余果宇, 向 陽(yáng), 張紅蕓, 江 萍, 李文輝, 張 云, 張 勇,*

(1. 中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所 動(dòng)物模型與人類疾病機(jī)理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 云南 昆明 650223; 2. 昆明醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)教研室, 云南昆明 650500; 3. 中國(guó)科學(xué)院研究生院, 北京 100049; 4. 昆明醫(yī)學(xué)院 第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科, 云南 昆明 650032)

三葉因子Bm-TFF2突變體在原核體系中的表達(dá)及促細(xì)胞遷移活性

余果宇1,2,#, 向 陽(yáng)1,3,#, 張紅蕓4, 江 萍1, 李文輝1, 張 云1, 張 勇1,*

(1. 中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所 動(dòng)物模型與人類疾病機(jī)理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 云南 昆明 650223; 2. 昆明醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)教研室, 云南昆明 650500; 3. 中國(guó)科學(xué)院研究生院, 北京 100049; 4. 昆明醫(yī)學(xué)院 第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科, 云南 昆明 650032)

大蹼鈴蟾三葉因子Bm-TFF2具有較人TFF2更強(qiáng)的促細(xì)胞遷移和抗凋亡活性。該研究利用RT-PCR方法擴(kuò)增得到野生型Bm-TFF2的基因, 然后分別構(gòu)建N端、C端和分子中兩個(gè)精氨酸突變的突變體, 最后連接表達(dá)載體產(chǎn)生pET32a(+)／Bm-TFF2突變型重組質(zhì)粒, 轉(zhuǎn)入大腸桿菌中, 經(jīng)37 °C培養(yǎng), IPTG誘導(dǎo), 其融合蛋白主要存在于包涵體中, 用組氨酸標(biāo)簽的親合柱純化溶解后的包涵體上清, 進(jìn)一步用 RP-HPLC純化得到硫氧還蛋白(TRX)/Bm-TFF2突變型融合蛋白。通過(guò)SDS-PAGE和Western blotting檢測(cè)分析其純度和特異性。最終, 從1L培養(yǎng)基中得到20 mg純度為95%的三種重組突變型融合蛋白。三種突變型重組蛋白都具有劑量依賴性的促細(xì)胞遷移活性, 并且其活性無(wú)顯著差異。該研究為進(jìn)一步研究Bm-TFF2結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系以及揭示其作用的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

Bm-TFF2; 突變體; 表達(dá); 純化; 細(xì)胞遷移

三葉因子(trefoil factor, TFFs)是一類含一個(gè)或幾個(gè)三葉因子結(jié)構(gòu)域的分泌蛋白, 該結(jié)構(gòu)域是一段 38或39個(gè)氨基酸的多肽, 其中的六個(gè)半胱氨基以1-5, 2-4, 3-6配對(duì)的構(gòu)型方式生成三對(duì)二硫鍵, 從而形成典型的三葉狀結(jié)構(gòu), 此結(jié)構(gòu)賦予 TFFs家族蛋白耐酸、堿和蛋白酶水解的性質(zhì), 同時(shí)也是其行使功能所必需的。人TFFs包括含一個(gè)三葉因子結(jié)構(gòu)域、 與乳腺癌相關(guān)的多肽(TFF1或 PS2)和小腸三葉因子(TFF3或ITF)以及含兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的解痙攣多肽(SP或TFF2)。TFFs在黏膜防御、修復(fù)和再生等過(guò)程中通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移和對(duì)抗細(xì)胞凋亡等過(guò)程發(fā)揮重要作用(Baus-Loncar et al, 2005; Dignass et al, 1994; Oertel et al, 2001; Taupin et al, 2000)。此外, TFFs在多種腫瘤中表達(dá)異常的事實(shí)提示, 它們廣泛參與腫瘤細(xì)胞增殖、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過(guò)程(Cook et al, 1999; Fox et al, 2007; Lalani et al, 1999; Siu et al, 2004)。同時(shí), TFF2表達(dá)的增加還常常相關(guān)于腫瘤的發(fā)展以及不良預(yù)后(Dhar et al, 2003; Emami et al, 2004; Katoh, 2003)。Bm-TFF2是從大蹼鈴蟾皮膚分泌物中獲得的一種具有血小板激動(dòng)活性的兩棲類三葉因子(Zhang et al, 2005), 進(jìn)一步的研究又發(fā)現(xiàn)天然Bm-TFF2以濃度依賴的方式促進(jìn)人AGS、HT-29以及小鼠腸上皮細(xì)胞IEC-6的遷移, 并且ERK1/2活性的激活是其發(fā)揮促細(xì)胞遷移活性的關(guān)鍵。同時(shí), Bm-TFF2還具有對(duì)抗C2-丙烯酰胺引發(fā)的細(xì)胞凋亡作用, 從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖。這些結(jié)果提示, Bm-TFF2通過(guò)MAPK途徑促進(jìn)細(xì)胞遷移并抑制細(xì)胞凋亡是其發(fā)揮傷口修復(fù)功能的基礎(chǔ)(Chatterjee et al, 2010)。在進(jìn)一步對(duì)重組Bm-TFF2進(jìn)行結(jié)構(gòu)與功能研究時(shí), 我們發(fā)現(xiàn)全長(zhǎng)和單結(jié)構(gòu)域的 Bm-TFF2都具有促細(xì)胞遷移和傷口修復(fù)活性, 但抗細(xì)胞凋亡活性卻是全長(zhǎng)依賴的, 即 Bm-TFF2的兩個(gè)單結(jié)構(gòu)域剪切體都無(wú)抗細(xì)胞凋亡活性(Canas et al, 2009), 提示Bm-TFF2的不同活性需要不同的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。所以, 我們?cè)诒磉_(dá)了 Bm-TFF2全長(zhǎng)和單結(jié)構(gòu)域的基礎(chǔ)上, 利用基因工程的原理和技術(shù), 分別構(gòu)建和表達(dá)了 Bm-TFF2的三個(gè)突變體, 并進(jìn)而檢測(cè)和分析了它們的促細(xì)胞遷移活性, 這為更加深入地揭示 Bm-TFF2的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系以及分析可能的分子作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

大腸桿菌 DH5α、BL21(DE3)、表達(dá)載體pET-32a(+)購(gòu)于德國(guó) Novagen公司; 逆轉(zhuǎn)錄酶(RNAase H)、限制性內(nèi)切酶KpnI和EcoR I、PCR聚合酶、T4 DNA連接酶和克隆載體 pMD-19T simple、PrimeScript Reverse Transcriptase購(gòu)于大連寶生物公司; 動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒和膠回收試劑盒購(gòu)于北京天根生物科技公司; QuikChange? Site-Directed Mutagenesis Kit為STRATAGENE公司產(chǎn)品; 組氨酸選擇的鎳親合層析膠購(gòu)于Sigma; 蛋白定量試劑盒購(gòu)于Bio-Rad; 辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗兔和山羊抗鼠血清購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz生物科技公司; Bm-TFF2多克隆抗血清為實(shí)驗(yàn)室免疫兔所得; 三氟乙酸(TFA)、乙氰(ACN)為德國(guó)Merck公司產(chǎn)品; C4色譜柱為大連依利特分析儀器有限公司產(chǎn)品; ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒為德國(guó)Thermo scientific公司產(chǎn)品; AGS細(xì)胞系來(lái)自于美國(guó)的 American Type Culture Collection; Millicells為美國(guó)Millipore公司產(chǎn)品; 其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

表1 BM-TFF2突變體的引物序列Tab. 1 The primer sequences of BM-TFF2 mutants

1.2.1 pET-32a(+)/突變型Bm-TFF2重組質(zhì)粒的構(gòu)建取大蹼鈴蟾皮膚組織約20 mg, 按總RNA提取試劑盒說(shuō)明提取組織總 RNA(TRNA), 并用分光光度計(jì)和1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其純度和完整性。取一定量的總RNA, 用Oligo(dT)和PrimeScript Reverse Transcriptase逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR引物由上海生工生物工程公司合成, 各突變體的引物序列見(jiàn)表1。各突變體的正向引物序列都包括KpnI酶切位點(diǎn)(斜體)和對(duì)應(yīng)的N端5個(gè)氨基酸序列(黑體), 反向引物序列包括EcoR I酶切位點(diǎn)(斜體)、 終止子(下劃線)和相應(yīng)C端的5個(gè)氨基酸序列(黑體)。N端突變體(記為BNM)缺乏N端起始的4個(gè)氨基酸, C端突變體(記為BCM)缺乏C端的5個(gè)氨基酸。以Bm-TFF2的cDNA為模板, 按照95 °C預(yù)變性4 min, 94 °C變性30 s, 60 °C退火30 s, 72 °C延伸30 s, 進(jìn)行35個(gè)循環(huán), 最后72 °C延伸7 min獲得PCR產(chǎn)物, 產(chǎn)物通過(guò)TA克隆與pMD-19T simple克隆載體連接形成pMD-19T/Bm-TFF2突變型重組質(zhì)粒, 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 DH5α。次日, 挑出經(jīng)藍(lán)白斑篩選的白色克隆并用克隆載體的通用引物M13-47和RV-M行菌落PCR檢測(cè)。抽提陽(yáng)性克隆質(zhì)粒, 用KpnI/EcoR I雙酶切后再與相同酶切后的 pET-32a(+)連接形成pET-32a(+)/Bm-TFF2突變型重組質(zhì)粒, 轉(zhuǎn)化BL21(DE3)并用表達(dá)載體的通用引物 S.Tag和T7-Ter行菌落 PCR檢測(cè)生長(zhǎng)的克隆并將陽(yáng)性克隆測(cè)序。構(gòu)建精氨酸突變體的(記為BAM)正向引物序列：5'-tgctgttttatttcagcaatcgtcaatacaatttggtgctttaaacttaa a-3'; 反向引物序列：5'-tttaagtttaaagcaccaaattgtatttct ccttgctgaaataaaacagca-3'。按照 QuikChange?Site-Directed Mutagenesis Kit 進(jìn)行操作并測(cè)序確認(rèn)兩個(gè)精氨酸已經(jīng)突變?yōu)楫惲涟彼岷屠i氨酸。再以該突變質(zhì)粒為模板, 用BAM的引物擴(kuò)增, 同上方法操作即可得精氨酸突變的表達(dá)載體。

1.2.2 重組融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)與純化分別挑取測(cè)序正確的N端、C端突變以及第44和45位精氨酸各突變?yōu)楫惲涟彼岷屠i氨酸的單克隆于5 mL LB培養(yǎng)基, 37 °C, 140 r/min搖過(guò)夜。次日晨, 取過(guò)夜菌液1 mL接種到1 L含100 μg/mL氨芐青霉素的 LB培養(yǎng)瓶, 相同條件下, 搖菌液至 OD 600為0.6, 加異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度0.5 mmol/L, 37 °C誘導(dǎo)4 h。收集菌液, 8 000 g離心10 min獲得細(xì)胞沉淀。將沉淀懸浮于100 mL冰冷的含0.3 mol/L NaCl、10 mmol/L咪唑、pH8.0的50 mmol/L磷酸鹽溶液中, 冰浴中用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(JY92-2D, 寧波新芝生物科技有限公司)以350 W工作60個(gè)循環(huán)(工作6 s, 間歇10 s)。4 °C, 15 000g離心30 min, 棄上清, 收集包涵體部份并用Equilibration Buffer(含8 mol/L尿素, 100 mmol/L磷酸鹽溶液, pH:8.0)常溫溶解4 h, 16 000 r/min, 離心30 min, 取上清并用組氨酸選擇的鎳親合層析柱純化。10倍體積的Washing Buffer(含8 mol/L尿素, 100 mmol/L磷酸鹽溶液, pH:6.3)洗脫結(jié)合鎳柱的非特異性蛋白, 最后用Elution Buffer(含8 mol/L尿素, 100 mmol/L磷酸鹽溶液, pH:5.0)洗脫結(jié)合在鎳柱上的融合蛋白。收集洗脫液并用含6 mol/L尿素的生理磷酸鹽溶液于4 °C進(jìn)行梯度透析, 直至最后用無(wú)尿素的生理磷酸鹽溶液透析三次, 收集透析液超濾濃縮, 用膠濃度為12%的SDS-PAGE并行考馬斯亮藍(lán)染色分析重組融合蛋白的純化過(guò)程。RP-HPLC對(duì)超濾濃縮的蛋白液進(jìn)一步純化。操作如下：選用C4色譜柱(Zorbax 300 SB C4column, 4×300 mm), 將樣品分別上樣于預(yù)先用含 0.1%TFA的超純水平衡好的C 4柱, 待穿透峰流出后, 用含0.1%TFA的ACN進(jìn)行線性梯度洗脫。

1.2.3 重組融合蛋白的鑒定 收集280 nm對(duì)應(yīng)的最高洗脫峰, 抽干TFA和ACN后, 凍干和溶解樣品,蛋白定量試劑盒定量。各取等量的 TRX-BNM、TRX-BCM和TRX-BAM融合蛋白行SDS-PAGE (12%)。同時(shí), 遵從Western blotting的操作過(guò)程, 將SDS-PAGE膠上的蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜, 分別用稀釋3 000倍的抗Bm-TFF2(實(shí)驗(yàn)室免疫家兔制備所得)以及抗TRX抗體(Invitrogen, USA)4 °C反應(yīng)過(guò)夜,再用5 000倍稀釋的山羊抗兔和山羊抗鼠血清常溫下反應(yīng)1 h, 化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)重組融合蛋白的特異性。

1.2.4 突變型融合蛋白的促細(xì)胞遷移活性 用包括有10%胎牛血清(FCS)、100 U/mL青霉素、 100 mg/mL鏈霉素的DMEM和Ham’s F 12 (1:1)培養(yǎng)基于37 °C, 5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人胃癌上皮細(xì)胞系A(chǔ)GS。待細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好時(shí), 更換細(xì)胞培養(yǎng)液,即用無(wú)血清的DMEM和Ham’s F 12(1:1)饑餓細(xì)胞24 h, 再采用Boyden Chamber(Chemicon, 美國(guó))系統(tǒng)測(cè)定細(xì)胞遷移活性(Liu et al, 2008)。具體操作如下：膠原(10 μg/cm2)均勻包埋Millcells底部膜的上室面, 取饑餓的過(guò)夜細(xì)胞, 在每個(gè)上室里加入約1.0×105的 AGS, 下室中加入激動(dòng)劑, 包括 100 nmol/L或 200 nmol/L重組突變型融合蛋白、 10 nmol/L的生長(zhǎng)因子作為陽(yáng)性對(duì)照, 100 nmol/L或200 nmol/L重組的 TRX作為陰性對(duì)照, 37 °C、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。18 h后, 用槍頭和棉簽完全移走上室面沒(méi)有遷移的細(xì)胞, 再用含 2%無(wú)水乙醇, 0.1 mol/L硼酸(pH: 9.0)配制的0.025%的結(jié)晶紫染色液室溫下對(duì)細(xì)胞染色30 min, 10%的乙酸洗脫結(jié)合的結(jié)晶紫, 在 586 nm波長(zhǎng)下讀取各實(shí)驗(yàn)組的吸光度值, 并計(jì)算比較不同激動(dòng)劑的遷移率。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 pET-32a(+)/突變型Bm-TFF2表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

提取來(lái)源于大蹼鈴蟾皮膚組織的總 RNA, RT-PCR后分別用對(duì)應(yīng)的突變引物擴(kuò)增得到BAM、BNM和BCM約310 bp的目的片段(圖1 A), 并與pMD-19T載體連接后轉(zhuǎn)化DH5α。, 將雙酶切陽(yáng)性克隆質(zhì)粒所得的BAM、BNM和BCM基因片段分別連接表達(dá)載體 pET-32a(+)形成重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化BL21。選擇測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆, 并用KpnI和EcoR I同時(shí)酶切pET-32a(+)/BAM、BNM和BCM重組質(zhì)粒, 其檢測(cè)結(jié)果如圖1 B所示, 三種突變型重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后都在相對(duì)分子質(zhì)量為310 bp的位置出現(xiàn)條帶, 表明3個(gè)突變體分別連接到表達(dá)載體的相應(yīng)位置。

2.2 重組融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)和純化

圖1 以大蹼鈴蟾cDNA為模板擴(kuò)增所得的Bm-TFF2突變體的PCR產(chǎn)物Fig. 1 The identification of the Bm-TFF2 mutant recombinant plasmids by taking the cDNA of Bombina maxima as a template

圖2 重組Bm-TFF2突變體的構(gòu)建與純化Fig. 2 Expression and purification the recombinant Bm-TFF2 mutant proteins

測(cè)序方法分別檢測(cè)每種Bm-TFF2突變體單克隆的正確性。如圖2 A所示, BNM的突變是N端缺失了4個(gè)起始氨基酸——GFPI; 而B(niǎo)CM的突變是C端缺失了4個(gè)終末氨基酸——KPQE; BAM的突變則發(fā)生在分子中第44和45位精氨酸上, 兩者分別突變?yōu)楫惲涟彼岷屠i氨酸。將測(cè)序正確的各突變體克隆分別接種于1 L LB培養(yǎng)基中, 37 °C, IPTG誘導(dǎo)4 h, 如圖2 B所示, 2道菌液中相對(duì)分子質(zhì)量為33 000的位置出現(xiàn)一條顏色深而粗的誘導(dǎo)條帶, 提示誘導(dǎo)后融和蛋白的表達(dá)量顯著增加, 并且每種融和蛋白在超聲破碎后的菌液上清中含量較少(3道), 而主要存在于菌液沉淀, 即包涵體中(4道)。充分溶解包涵體并將離心后的包涵體上清結(jié)合組氨酸選擇的鎳親合層析柱, 含8 mol/L尿素, pH:5.0的磷酸鹽溶液能洗脫與親合柱結(jié)合的蛋白部分, 其純度可達(dá)70%(5道)。為得到高純度的重組蛋白, RP-HPLC進(jìn)一步純化透析后的洗脫液, 當(dāng)洗脫梯度為 70%時(shí), 280 nm 對(duì)應(yīng)的最高洗脫峰即為純化的突變型Bm-TFF2重組融合蛋白, 如圖2 C箭頭所示。

2.3 重組融合蛋白的鑒定

收集各樣品在 280 nm處對(duì)應(yīng)的最高洗脫峰,抽干TFA和ACN, 以及凍干和溶解樣品。各蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE分析后都在相對(duì)分子質(zhì)量為33 k的地方出現(xiàn)明顯的單一條帶, 其純度高達(dá)95%(圖3 A)?？笲m-TFF2抗體(圖3 B)以及抗TRX抗體(圖3 C)對(duì)各重組蛋白進(jìn)行Western blotting檢測(cè)都在相對(duì)分子質(zhì)量為33 000的位置出現(xiàn)特異性的反應(yīng)條帶,表明純化所得的蛋白即為原核體系構(gòu)建表達(dá)的突變型Bm-TFF2重組蛋白。

圖3 SDS–PAGE和Western blotting分析重組蛋白Fig. 3 SDS–PAGE and Western blotting analysis of the recombinant proteins

2.4 突變型融合蛋白的促細(xì)胞遷移活性

促進(jìn)黏膜細(xì)胞再生是三葉因子蛋白的重要功能之一(Taupin and Podolsky, 2003), 而上皮細(xì)胞的遷移又是黏膜再生的重要保障。三種突變型Bm-TFF2重組蛋白處理AGS細(xì)胞16 h后, 細(xì)胞遷移活性明顯增強(qiáng)并且呈劑量依賴性, 即100 nmol/L和 200 nmol/L重組蛋白的促細(xì)胞遷移活性呈逐漸增強(qiáng)的趨勢(shì), 并且200 nmol/L的細(xì)胞遷移活性大約是100 nmol/L的兩倍。TRX陰性對(duì)照的活性變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義, 10 nmol/L的陽(yáng)性對(duì)照-EGF與TRX相比具有顯著的促細(xì)胞遷移活性(圖4)。

圖4 重組Bm-TFF2突變體的促細(xì)胞遷移活性Fig. 4 The activity of epithelial cell migration of recombinant Bm-TFF2 mutant proteins

3 討 論

三葉因子蛋白在大蹼鈴蟾皮膚中有兩種存在形式。一種是由三個(gè)結(jié)構(gòu)域組成的βγ-CAT的β亞基, βγ-CAT是非晶狀體βγ-crystallin和三葉因子蛋白形成的復(fù)合物, 具有促細(xì)胞遷移和引發(fā)細(xì)胞凋亡的活性; 另一種是由兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成, 具有促細(xì)胞遷移和細(xì)胞增殖活性的 Bm-TFF2(He et al, 2008; Liu et al, 2008)。近期研究又發(fā)現(xiàn)重組Bm-TFF2全長(zhǎng)以及它的兩個(gè)單結(jié)構(gòu)域都有促細(xì)胞遷移活性, 并且全長(zhǎng) Bm-TFF2還具有抗細(xì)胞凋亡活性, 而它的兩個(gè)單結(jié)構(gòu)域則無(wú)此活性, 提示 Bm-TFF2活性的發(fā)揮依賴不同的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)(Yu et al, 2010)。該項(xiàng)研究通過(guò)比較Bm-TFF2和人TFF2蛋白的氨基酸組成發(fā)現(xiàn), Bm-TFF2在40～50位的氨基酸組成中由兩個(gè)具有親水性的精氨酸替代了人TFF2中相應(yīng)位置的疏水性氨基酸, 推測(cè)兩個(gè)精氨酸是其發(fā)揮生物學(xué)活性的關(guān)鍵, 而且這一區(qū)域又常常是 TFF蛋白中受體/配體結(jié)合的重要部位(Polshakov et al, 1997; Zhang et al, 2005)。另外, Bm-TFF2在其N端和C端序列組成中也出現(xiàn)了與人 TFF2較大的差異。為此, 我們分別對(duì)其分子中的兩個(gè)精氨酸以及N端和C端序列進(jìn)行了突變并檢測(cè)各種突變體的促細(xì)胞遷移活性。因此, 該項(xiàng)研究立足于在體外建立原核表達(dá)體系以表達(dá) Bm-TFF2突變體并研究其結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系。由于原核表達(dá)體系是一種較為經(jīng)濟(jì)和方便的手段, 加之表達(dá)量大的優(yōu)點(diǎn), 所以選用 pET-32a(+)體系在大腸桿菌中表達(dá) Bm-TFF2突變體。pET-32a(+)表達(dá)重組蛋白時(shí), 其顯著的特點(diǎn)是其融合蛋白部份-TRX能夠增強(qiáng)目的蛋白的溶解性, 并且有助于分子中二硫鍵的正確生成(LaVallie et al, 1993; Stewart et al, 1998)。同時(shí), 由于表達(dá)的融合蛋白帶有6個(gè)組氨酸, 所以很容易用組氨酸標(biāo)簽的親合柱來(lái)進(jìn)行純化。我們選用原核體系表達(dá)N端和C端, 分別缺失 4個(gè)氨基酸的 TRX-BNM 和TRX-BCM 突變體以及分子中兩個(gè)精氨酸突變的TRX-BAM突變體(圖2 A)。在表達(dá)重組融合蛋白時(shí),如圖2 B所示, IPTG誘導(dǎo)后的菌液出現(xiàn)明顯的相對(duì)分子質(zhì)量為 33 000的誘導(dǎo)條帶, 這與先前野生型Bm-TFF2的表達(dá)相似, 但突變型的Bm-TFF2由于分子組成的改變使得誘導(dǎo)蛋白主要存在于菌液沉淀中, 這與野生型 Bm-TFF2的誘導(dǎo)表達(dá)有所差異,后者的誘導(dǎo)蛋白主要存在于菌液上清(Yu et al, 2010)。溶解的包涵體上清經(jīng)組氨酸選擇的親合柱純化后可得到純度達(dá) 70%的融合蛋白, 再用RP-HPLC進(jìn)一步純化能夠使目的蛋白的純度達(dá)95%(圖3 A)?？笲m-TFF2抗體(圖3 B)以及抗TRX抗體(圖 3 C)證實(shí)了三種重組蛋白的特異性, 結(jié)果顯示在相對(duì)分子質(zhì)量為 33 000 的位置出現(xiàn)反應(yīng)條帶, 表明純化所得的蛋白即為原核體系構(gòu)建表達(dá)的突變型Bm-TFF2重組蛋白。在獲得重組蛋白后, 我們進(jìn)一步對(duì)其活性進(jìn)行了分析。基于三葉因子的重要功能之一是促進(jìn)黏膜細(xì)胞的再生, 而這一功能的完成與細(xì)胞遷移活性相關(guān)(Taupin & Podolsky, 2003)。同時(shí)通過(guò)促進(jìn)黏膜邊緣細(xì)胞的遷移來(lái)發(fā)揮傷口修復(fù)和治愈的功能(Dignass et al, 1994; Oertel et al, 2001)。因此, 我們檢測(cè)了三種突變型Bm-TFF2重組蛋白的促細(xì)胞遷移活性。結(jié)果提示在作用濃度為100～200 nmol/L時(shí), 三種突變型的Bm-TFF2都具有明顯的促 AGS細(xì)胞遷移活性, 并且這一活性具有劑量依賴性, 即200 nmol/L重組蛋白的促細(xì)胞遷移活性顯著性高于100 nmol/L, 大約是其活性的兩倍。同時(shí), 在相同濃度作用下, 無(wú)外源蛋白插入的空載體-硫氧還蛋白的促細(xì)胞遷移活性卻不明顯。與TRX相比, 10 nmol/L的EGF卻具有顯著的促細(xì)胞遷移活性。更為有趣的是, 三種突變型重組蛋白的促細(xì)胞遷移活性之間無(wú)明顯差異, 并且與重組野生型 Bm-TFF2全長(zhǎng)以及兩個(gè)單結(jié)構(gòu)域的促細(xì)胞遷移活性之間亦無(wú)顯著差異。由以上結(jié)果可以推論, Bm-TFF2的N端、C端和分子中兩個(gè)精氨酸的突變體, 甚至是單結(jié)構(gòu)域的 Bm-TFF2都不影響它的促細(xì)胞遷移活性, 而這一活性, 是Bm-TFF2發(fā)揮傷口修復(fù)功能的最基本要素之一。事實(shí)上, 三葉因子家族蛋白在胃腸道粘膜的保護(hù)和修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮著重要功能。它們能與表皮生長(zhǎng)因子(EGF)及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 α(TGFα)協(xié)同作用, 參與損傷組織的上皮重建, 即促進(jìn)受損黏膜周圍完好的上皮細(xì)胞向損傷黏膜表面遷移覆蓋, 從而促進(jìn)損傷黏膜的修復(fù)(Wong et al, 1999)。ERK1/2的磷酸化常常為細(xì)胞遷移活性所必需并且也是TFFs調(diào)節(jié)信號(hào)的關(guān)鍵(Klemke et al, 1997)。研究報(bào)道TFFs肽能夠促進(jìn)支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B的遷移, 而這一活性, 是依賴蛋白激酶C(PKC)和胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶-ERK1/2的激活, 即ERK1/2的磷酸化(Chwieralski et al, 2004)。

總之, 我們用原核表達(dá)體系 pET32a(+)成功表達(dá)出三種 Bm-TFF2的突變型重組蛋白, 并用組氨酸選擇的親合柱和RP-HPLC進(jìn)行純化, SDS-PAGE和 Western blotting檢測(cè)了重組蛋白的純度和特異性, 進(jìn)而用重組蛋白檢測(cè)了它們的促細(xì)胞遷移活性,結(jié)果提示三種突變型 Bm-TFF2重組蛋白都具有劑量依賴性的促細(xì)胞遷移活性, 并且其活性之間無(wú)明顯的差異。這為揭示 Bm-TFF2的結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系以及解釋其作用的分子機(jī)制提供了有力的依據(jù), 也為進(jìn)一步開(kāi)辟TFFs的生物制藥途徑奠定了基礎(chǔ)。

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Expression of Bm-TFF2 mutants inEscherichia coliand their cell migration-promoting activity

YU Guo-Yu1,2,#, XIANG Yang1,3,#, ZHANG Hong-Yun4, JIANG Ping1, LEE Wen-Hui1, ZHANG Yun1, ZHANG Yong1,*

(1.Key Laboratory of Animal Models and Human Disease Mechanisms, Kunming Institute of Zoology,the Chinese Academy of Sciences,Kunming Yunnan650223,China; 2.Biochemistry Section of Kunming Medical College,Kunming Yunnan650500,China; 3.Graduate School of the Chinese Academy of Sciences,Beijing100039,China; 4.Department of Obstetrics and Gynecology,the First Affiliated Hospital of Kunming Medical College,Kunming Yunnan650032,China)

Bm-TFF2, a trefoil factor from the large-webbed bell toad (Bombina maxima), can stimulate cell migration and inhibit cell apoptosis. To study the structure-function relationship of Bm-TFF2, we constructed wild-type and mutated Bm-TFF2 plasmids and expressed recombinant proteins inE. coli. The wild-type Bm-TFF2 gene encoding mature peptide was obtained by RT-PCR, while the N-terminal, C-terminal and two arginine mutated Bm-TFF2 clones were constructed, and ligated into pET-32a(+) expression vectors. The fusion proteins were induced by IPTG at 37°C. The mutant Bm-TFF2 fusion proteins expressed mainly in the inclusion bodies. The mutant (TRX)/Bm-TFF2 could be purified by using Ni2+-chelating chromatography and reverse-phase HPLC from the inclusion body supernatant. The fusion proteins were analyzed by SDS-PAGE and Western blotting. The yield of mutant Bm-TFF2 fusion proteins of above 95% purity was about 20 mg/L. All three recombinant mutant proteins can promote the migration of AGS cells in a dose-dependent manner with no obvious activity difference.

Bm-TFF2; Mutant; Expression; Purification; Cell migration

余果宇(1972-), 女, 博士，研究方向?yàn)槲改c腫瘤的分子生物學(xué); 向陽(yáng)(1983-), 男, 博士生，研究方向?yàn)槲改c腫瘤的細(xì)胞生物學(xué)

Q786; Q959.53

A

0254-5853-(2011)04-0379-07

10.3724/SP.J.1141.2011.04379

2011-01-05；接受日期：2011-05-18

中國(guó)科學(xué)院“西部之光”(Y102291081); “973”項(xiàng)目(2010CB529800); 國(guó)家基金委面上項(xiàng)目(30870304)

?通訊作者(Corresponding author)，E-mail: Tel: 0871-5194279, E-mail: zhyong@mail.kiz.ac.cn

#共同第一作者(Authors contributed equally to the work)