上, 以未轉(zhuǎn)基因的sFFCs為陰性對(duì)照。

1.2.4 單克隆細(xì)胞中ALR基因的RT-PCR檢測(cè) 根據(jù)ALR基因的cDNA序列設(shè)計(jì)引物(P3: 5′-CGCCGACCTCCGATTC-3′/P4: 5′-TGAGTGCCCTG CCCCTA-3′), 預(yù)期產(chǎn)物為522 bp。 約4×107個(gè)細(xì)胞用于提取RNA, 提取方法和cDNA第一鏈的合成按試劑盒說(shuō)明操作。取2 μL cDNA為模板進(jìn)行ALRcDNA 擴(kuò)增，產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.5 單克隆細(xì)胞中ALR基因的免疫組織化學(xué)檢測(cè)

取單克隆細(xì)胞用胰蛋白酶消化后, 以1×105/孔接種于蓋玻片上進(jìn)行細(xì)胞爬片, 38 ℃, 5% CO2培養(yǎng)48 h后, SP法進(jìn)行免疫組化染色, 一抗為鼠抗人ALR單克隆抗體IC3, 相差顯微鏡下觀察、照相。

1.2.6 卵母細(xì)胞的體外成熟、克隆程序、重構(gòu)胚的融合和激活及克隆胚胎的體外培養(yǎng)

將綿羊卵巢浸入盛有采卵液的玻璃培養(yǎng)皿中,用無(wú)菌手術(shù)刀片釋放出卵泡液和卵丘?卵母細(xì)胞復(fù)合體(cumulus oocyte complexes, COCs)。顯微鏡下挑選形態(tài)良好、卵丘細(xì)胞完整、包裹致密、至少帶有3層卵丘細(xì)胞的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體, 在38.5℃、5% CO2和飽和濕度的條件下成熟培養(yǎng)18 h后觀察挑選排出第一極體且胞質(zhì)勻稱(chēng)形態(tài)良好的去卵丘細(xì)胞的卵母細(xì)胞用于細(xì)胞核移植。將卵母細(xì)胞?核供體細(xì)胞復(fù)合體用成熟液洗3次, 在38.5 ℃、5% CO2和飽和濕度條件下恢復(fù)培養(yǎng)0.5～1 h后進(jìn)行電融合操作。以190 V/mm, 兩次直流脈沖、20 μs/次, 間隔100 ms電脈沖的融合條件進(jìn)行融合。融合后的重構(gòu)胚放入發(fā)育液中, 于5% CO2培養(yǎng)箱中恢復(fù)培養(yǎng)30 min后檢查融合情況。將已經(jīng)融合的重構(gòu)胚置于含5 μmol/L IA23187的SOFaa中激活5 min, 再將其置于含2 mmol/L 6-DMAP的SOFaa培養(yǎng)液中, 在38.5 ℃、5% CO2和飽和濕度條件下培養(yǎng)4 h后用發(fā)育液洗重構(gòu)胚5次后將其放入含500 μL發(fā)育液的四孔板中, 在38.5 ℃、5% CO2和飽和濕度條件下培養(yǎng)48 h后檢查卵裂率, 挑取卵裂球均勻, 形態(tài)正常的胚胎用于胚胎移植。部分胚胎繼續(xù)培養(yǎng), 6 d之后觀察囊胚發(fā)育情況(Kang et al, 2009)。

1.2.7 激光共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)基因克隆胚胎及ALR蛋白免疫組化檢測(cè)

分別于24、48和96 h統(tǒng)計(jì)卵裂率、8-細(xì)胞期胚胎和囊胚發(fā)育率，同時(shí)在激光共聚焦顯微鏡下觀察胚胎中綠色熒光的表達(dá)，挑選熒光胚胎和克隆胚胎經(jīng)過(guò)固定后, 用Hoechest33342和10 μg/mL PI進(jìn)行核染色并于激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞數(shù)。免疫組化檢測(cè)熒光克隆胚中ALR蛋白的表達(dá), 將胚胎置于0.25%鏈霉蛋白酶中去除透明帶, 其余步驟同轉(zhuǎn)基因sFFCs免疫組化檢測(cè)方法。

2 結(jié) 果

2.1 pIRES-EGFP/ALR表達(dá)載體的構(gòu)建

PCR擴(kuò)增出1.7 kb的DNA條帶, 序列測(cè)定表明，與hALR已知序列符合率達(dá)99.6%以上, 含3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子且外顯子及剪切位點(diǎn)沒(méi)有堿基改變。圖1所示為PCR和酶切檢測(cè)空載體pIRES2-EGFP和構(gòu)建的真核表達(dá)載體pIRES-EGFP/ALR, 結(jié)果表明，ALR基因定向插入pIRES2-EGFP載體中。

圖1 pIRES-EGFP/ALR酶切檢測(cè)及載體構(gòu)建Fig.1 Restriction endonuclease digestion and the building of expression vector pIRES2-EGFP/ALR

2.2 pIRES-EGFP/ALR轉(zhuǎn)染綿羊胎兒成纖維細(xì)胞及陽(yáng)性克隆的篩選

脂質(zhì)體LipofectamineTM介導(dǎo) pIRES-EGFP/ALR載體轉(zhuǎn)染sFFCs 8 h 后, 在激光共聚焦顯微鏡下可見(jiàn)熒光細(xì)胞, 細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)彌散的微弱熒光，隨后熒光細(xì)胞數(shù)目增多, 熒光明顯增強(qiáng)。在轉(zhuǎn)染48 h 時(shí)熒光細(xì)胞數(shù)目最多, 熒光最亮, 均勻分布于細(xì)胞胞漿和細(xì)胞核中, 核仁區(qū)無(wú)(圖2A)。 經(jīng)含800 μg/mL G418的DMEM培養(yǎng)液篩選2 d后大約60%的細(xì)胞死亡， 繼續(xù)培養(yǎng)12 d, 形成多個(gè)單克隆細(xì)胞系，計(jì)數(shù)100個(gè)克隆, 其中67%克隆細(xì)胞發(fā)綠色熒光, 33%的克隆經(jīng)G418篩選, 雖然能夠存活,但是細(xì)胞沒(méi)有綠色熒光(圖2)。

2.3 PCR鑒定單克隆細(xì)胞中ALR基因的存在

從細(xì)胞系提取DNA進(jìn)行PCR, 3個(gè)綠色熒光細(xì)胞單克隆全部顯示1.7 kbALR條帶, 與陽(yáng)性對(duì)照PCR結(jié)果相同, 未轉(zhuǎn)基因的sFFCs陰性細(xì)胞沒(méi)有特異性條帶, 初步證明ALR基因已整合到綿羊sFFCs中(圖3)。

2.4 RT-PCR鑒定單克隆細(xì)胞中ALR基因的轉(zhuǎn)錄

圖2 激光共聚焦顯微鏡下觀察pALR-IRES-EGFP轉(zhuǎn)染的綿羊胎兒成纖維細(xì)胞(A×400, B×100)Fig. 2 sFFCs transfected with pALR-IRES-EGFP were observed under confocal laser microscope (A×400, B×100)

圖3 PCR檢測(cè)ALRFig.3 PCR results of ALR

3個(gè)熒光細(xì)胞單克隆進(jìn)一步進(jìn)行RT-PCR, 電泳檢測(cè)可見(jiàn)522 bpALRcDNA條帶, 未轉(zhuǎn)基因的SFFC沒(méi)有特異性條帶(圖4)。因?yàn)橹亟M質(zhì)粒中通過(guò)熒光觀察已知EGFP基因表達(dá), 說(shuō)明EGFP和ALR基因已整合入SFFC基因組中并被轉(zhuǎn)錄, 且基因重組沒(méi)有造成EGFP和ALR基因的缺失斷裂或突變。

2.5 免疫組化鑒定ALR蛋白的表達(dá)

對(duì)熒光單克隆細(xì)胞進(jìn)行ALR蛋白檢測(cè), 相差顯微鏡下sFFCs中有棕色顆粒分布于核內(nèi)和胞漿(圖5A), 對(duì)照組細(xì)胞未著色(圖5B)。以上結(jié)果表明,在EGFP表達(dá)的陽(yáng)性克隆中同時(shí)有ALR蛋白的形成, 體現(xiàn)了IRES的功能特征, 即由其連接的兩個(gè)不同基因表達(dá)高度相關(guān)。實(shí)驗(yàn)中共得到14枚囊胚, 5枚胚胎進(jìn)行ALR基因免疫組化檢測(cè), 均有ALR蛋白表達(dá), 說(shuō)明在胚胎水平上ALR基因表達(dá)。

2.6 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞克隆胚胎的體外檢測(cè)

圖4 RT-PCR檢測(cè)ALR mRNAFig.4 RT-PCR results of ALR mRNA

綿羊卵子-卵丘復(fù)合體經(jīng)22 h培養(yǎng)后, 發(fā)育狀況良好, 卵丘細(xì)胞均勻擴(kuò)散。去卵丘細(xì)胞后, 74.4%(160/215)的卵母細(xì)胞在相差顯微鏡下可見(jiàn)第一極體，挑取形態(tài)較好的146枚用于核移植。融合處理卵141枚, 融合成功卵數(shù)109枚, 融合率77.3%。48 h后75枚重構(gòu)胚卵裂，卵裂率為68.8%, 8-細(xì)胞62枚, 8-細(xì)胞率為82.7%。 52枚具有熒光表達(dá), 其中14枚發(fā)育至囊胚期, 囊胚發(fā)育率為26.9%。在激光共聚焦顯微鏡下觀察, 供體細(xì)胞融合后的克隆胚胎在體外發(fā)育的各個(gè)時(shí)期都能表達(dá)EGFP基因, 在桑椹胚和囊胚的每個(gè)細(xì)胞都能表達(dá)綠色熒光, 說(shuō)明克隆胚胎是純合的, 不是嵌合體。圖6A、B所示為發(fā)綠色熒光的轉(zhuǎn)基因胚胎 (其中A、B為同一胚胎), 圖6C顯示8-細(xì)胞綠色熒光胚胎經(jīng)ALR抗體免疫組化染色細(xì)胞胞漿及核內(nèi)可見(jiàn)棕色顆粒。經(jīng)RT-PCR檢測(cè)ALR基因有表達(dá), 說(shuō)明在胚胎水平上EGFP和ALR基因同時(shí)表達(dá)。以正常未做轉(zhuǎn)基因的成纖維細(xì)胞的克隆做對(duì)照, 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和正常細(xì)胞兩者所得到的克隆胚胎在發(fā)育各個(gè)時(shí)期并無(wú)顯著差異, 且對(duì)照組重構(gòu)胚在發(fā)育各個(gè)時(shí)期均無(wú)綠色熒光表達(dá)。兩組間在細(xì)胞數(shù)上沒(méi)有顯著性差異(圖6D、E)。

圖5 相差顯微鏡下觀察ALR蛋白在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中的表達(dá)(×400)Fig.5 The expression of ALR protein in the SFFcells were observed by a contranst phase microscope (×400)

圖6 轉(zhuǎn)基因胚胎檢測(cè)Fig.6 Detection of cloned embryos

3 討 論

肝炎、肝硬化在我國(guó)發(fā)病率高、危害嚴(yán)重, 尤其是急性肝功能衰竭, 有起病急、預(yù)后差、病死率高的特點(diǎn), 其預(yù)后主要取決于病損肝細(xì)胞的壞死程度和再生能力。利用肝細(xì)胞再生的特性, 緩解病毒對(duì)肝的損害是肝再生研究的熱點(diǎn)之一。研究發(fā)現(xiàn),肝細(xì)胞再生增強(qiáng)因子(ALR)能有效的促進(jìn)肝細(xì)胞的再生。肝細(xì)胞表面存在ALR受體, 與ALR特異性結(jié)合, 促進(jìn)肝細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期, 完成細(xì)胞的增殖。目前重組的ALR已經(jīng)應(yīng)用于臨床治療肝損傷相關(guān)疾病, 并取得了一定的治療效果, 但是由原核編碼的蛋白質(zhì)不能進(jìn)行翻譯后修飾, 影響蛋白的作用效果.因此,用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物真核細(xì)胞表達(dá)hALR, 能夠促進(jìn)蛋白翻譯后的修飾, 在結(jié)構(gòu)和生物活性上與天然的蛋白分子相同, 從而在臨床中提高治療效果。

在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備過(guò)程中, 轉(zhuǎn)基因效率低、成本高仍然是限制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物發(fā)展的瓶頸。用綠色熒光蛋白作為分子標(biāo)記, 可以顯著提高轉(zhuǎn)基因效率。以EGFP基因作為標(biāo)記基因, 用顯微原核注射法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因小鼠中, 囊胚中全部細(xì)胞表達(dá)綠色熒光為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性胚胎, 部分細(xì)胞表達(dá)熒光是嵌合體胚胎, 其中轉(zhuǎn)基因囊胚, 占21%, 嵌合胚, 占79% (Wang et al, 2000)。許多研究結(jié)果均表明, 通過(guò)顯微注射產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因囊胚陽(yáng)性率平均為20%～30%。Takada et al (1997)將顯微注射產(chǎn)生的陽(yáng)性胚胎移植到小鼠體內(nèi), 產(chǎn)生的小鼠中, 只有70%為轉(zhuǎn)基因小鼠。隨著體細(xì)胞核移植技術(shù)的建立及在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的應(yīng)用, 使轉(zhuǎn)基因的篩選提前到細(xì)胞水平, 用轉(zhuǎn)基因細(xì)胞進(jìn)行核移植使轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)效率得到進(jìn)一步提高, Keiser et al (2001)利用體細(xì)胞核移植產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因熒光小鼠中, 陽(yáng)性率達(dá)92%。因此，用綠色熒光蛋白作為標(biāo)記基因進(jìn)行轉(zhuǎn)基因胚胎的篩選, 移植后可大大提高制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的效率,但是在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)仍然存在著標(biāo)記基因與目的基因不能同時(shí)表達(dá)的現(xiàn)象。 Trouet et al (1997) 利用內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn) (Internal ribosome entry site, IRES) 連接標(biāo)記基因和目的基因, 選擇32枚熒光克隆和24枚非熒光克隆進(jìn)行IRES上下游基因相關(guān)性分析, 結(jié)果表明, 由IRES連接的上下游基因同時(shí)表達(dá)。

IRES是從細(xì)小RNA病毒中發(fā)現(xiàn)的, 該病毒以新的5′-帽子非依賴(lài)的形式進(jìn)行翻譯, 其核糖體結(jié)合位點(diǎn)位于細(xì)小病毒RNA5′非編碼區(qū)內(nèi)部的一個(gè)區(qū)域 (Jackson et al, 1990)。這一區(qū)域包括450個(gè)核苷酸長(zhǎng)度, 核糖體與其3′端結(jié)合后掃描RNA到達(dá)翻譯起始點(diǎn)。由它連接的開(kāi)放閱讀框架可以同時(shí)翻譯, IRES上游閱讀框架的翻譯采用常規(guī)的帽子結(jié)構(gòu)掃描翻譯起始模式。下游閱讀框架的翻譯由IRES引導(dǎo)翻譯, IRES元件能夠啟動(dòng)真核細(xì)胞的多順?lè)醋愚D(zhuǎn)錄單位的兩個(gè)或多個(gè)蛋白同時(shí)分別表達(dá), 而且蛋白之間互不影響彼此功能(Venkatesan & Dasgupta, 2001; Wang et al, 2000 )。

本實(shí)驗(yàn)利用IRES連接EGFP、ALR基因, 實(shí)現(xiàn)EGFP、ALR基因同時(shí)表達(dá), 且以Neo、EGFP作為雙標(biāo)記基因進(jìn)行雙重篩選。轉(zhuǎn)基因細(xì)胞首先經(jīng)新霉素抗性基因篩選, 得到的單克隆細(xì)胞中67%的克隆表達(dá)綠色熒光, 33%的克隆不表達(dá)綠色熒光, 可能是旁觀效應(yīng)造成假陽(yáng)性細(xì)胞的存活。再經(jīng)過(guò)熒光顯微鏡挑選表達(dá)EGFP基因的熒光單克隆細(xì)胞, 經(jīng)過(guò)RT-PCR和免疫組化實(shí)驗(yàn)證明EGFP、ALR基因同時(shí)表達(dá)。進(jìn)一步利用熒光細(xì)胞進(jìn)行綿羊體細(xì)胞核移植, 8-細(xì)胞胚胎發(fā)育率為82.7%, 其中表達(dá)綠色熒光的占83.9%, 隨著克隆胚胎體外發(fā)育時(shí)間的延長(zhǎng), 綠色熒光蛋白在克隆胚胎中的表達(dá)也逐漸增強(qiáng), 到桑椹胚時(shí), 表達(dá)量達(dá)到最高, 熒光最亮, 這可能與綠色熒光蛋白的逐漸積累有關(guān)。實(shí)驗(yàn)中共得到14枚囊胚, 在激光共聚焦顯微鏡下觀察, 囊胚中每個(gè)細(xì)胞表達(dá)綠色熒光。 其中3枚胚胎利用RT-PCR檢測(cè)、5枚胚胎進(jìn)行ALR基因免疫組化檢測(cè), 均有ALR蛋白表達(dá), 說(shuō)明在胚胎水平上EGFP、ALR基因同時(shí)表達(dá)。綠色熒光蛋白作為一種可見(jiàn)的基因轉(zhuǎn)移標(biāo)記已廣泛用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究與生產(chǎn)中, 但對(duì)于它是否會(huì)影響到胚胎的發(fā)育研究者們觀點(diǎn)不一, Roh et al (2000)研究表明，綠色熒光蛋白不會(huì)影響到轉(zhuǎn)基因胚胎的發(fā)育, Takada（1997）的實(shí)驗(yàn)還表明，不但GFP本身對(duì)胚的發(fā)育無(wú)害, 同時(shí)每天用470～490 nm光檢查對(duì)胚的發(fā)育亦沒(méi)有影響；而Arat et al (2002)的研究結(jié)果則相反(Zhang et al, 2005; Adams & Briegel, 2005; Denning et al, 2001)。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示綠色熒光蛋白對(duì)轉(zhuǎn)基因克隆胚胎的早期發(fā)育沒(méi)有明顯影響, 在胚胎發(fā)育速度和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)上均沒(méi)有顯著性差異。因此, 我們認(rèn)為利用體細(xì)胞核移植是一條切實(shí)可行的制備轉(zhuǎn)基因大家畜的途徑。

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Production of transgenic embryos through nuclear transfer using ovine fetal fibroblasts transferred with foreign genes

MA Yu-Zhen1,2,*, REN Yu2, ZHOU Xue-Yuan2, LIU Dong-Jun2, XU Ri-Gan2

(1. Inner Mongolia Hospital, Hohhot, 010017, China, 2. Key Laboratory of Ministry of Education of China for Mammal Reproduction Biology and Biotechnology of Inner Mongolia University, Huhhot 010021, China)

HumanALRgene sequence was amplified by PCR from human total DNA and inserted into pIRES2-EGFP vector. The bicistronic eukaryotic expression vector, pIRES-EGFP/ALR, expressing EGFP, NeorandALRgenes was constructed. Sheep fetal fibroblast cells (sEFCs) were transfected with pIRES-EGFP/ALRby the induction of lipofectAMINETM. The positive cell clones were selected with medium containing G418 (800 μg/mL). The fluorescence of transgenic cells was examined with a confocal laser scanning microscope. The expression ofALRgene was tested by PCR, RT-PCR and immuno-histochemical staining. The transgenic cells were used as donors for nuclear transfer to enucleated ovine oocytes. Transgenic embryos were tested by confocal laser scanning microscope and immuno-histochemical staining. Results showed that the EGFP andALRgenes linked with IRES were coexpressed simultaneously in sFFCs; the blastocysts formed by nuclear transfer using tranfected donor cells are all transgenic blastocysts. EGFP,ALRand Neorgene were all expressed in the transgenic embryos. In conclusion that a method to construct the positive embryos before pre-implantation which stably expressALRgene by the indication of EGFP expression has been successfully established. The application of this method can simplify the procedure of testing the targets and contribute to the efficiency increasing of transgenic domestic animal production.

Sheep; Transgenic; Somatic cells; Nuclear transfer

Q813; S826.2; Q291

A

0254-5853-(2011)06-0617-07

10.3724/SP.J.1141.2011.06617

2011-07-11；接受日期：2011-10-08

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目“間隙連接蛋白在綿羊胚胎發(fā)育過(guò)程中的功能研究”資助（30660123）

?通訊作者(Corresponding author)，Tel/Fax: +86-0471-6619236; E-mail: mayz@imnu.edu.cn