葉良紅，朱紅云, 李蕓霞

大黃附子相互配伍應(yīng)用首見于《金匱要略》大黃附子湯，是體現(xiàn)中醫(yī)用藥特色—中藥配伍的代表藥對之一。大黃苦寒攻下泄熱，附子辛熱散寒，寒熱并用，相反相成，首創(chuàng)溫下先河。主寒實(shí)內(nèi)結(jié)證。寒實(shí)內(nèi)結(jié)者，非溫不能散其寒，非下不能去其積。而方中大黃性苦寒，不宜用之，但得附子之辛熱，則大黃苦寒之性被制，而瀉下之用猶存，共奏溫下之功。附子、大黃是溫下的經(jīng)典藥對，治寒實(shí)證用大黃就是去性取用[1]。本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)曲面法對大黃附子藥對中游離蒽醌和結(jié)合蒽醌的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以便對該藥進(jìn)行進(jìn)一步研究。

1 儀器與材料

Varian-210高效液相色譜儀（瓦里安公司）；K Q5200E型超聲機(jī) (昆山市超聲儀器有限公司)，頻率為40khz；大黃素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110756-200110）；大黃酸對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110757-200206）；大黃素甲醚對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110758-200912）；大黃酚對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：A0046）；蘆薈大黃素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110795-200806）。HPLC所用溶劑均為色譜純，所用水為樂百氏純凈水，論文中涉及的其他試劑均為分析純。大黃，附子購自同仁堂大藥房，揀選清洗，粉碎，過四號(hào)篩。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱為Hypersil ODS C18柱 (250mm×4.6mm,5μm)；流動(dòng)相為乙醇:1%冰醋酸水溶液(70:30，v/v); 流速為1.0mL.min-1；柱溫為35 ℃；進(jìn)樣量為20μL；測定波長為254nm。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精密稱取大黃酸、大黃素、蘆薈大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對照品適量，分別置于五個(gè)25mL容量瓶中，用色譜甲醇稀釋至刻度，得對照品儲(chǔ)備液。取各儲(chǔ)備液適量配成一系列不同質(zhì)量濃度的混合對照品工作液。進(jìn)樣測定，以濃度C為橫坐標(biāo)，峰面積A為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、相關(guān)系數(shù)r2和線性范圍（見表1）。

表1 5種蒽醌類成分的回歸方程

2.3 精密度試驗(yàn)

日內(nèi)精密吸取混合對照品溶液20μL,按HPLC條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，結(jié)果各峰保留時(shí)間的RSD均2%，峰面積的RSD均1.4%。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

按“2.2”項(xiàng)下方法平行制備配伍樣品溶液5份，按“2.1”項(xiàng)色譜條件測定含量進(jìn)行分析，結(jié)果表明5個(gè)指標(biāo)成分保留時(shí)間RSD均1.3%，峰面積的RSD均1.6%。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取統(tǒng)一混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，室溫下放置，分別于0、2、4、8、12、24h內(nèi)進(jìn)樣分析，結(jié)果表明5個(gè)指標(biāo)色譜峰保留時(shí)間的RSD均1.1%，峰面積均1.5%，說明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.6 加樣回收試驗(yàn)

取已知含量的大黃藥材粉末0.5 g，附子藥材1 g，加入適量大黃蒽醌類對照品，計(jì)算得平均加樣回收率均在99.7%～100. 2%范圍，RSD均在0.99%～1.95%范圍。

2.7 含量測定

2.7.1 游離蒽醌的測定 根據(jù)參考文獻(xiàn)[2～6]取2mL的供試品溶液，加10mL蒸餾水混勻，再加入10mL乙酸乙酯萃取，分取乙酸乙酯層，水層再用乙酸乙酯萃取2次，每次10mL，合并乙酸乙酯，揮干后殘?jiān)蛹状既芙庠?5mL容量瓶中，按“2.1”項(xiàng)色譜條件測定含量。

2.7.2 結(jié)合蒽醌的測定 取“2.7.1”項(xiàng)剩余水層加2.5 mol?L-1的硫酸溶液20mL和10mL乙酸乙酯溶液水浴2h，放至室溫，乙酸乙酯萃取3次，每次10mL，合并乙酸乙酯，揮干，殘?jiān)眉状级ㄈ菰?0mL容量瓶中，按“2.1”項(xiàng)色譜條件測定含量。

2.8 單因素試驗(yàn)

2.8.1 乙醇濃度對提取率的影響 根據(jù)參考文獻(xiàn)[7]取一定量的大黃附子粉末各1g左右，分別按液料比10加入60%、70%、80%、90%、95%乙醇，50℃超聲提取3次，每次25min，合并提取液，定容在50mL容量瓶中，用“2.7”項(xiàng)下含量測定方法分別測得游離蒽醌和結(jié)合蒽醌的含量。結(jié)果顯示游離蒽醌和結(jié)合蒽醌的提取率隨著乙醇濃度的增加先上升再下降，且都在70%時(shí)為最高。結(jié)果見圖1、2。

圖1 乙醇濃度對結(jié)合蒽醌提取率的影響

圖2 乙醇濃度對游離蒽醌提取率的影響

2.8.2 料液比對提取率的影響 取一定量的大黃附子粉末各1g左右，分別按液料比5、8、10、12、15加入70%乙醇，50℃超聲3次，每次25min，合并提取液，定容在50mL容量瓶中，用“2.7”項(xiàng)下含量測定方法分別測得游離蒽醌和結(jié)合蒽醌的含量。結(jié)果顯示游離蒽醌和結(jié)合蒽醌的提取率隨著乙醇用量的增加先上升再下降，在10mL左右時(shí)提取率最高。結(jié)果見圖3、4。

圖3 液料比對結(jié)合蒽醌提取率的影響

圖4 液料比對游離蒽醌提取率的影響

2.8.3 超聲次數(shù)對提取率的影響 取一定量的大黃附子粉末各1g左右，分別按液料比10加入70%乙醇，50 ℃超聲1、2、3、4、5次，每次25min，合并提取液，定容在50mL容量瓶中，用“2.7”項(xiàng)下含量測定方法分別測得游離蒽醌和結(jié)合蒽醌的含量。結(jié)果顯示游離蒽醌和結(jié)合蒽醌的提取率隨著超聲次數(shù)的增加先上升，超聲3次時(shí)基本達(dá)到最高，再增加超聲次數(shù)，結(jié)合蒽醌的提取率無多大變化，游離蒽醌的提取率下降。結(jié)果見圖5、6。

圖5 超聲次數(shù)對結(jié)合蒽醌的提取率的影響

圖6 超聲次數(shù)對游離蒽醌提取率的影響

2.8.4 超聲溫度對提取率的影響 取一定量的大黃附子粉末各1g左右，分別按液料比10加入70%乙醇，40℃、50℃、60℃、70℃、80℃超聲3次，每次25min，合并提取液，定容在50mL容量瓶中，用“2.7”項(xiàng)下含量測定方法分別測得游離蒽醌和結(jié)合蒽醌的含量。結(jié)果顯示游離蒽醌和結(jié)合蒽醌的提取率隨著溫度的增加先上升再下降，且都在50℃時(shí)為最高?？赡芘c濕熱效應(yīng)有關(guān)，溫度越高，一些敏感的蒽醌類成分可能會(huì)分解導(dǎo)致提取率變小。故溫度宜選擇50℃。結(jié)果見圖7、8。

圖7 超聲溫度對結(jié)合蒽醌提取率的影響

圖8 超聲溫度對游離蒽醌提取率的影響

2.8.5 超聲時(shí)間對提取率的影響 取一定量的大黃附子粉末各1g左右，分別分別按液料比10加入70%乙醇，50℃超聲3次，每次15、20、25、30、35min，合并提取液，定容在50mL容量瓶中，用“2.7”項(xiàng)下含量測定方法分別測得游離蒽醌和結(jié)合蒽醌的含量。結(jié)果顯示游離蒽醌和結(jié)合蒽醌的提取率隨著超聲時(shí)間的增加先上升，在超聲25min左右提取率最高。結(jié)果見圖9、10。

圖9 超聲時(shí)間對結(jié)合蒽醌提取率的影響

圖10 超聲時(shí)間對游離蒽醌提取綠的影響

所考察的因素中，對大黃游離和結(jié)合蒽醌的提取率的影響結(jié)果分析，選擇超聲次數(shù)，超聲時(shí)間和液料比做響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，而溫度規(guī)定在50℃，乙醇濃度為70%。

2.9 響應(yīng)面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)

2.9.1 實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì) 根據(jù)響應(yīng)面分析軟件，以液料比、超聲次數(shù)、超聲時(shí)間為主要考查因素，分別用X1、X2、X3來表示，并以1、0、-1分別表示自變量的高低水平。分別以游離蒽醌、結(jié)合蒽醌的提取率為響應(yīng)值。設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)因素和水平取值見表2。

表2 因素與水平

2.9.2 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果 分別以游離蒽醌和結(jié)合蒽醌的提取率為響應(yīng)值，根據(jù)表3的結(jié)果，對其進(jìn)行多元二次回歸分析如表4和表5。從回歸分析中可以看出一次項(xiàng)、二次項(xiàng)及交互項(xiàng)都有顯著影響。各實(shí)驗(yàn)因子對響應(yīng)值的影響呈顯著的線性關(guān)系。實(shí)驗(yàn)因子對響應(yīng)值的影響如下式：

表3 響應(yīng)面曲線設(shè)計(jì)表及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 響應(yīng)曲面模型分析及方差分析（游離蒽醌）

表5 響應(yīng)曲面模型分析及方差分析（結(jié)合蒽醌）

A^2 0.2626 1 0.2626 2434.9972 < 0.0001 B^2 0.0912 1 0.0912 846.4437 < 0.0001 C^2 0.0793 1 0.0793 735.3806 < 0.0001 Residual 0.0008 7 0.0001 Lack of Fit 0.0005 3 0.0002 2.26190.2234 不顯著

由表4和表5所示，超聲時(shí)間、超聲次數(shù)、液料比及其二次項(xiàng)對兩種成分的提取率影響極顯著。交互項(xiàng)也達(dá)到了顯著水平。兩個(gè)模型的決定系數(shù)R2值均為0.999，經(jīng)擬合檢驗(yàn)，p<0.0001差異極顯著，說明該方程能夠正確的反映提取量與超聲時(shí)間、超聲次數(shù)、液料比之間的關(guān)系。失擬檢驗(yàn)p值分別為0.1531和0.2234，均大于0.05，說明本實(shí)驗(yàn)可代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

通過響應(yīng)面分析得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖11～圖16，得到超聲提取大黃附子藥對中游離蒽醌的最佳條件為液料比10.31，提取次數(shù)3.53次，提取時(shí)間26.76min，在此條件下游離蒽醌的最佳提取量為11.629mg.g-1；結(jié)合蒽醌的最佳提取條件為液料比10.34，超聲次數(shù)3.42次，超聲時(shí)間24.25min，在此條件下的結(jié)合蒽醌的提取量為5.455mg.g-1。

圖11 溶劑用量和超聲次數(shù)對結(jié)合蒽醌提取率的響應(yīng)曲面圖

圖12 溶劑用量和超聲時(shí)間對結(jié)合蒽醌提取率的響應(yīng)曲面圖

圖13 超聲時(shí)間和超聲次數(shù)對結(jié)合蒽醌提取率的響應(yīng)曲面圖

圖14 超聲次數(shù)和液料比對游離 蒽醌提取率的響應(yīng)曲圖

圖15 超聲時(shí)間和液料比對游離蒽醌提取率的響應(yīng)曲面圖

圖16 超聲時(shí)間和超聲次數(shù)對游離蒽醌提取率的響應(yīng)曲面圖

為了驗(yàn)證響應(yīng)面法的可靠性，采用最佳提取工藝條件進(jìn)行5次平行超聲提取驗(yàn)證試驗(yàn)，試驗(yàn)值與理論值相差0.87%和0.24%。因此通過響應(yīng)曲面法優(yōu)化得到的超聲提取工藝條件參數(shù)是準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值的。

3 討論

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用試驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件Design Expert設(shè)計(jì)了三因素三水平的中心組合設(shè)計(jì)，并對大黃附子的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，建立了二次多項(xiàng)式的回歸模型，擬合度良好。對模型進(jìn)行分析，得到了最適提取工藝參數(shù)。游離蒽醌的最佳條件為液料比10.31，提取次數(shù)3.53次，提取時(shí)間26.76min。結(jié)合蒽醌的最佳提取條件為液料比10.34，超聲次數(shù)3.42次，超聲時(shí)間24.25min。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明所有優(yōu)選出來的條件穩(wěn)定性好，重復(fù)性高。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)選出來的實(shí)驗(yàn)條件對大黃附子藥對中蒽醌類成分的進(jìn)一步研究有指導(dǎo)意義。

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