姚 斌,金贊芳,胡忠策,金 瓊,潘志彥 (浙江工業(yè)大學生物與環(huán)境工程學院,浙江 杭州 310032)

光合細菌對2,4,6-三氯苯酚的降解特性研究

姚 斌,金贊芳,胡忠策,金 瓊,潘志彥*(浙江工業(yè)大學生物與環(huán)境工程學院,浙江 杭州 310032)

研究了混合光合細菌PSB-DR在不同光照、接種量和pH值下對2,4,6-三氯苯酚(2,4,6-TCP)的生物降解特性,確定了PSB-DR生物降解 2,4,6-TCP的優(yōu)化控制條件.結果表明,光照培養(yǎng)下,接種量 30%,初始 pH值 7.0時 2,4,6-TCP降解效率最高.在此條件下,50mg/L的2,4,6-TCP經(jīng)5d后降解率達到82.3%.培養(yǎng)基中醋酸鈉的加入對2,4,6-TCP降解有明顯的抑制作用.PSB-DR靜息細胞對2,4,6-TCP的降解符合高濃度底物抑制的酶促反應類型,其降解動力學參數(shù)rmax=1.746h-1,Km=38.333mg/L,Ki=260.87mg/L.

光合細菌；生物降解；2,4,6-三氯苯酚；降解動力學

氯酚類化合物廣泛存在于石油化工、農(nóng)藥、造紙等行業(yè)的廢水中.2,4,6-三氯苯酚(2,4,6-TCP)由于酚環(huán)結構上連有 3個氯原子而成為毒性最強的氯酚類化合物之一,具有較強的“三致”作用,能夠以水為載體廣泛地擴散,已被美國環(huán)境保護局列為“優(yōu)先控制污染物”,我國也將其列入68種優(yōu)先污染物的“黑名單”[1].

2,4,6-TCP的生物降解一直是國內(nèi)外研究的一個重要課題,已有學者從受其污染的水體、土壤中發(fā)現(xiàn)并分離出了能夠降解 2,4,6-TCP的微生物[2-6],但卻鮮有關于光合細菌(Photosynthetic Bacteria,簡稱 PSB)降解 2,4,6-TCP的報道.PSB是具有原始光能合成體系的原核生物,在不同的環(huán)境中,PSB會表現(xiàn)出多種代謝途徑,能在厭氧光照、好氧光照、好氧黑暗等條件下利用低分子有機物.因此,PSB在有機廢水的處理及生物修復中得到廣泛的應用[7-10].

近年來,隨著人類活動范圍的擴大,受2,4,6-TCP污染的貧營養(yǎng)水體可能會存在微生物生長所需的氮、磷及生長因子不足等問題,從而使細胞難以增殖.本文采用混合光合細菌靜息細胞(即不生長的細胞)在低營養(yǎng)條件下降解2,4,6-TCP,研究生化反應的影響因素,尋求快速降解 2,4,6-TCP的工藝條件,以期為工程上降解2,4,6-TCP及其生物修復提供一定的理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實驗材料

混合光合細菌PSB-DR種子液購自浙江鼎龍集團已產(chǎn)業(yè)化的商品菌種,其優(yōu)勢菌群為紅假單胞菌.

基礎培養(yǎng)基:以光合細菌典型的生長氮源氯化銨作為培養(yǎng)的氮源,以醋酸鈉作為培養(yǎng)的碳源.具體成分如下:CH3COONa 2.4g,NH4Cl 0.65g, K2HPO41.55g, KH2PO40.65g,大量金屬元素MgSO4·7H2O 0.2g, CaCl20.059g, FeSO4·7H2O 0.012g,微量元素混合液[Cu(NO3)240mg/L, Na2MoO476mg/L,MnSO4160mg/L,Zn(NO3)224mg/L]1mL,生長因子包括泛酸1.0×10-3g, 維生素B1 1.0×10-3g,生物素1.0×10-5g,蒸餾水1L, pH值6.8～7.0.降解培養(yǎng)基:只含有基礎培養(yǎng)基中的3種大量金屬元素,以維持靜息細胞的生存和能量代謝,2,4,6-TCP含量根據(jù)實驗需要而變化.

試劑:2,4,6-TCP(分析純,98%),購自上海晶純試劑有限公司;甲醇(色譜純);其他試劑未經(jīng)特別說明,均為分析純.

1.2 實驗方法

菌體培養(yǎng):PSB-DR種子液以50%的接種量(體積比)接種至含有200mg/L 2,4,6-TCP的基礎培養(yǎng)基中,將裝有200mL培養(yǎng)液的錐形瓶置于光照培養(yǎng)箱中(4800lx、30℃)培養(yǎng)5d至生長平穩(wěn)期后,再按 50%的接種量轉接至新鮮培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)5d左右,如此連續(xù)進行3次轉接培養(yǎng),以獲得大量的光合細菌菌體細胞.將轉接培養(yǎng)后的菌懸液在12000r/min下離心10min,用無菌生理鹽水洗滌 2次后重新懸浮于一定體積的磷酸緩沖液中,調(diào)節(jié)OD510=3.0左右,作為降解實驗的原菌液待用.

靜息細胞對2,4,6-TCP的降解:取60mL原菌液接種至含有140mL降解培養(yǎng)基的錐形燒瓶中.溶液中2,4,6-TCP濃度為50mg/L,在光照培養(yǎng)箱中(光照度 4800lx、30℃)培養(yǎng) 7d,每隔 1d取樣測定溶液中 2,4,6-TCP的殘余量并測定菌懸液濃度.

靜息和生長細胞對 2,4,6-TCP的降解:取一定量原菌液分別接種于含50mg/L 2,4,6-TCP的基礎培養(yǎng)基中(基礎培養(yǎng)基中醋酸鈉濃度分別為0,0.4,0.8,1.2,1.6g/L),光照培養(yǎng)7d后取樣測定2,4, 6-TCP的濃度,每組實驗設2個平行,重復2次.

2,4,6-TCP降解性能影響因素實驗:取一定體積的原菌液接種于含50mg/L 2,4,6-TCP的降解培養(yǎng)基中,分別考察光照、接種量、初始pH值對 2,4,6-TCP降解率的影響.條件:光照培養(yǎng)(250mL錐形瓶裝一定量培養(yǎng)物,敞口靜置;光照度為4800lx,溫度為30℃),接種量為30%,pH值7.0.實驗中,改變 1個影響因素,固定其他條件,從而確定最優(yōu)降解條件.培養(yǎng)7d后取2mL菌懸液,樣品在12000r/min下離心10min,上清液經(jīng)微孔濾膜(0.45μm)過濾后用高效液相色譜通過外標法定量測定2,4,6-TCP濃度,每組實驗設2個平行,重復2次.

降解過程的動力學參數(shù):將原菌液以 30%的接種量分別接種至2,4,6-TCP濃度為10,20,50,80, 100,140mg/L的降解培養(yǎng)基中進行反應,測定底物濃度對反應速率的影響.

1.3 分析方法

菌懸液濃度:菌懸液濃度用UV-759S紫外-可見分光光度計測定,檢測波長為510nm,并以光密度值(OD510)表示.

活細胞吸收光譜的測定:菌懸液以轉速12000r/min離心 10min,用質(zhì)量分數(shù)為 60%蔗糖水溶液洗滌處理3次,將離心后的菌體細胞懸浮于蔗糖水溶液中,用紫外-可見分光光度計在波長200～900nm掃描.

2,4,6-TCP濃度的測定采用高效液相色譜儀(Jasco LC2000).分離柱為 ODS-C18反相色譜柱(250mm×4.6mm, 5μm);流速為 1mL/min;紫外檢測波長為 210nm;流動相為甲醇/水=90:10;柱溫為室溫;進樣體積為20μL.

2,4,6-TCP降解率的計算:降解率E(%)=[(模擬廢水中初始2,4,6-TCP質(zhì)量濃度-培養(yǎng)7d后模擬廢水中2,4,6-TCP質(zhì)量濃度)/模擬廢水中初始2,4,6-TCP質(zhì)量濃度]×100%

2 結果與討論

2.1 PSB-DR的顯微特征

圖1為轉培后混合光合細菌PSB-DR掃描電鏡圖.從細胞外形上看,PSB-DR主要為短桿形、卵形和球形混雜,大小差異顯著.革蘭氏染色表明,PSB-DR為革蘭氏陰性菌,菌體活細胞吸收光譜測定結果顯示,最大吸收峰在375、525、590、803、850nm處,表明存在菌葉綠素和類胡蘿卜素,菌體活細胞吸收光譜具有光合細菌的典型吸收特征.目前,關于光合細菌降解環(huán)境污染物的研究大多是以純菌種為對象[11-16],但由于純菌種在培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基需要滅菌,易受雜菌污染,因此較難在實際廢水處理工程中應用.此外,有研究表明,與純菌種相比,混合菌對氯酚類化合物的降解效率更高[17].因此,后續(xù)實驗均采用該混合光合細菌PSB-DR.

圖1 PSB-DR電鏡掃描照片(×10000)Fig.1 Scanning electron micrograph of PSB-DR(×10000)

2.2 PSB-DR靜息細胞對2,4,6-TCP的降解

圖2 PSB-DR的生長曲線和2,4,6-TCP降解曲線Fig.2 Growth curve of PSB-DR and biodegradation curve of 2,4,6-TCP

由圖2可見,實驗過程中OD510基本無明顯變化,表明在整個降解過程中,細胞濃度沒有增加,也說明本實驗選擇的 2,4,6-TCP降解培養(yǎng)基體系不適于細胞大量增殖,細胞基本處于靜息狀態(tài),但7d后PSB-DR對2,4,6-TCP的降解率達到85%以上,同時,滅活細胞實驗中 2,4,6-TCP濃度變化較小,說明實驗中 2,4,6-TCP的減少并不是由細胞的吸附作用引起的,這表明PSB-DR降解2,4,6-TCP是通過現(xiàn)有細胞里的酶起作用,PSBDR靜息細胞中可能存在高活性降解酶(系).此外,從圖2中可知,未接種的空白組2,4,6-TCP損耗僅為9%,對分析2,4,6-TCP降解效果的干擾并不大,故在后續(xù)實驗中忽略其損耗.

2.3 靜息和生長細胞對2,4,6-TCP降解率的影響

為考察靜息和生長細胞對 2,4,6-TCP的降解效果,以期尋求 2,4,6-TCP降解的較優(yōu)工藝條件.在實驗中設置了一系列醋酸鈉濃度不同的基礎培養(yǎng)基(醋酸鈉是光合細菌能較好利用的典型碳源,具有顯著的促生長作用),將原菌液接種至這一系列培養(yǎng)基中,除醋酸鈉濃度外,其余條件均一致,光照培養(yǎng) 7d取樣測定 2,4,6-TCP的濃度,比較靜息細胞和生長細胞對 2,4,6-TCP的降解效果,實驗結果見圖3.

圖3 醋酸鈉濃度對2,4,6-TCP降解率的影響Fig.3 Effect of sodium acetate concentration on 2,4,6-TCP degradation

結果顯示,2,4,6-TCP的降解率受培養(yǎng)基中醋酸鈉濃度的影響,在不加入醋酸鈉時,整個降解過程細胞濃度基本維持不變,細胞處于靜息狀態(tài),但對2,4,6-TCP的降解率卻最高(86.8%);在醋酸鈉濃度為0.4～1.6g/L時,細胞處于生長狀態(tài)(菌懸液濃度 OD510快速上升,數(shù)值未在圖中列出), 2,4,6-TCP的降解率卻隨醋酸鈉濃度的升高而降低且明顯低于靜息細胞的降解率.分析原因,可能是醋酸鈉的加入對底物的酶促反應產(chǎn)生了非競爭性抑制作用,降低了酶的活性,導致降解率的下降.實驗結果表明,對于PSB-DR采用靜息細胞法降解2,4,6-TCP是較佳的選擇.

2.4 光照對2,4,6-TCP降解率的影響

將PSB-DR原菌液接種至2,4,6-TCP濃度為50mg/L的降解培養(yǎng)基中,分別在黑暗、光照(敞口靜置)條件下培養(yǎng)7d并取樣測定2,4,6-TCP的濃度,實驗結果見圖4.

圖4 光照對2,4,6-TCP降解率的影響Fig.4 Effect of illumination on 2,4,6-TCP degradation

由圖4可知,PSB-DR在黑暗、光照條件下對2,4,6-TCP的降解能力存在明顯差異,7d后對2,4,6-TCP的降解率分別為6.2%、88.4%,即在黑暗條件下 2,4,6-TCP基本沒有被降解,光照成為2,4,6-TCP降解的關鍵限制因子.Blasco等[18]研究發(fā)現(xiàn)Rhodobacter capsulatus ElF1對2,4-DNP的降解是嚴格光依賴的,光照是其降解的限制因子.Thies等[19]發(fā)現(xiàn)小球藻對 metfurazon(一種除草劑)的N-位脫甲基作用由細胞色素P450羥化酶介導,而P450羥化酶催化底物需要分子氧以及還原輔酶 Ⅱ(NADPH)的參與,在黑暗條件下, NADPH 產(chǎn)生量嚴重不足,因此小球藻對metfurazon的脫甲基活性依賴于光照條件.Liu等[20]在研究Alcaligenes eutrophus JMP134細胞中由質(zhì)粒pJP4編碼的羥化酶對二氯苯酚的羥基化作用時,也發(fā)現(xiàn)需要分子氧和NADPH的參與.本實驗中 2,4,6-TCP的降解需要在光照條件下進行,推測PSB-DR對2,4,6-TCP的降解機制可能是一種酶促反應,該催化反應的進行需要由光合作用產(chǎn)生的NADPH參與,這與2.2中的結果(降解是通過現(xiàn)有細胞里的酶起作用)相符.綜上,后續(xù)實驗均選擇在光照條件下進行.

2.5 接種量對2,4,6-TCP降解率的影響

將PSB-DR原菌液接種至2,4,6-TCP濃度為50mg/L的降解培養(yǎng)基中,接種量分別為 10%、20%、30%、40%和50%,光照培養(yǎng)7d后取樣測定2,4,6-TCP的降解率,實驗結果見圖5.

圖5 接種量對2,4,6-TCP降解率的影響Fig.5 Effect of inoculum density on 2,4,6-TCP degradation

結果表明,在相同的培養(yǎng)條件下,PSB-DR的接種量不同,2,4,6-TCP的降解也呈現(xiàn)出不同的結果.接種量為 10%時,由于菌體濃度較低(降解酶濃度較低),2,4,6-TCP的降解率只有32.9%;當接種量小于 30%時,2,4,6-TCP的降解率與接種量成正相關關系,繼續(xù)增加接種量,降解率反而略有下降(猜測傳質(zhì)阻力和代謝環(huán)境惡化成為限制因素).可見30%的接種量為該條件下的最適投菌量,故后續(xù)實驗中PSB-DR的接種量均定為30%.

2.6 初始pH值對2,4,6-TCP降解率的影響

將PSB-DR原菌液以30%的接種量接種至2,4,6-TCP濃度為50mg/L的降解培養(yǎng)基中,用鹽酸和氫氧化鈉調(diào)節(jié)初始pH值,使其分別為6.0、7.0、8.0、9.0、10.0,光照培養(yǎng) 7d后取樣測定2,4,6-TCP的降解率,實驗結果見圖6.

圖6 初始pH值對2,4,6-TCP降解率的影響Fig.6 Effect of initial pH value on 2,4,6-TCP degradation

結果表明,體系在pH值為6.0～10.0之間時, PSB-DR對2,4,6-TCP的降解率均大于50%,說明PSB-DR有較強的pH適應性,PSB-DR靜息細胞對2,4,6-TCP的降解率隨初始pH的遞增先增大后減小,其中以pH值為7.0時為最佳,過高或過低的pH值對2,4,6-TCP的降解都有不同程度的抑制作用.故在本實驗條件下,選擇 2,4,6-TCP的較優(yōu)降解條件為pH值為7.0的中性條件.胡筱敏等[21]在研究光合細菌PSB-1D對2-氯苯酚的降解特性時發(fā)現(xiàn)當pH值為7.0時,菌株PSB-1D對2-CP的降解率最大,7d后對50mg/L的2-CP降解率達 60.99%;王玉芬等[22]在研究光合細菌球形紅細菌厭氧降解氯代苯時也得到類似的結論.雖然本實驗中所用為完整細胞,細胞本身會對外界氫離子濃度的改變有一定的緩沖作用,但反應體系pH值的變化仍可能對細胞內(nèi)酶的電離情況和酶蛋白的空間構象有所影響[23],從而改變酶的催化活性.

2.7 2,4,6-TCP最佳降解時間的確定

圖7為生化反應時間對2,4,6-TCP降解率的影響(最佳降解條件下).從圖7可以看出,反應1d后2,4,6-TCP的降解率為55.5%,隨著反應時間的增加,5d后的降解率達到了82.3%,雖然7d后的降解率(88.5%)高于 5d后的降解率,但在實際工程應用中考慮到經(jīng)濟性方面的原因,故選擇時間相對更短的5d作為2,4,6-TCP降解的最佳反應時間.本實驗中2,4,6-TCP降解需要光照,但光照是實際工程中需要考慮的不利因素之一,PSBDR靜息細胞降解2,4,6-TCP的成功為工程上固定化細胞大規(guī)模降解 2,4,6-TCP提供了良好的應用前景.

圖7 反應時間對2,4,6-TCP降解率的影響Fig.7 Effect of retention time on 2,4,6-TCP degradation

2.8 2,4,6-TCP降解動力學分析

圖8 不同初始濃度下2,4,6-TCP的降解情況Fig.8 Degradation of 2,4,6-TCP under different initial concentrations

通過降解動力學模型的建立可以預測微生物降解污染物的趨勢并對生化反應的工藝條件進行優(yōu)化,為工程應用提供指導.本實驗設置了不同初始濃度的 2,4,6-TCP在最佳降解條件下進行底物濃度的酶動力學反應.

由圖8可見,2,4,6-TCP的降解率隨著其初始濃度的升高而降低,當 2,4,6-TCP初始濃度為10mg/L時,7d后2,4,6-TCP能夠被完全降解,隨著其濃度升高到 100mg/L,7d后降解率下降為70.2%,當2,4,6-TCP濃度為140mg/L時,7d后降解率已經(jīng)下降到 63%,可見隨著濃度的升高2,4,6-TCP對菌體的毒性逐漸增強.圖9顯示了在不同初始濃度下 2,4,6-TCP降解的初始反應速率(最初24h內(nèi)).

圖9 不同初始濃度下2,4,6-TCP的初始反應速率Fig.9 Variation of the initial rate of 2,4,6-TCP degradation with initial 2,4,6-TCP concentration

從圖9中可以看出,初始濃度小于100mg/L時,初始降解速率隨著 2,4,6-TCP濃度的升高而升高,而后達到某一極大值后會有所下降,表明2,4,6-TCP的降解(基于初始反應速率)符合高濃度底物抑制的酶促反應類型,故采用Andrews方程模擬其降解動力學過程.

式中: ri為存在抑制劑時的酶促反應速率, h-1; c為底物濃度, mg/L; Km為米氏常數(shù), mg/L; Ki為抑制常數(shù), mg/L; rmax為不存在抑制劑時的最大酶促反應速率常數(shù),h-1.

當?shù)孜餄舛容^低時(小于100mg/L),以1/ri對1/c作圖(圖10),從直線的斜率和截距求得動力學參數(shù) rmax=1.746h-1,Km=38.333mg/L.當初始反應速率達到最大,即當 c=100mg/L時, Ki=c2/Km= 260.87mg/L,因而得到 PSB-DR降解 2,4,6-TCP的動力學方程為:

圖10 低2,4,6-TCP濃度下1/c和1/ri之間的關系Fig.10 Relationship between 1/c and 1/ri during low initial 2,4,6-TCP concentrations

3 結論

3.1 本實驗中,靜息細胞法對2,4,6-TCP的降解作用優(yōu)于生長細胞法,培養(yǎng)液中添加醋酸鈉會對2,4,6-TCP的降解產(chǎn)生抑制作用.PSB-DR靜息細胞對 2,4,6-TCP的最佳降解條件為:光照培養(yǎng)(30℃、4800lx),接種量30%,初始pH值為7.0.在最佳條件下,50mg/L的2,4,6-TCP經(jīng)5d降解率達82.3%.

3.2 在2,4,6-TCP初始濃度為10～140mg/L時,靜息細胞對 2,4,6-TCP的降解符合高濃度底物抑制的酶促反應類型,最大酶促反應速率常數(shù)rmax=1.746h-1,米氏常數(shù) Km=38.333mg/L,抑制常數(shù) Ki=260.87mg/L.米氏常數(shù)能夠反映酶與底物之間親和力的大小,本實驗中 Km值較小,說明細胞對底物的催化效果較好.

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Biodegradation characteristics of 2,4,6-trichlorophenol by photosynthetic bacteria.

YAO Bin, JIN Zan-fang, HU Zhong-ce, JIN Qiong, PAN Zhi-yan*(College of Biological and Environmental Engineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310032, China). China Environmental Science, 2011,31(10)：1669～1675

Degradation of 2,4,6-trichlorophenol (2,4,6-TCP) by mixed cultures photosynthetic bacteria PSB-DR at different illumination, inoculum density and initial pH were investigated. The degradation conditions were optimized to be incubation with an inoculum density of 30% and initial pH 7.0 under light. About 82.3% of 2,4,6-TCP with initial concentration of 50mg/L was removed after 5d incubation under the condition. The addition of sodium acetate into the substrate greatly suppressed 2,4,6-TCP biodegradation. The degradation of 2,4,6-TCP could be well described by the enzymatic reaction of high concentration inhibition, with the maximum substrate utilization rate 1.746h-1, Michaelis-Menten constant 38.333mg/L and inhibitory constant 260.87mg/L, respectively.

photosynthetic bacteria；biodegradation；2,4,6-trichlorophenol；biodegradation kinetics

X172

A

1000-6923(2011)10-1669-07

2011-01-07

國家科技重大專項(2008ZX07101-006);國家自然科學基金資助項目(40803027);浙江省環(huán)境污染控制技術研究重點實驗室項目(2010-09)

* 責任作者, 教授, panzhiyan@zjut.edu.cn

姚 斌(1985-),男,浙江蕭山人,浙江工業(yè)大學生物與環(huán)境工程學院碩士研究生,主要從事工業(yè)廢水微生物處理法方面的研究.發(fā)表論文1篇.