郭冰沁 俞 嵐 武世伍 宋文慶 承澤農

HE4、NF-κBp65和 MMP-9在卵巢上皮性腫瘤中的表達及其臨床意義

郭冰沁 俞 嵐 武世伍 宋文慶 承澤農

（蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院病理科，蚌埠醫(yī)學院病理學教研室，安徽省感染與免疫重點實驗室，蚌埠233030）

目的 探討HE4、NF-κBp65以及MMP-9的表達與上皮性卵巢腫瘤臨床病理生物學行為的關系以及對患者預后的影響。方法 應用免疫組化對80例卵巢上皮性癌、10例交界性上皮性腫瘤及10例良性上皮性腫瘤組織進行HE4、NF-κB p65及MMP-9蛋白的檢測。結果 HE4、NF-κBp65及MMP-9蛋白的陽性表達率在卵巢癌組均高于交界性及良性腫瘤組（P＜0.05）。三個指標的表達與EOC的組織學分級、腹腔臟器及淋巴結轉移以及PTNM臨床分期有關（P＜0.05）；在EOC中，NF-κBp65分別與 HE4、MMP-9的表達呈正相關（r1＝0.673，P＜0.05；r2＝0.775，P＜0.05）。多因素分析，PTNM 分期、MMP-9的表達是影響卵巢癌術后患者預后的獨立因素（P＜0.05）；HE4陽性組與陰性組5年生存率分別為12.7%和84.0%，MMP-9陽性組與陰性組5年生存率分別為8.7%和70.6%，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論 NF-κBp65可能通過上調HE4、MMP-9的表達促進EOC的浸潤和轉移，聯(lián)合檢測HE4、NF-κBp65以及MMP-9的表達可能作為預測和評價患者預后的生物學指標。

卵巢上皮性癌；人附睪蛋白4；核轉錄因子-κB；基質金屬蛋白酶-9；免疫組織化學；預后

卵巢癌是全球婦科惡性腫瘤中病死率最高的一種。臨床上由于缺乏有效的篩選方法，70%的患者就診時已屬晚期，5年生存率僅30%左右，并且常出現(xiàn)復發(fā)和轉移。因此，尋找特異性的腫瘤標志物一直是卵巢癌研究的熱點問題。本研究通過對80例上皮性卵巢癌（Epithelial Ovarian cancer，EOC）、10例卵巢交界性上皮性腫瘤以及10例良性上皮性腫瘤組織 HE4、NF-κBp65以及 MMP-9的表達水平進行檢測，以探討它們的表達與卵巢癌侵襲、轉移以及預后的關系。

材料和方法

1.一般資料

選擇蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院病理科2000年1月-2002年12月存檔蠟塊EOC組織標本80例（術前未行放、化療），所有病例均有完整的臨床、病理及隨訪資料，入選病例隨訪至患者死亡或截止2010年11月，隨訪時間為7-96個月。根據(jù)UICC2002版PTNM病理分期標準進行分期，早期（FIGOⅠ、Ⅱ期）卵巢癌43例，晚期（FIGO Ⅲ、Ⅳ期）卵巢癌37例；漿液性癌63例，黏液性癌10例，子宮內膜樣癌7例；有腹腔臟器及淋巴結轉移者38例，有腹水者21例。年齡19-76歲，中位年齡52.0歲，≥50歲36例，＜50歲44例；腫瘤平均最大直徑6.2cm，≥6.0cm 48例，＜6.0cm 32例。選擇卵巢交界性上皮性腫瘤10例以及良性上皮性腫瘤10例作為對照組。復閱上述患者的病理切片，選取存檔標本石蠟塊進行切片，厚度4μm。

2.免疫組織化學染色

兔抗人HE4多克隆抗體，鼠抗人MMP-9單克隆抗體（克隆系15W2），二步法免疫組化檢測試劑盒以及以及DAB顯色試劑盒均購自北京中杉生物技術有限公司。鼠抗人NFκBp65單克隆抗體（克隆系sc-8008）購自Santa Cruz公司。將石蠟標本連續(xù)切片，烤干，于二甲苯溶液及不同濃度的乙醇中脫蠟至水洗。免疫組化染色操作步驟按試劑盒說明書進行。采用已知陽性片作對照，以PBS液代替一抗作空白對照。

3.結果判定

NF-κBp65以腫瘤細胞胞核內出現(xiàn)棕黃色顆粒的細胞數(shù)≥10%定為激活型表達。陽性瘤細胞表達數(shù)＜10%為陰性，≥10%為陽性。HE4及 MMP-9陽性染色均為腫瘤細胞胞質內出現(xiàn)棕黃色顆?；驁F塊。采取二次計分法：每例標本隨機計數(shù)5個高倍視野（×400），計數(shù)每個高倍視野中陽性細胞所占百分比取其平均陽性率并計分。首先將染色強度計分：0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。再按陽性細胞百分比計分，0分為陰性，1分為陽性細胞＜10%，2分為11% ～50%，3分為51% ～75%，4分為＞75%。用染色強度得分和陽性細胞數(shù)得分的乘積作為判斷表達結果，若積分≤2為陰性，＞2為陽性。免疫組化結果由高年資病理醫(yī)師讀片評定。

4.統(tǒng)計學分析

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。HE4和MMP-9表達陽性組與陰性組生存分析用Kaplan-Meier法，組間比較用log-rank檢驗，多因素分析采用Cox回歸多因素模型，HE4、MMP-9和NF-κBp65在各種卵巢上皮性腫瘤中的表達情況以及三者在EOC中的表達與各臨床病理因素的相關性均采 用 Fisher exact 法 檢 驗，NF-κBp65 與 HE4、MMP-9的表達相關性采用Spearman檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1.HE4、MMP-9及NF-κBp65蛋白在EOC、交界性及良性上皮性卵巢腫瘤組織中的表達 卵巢漿液性癌、黏液性癌、子宮內膜樣癌、卵巢交界性及良性上皮性腫瘤五個組間 HE4、MMP-9及 NF-κBp65陽性表達率差異均分別具有顯著性（P＜0.05）。三個惡性腫瘤組分別與交界性組及良性組組間進行比較，HE4、MMP-9的陽性表達率在卵巢漿液性癌、交界性及良性上皮性腫瘤組間存在顯著性差異（P＜0.05），同時，兩者的表達在子宮內膜樣癌組、交界性組及良性腫瘤組三個組間亦存在顯著性差異（P＜0.05）（表1，圖1-3）。

2.HE4、MMP-9及 NF-κBp65蛋白在 EOC中的表達與臨床病理指標的關系 EOC中，HE4、MMP-9及NF-κBp65的表達與患者的年齡、腫瘤的組織學類型以及腫瘤大小差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而與腫瘤的臨床分期、組織學分級及腹腔器官、淋巴結轉移有關。三者的表達在臨床分期Ⅲ-Ⅳ期均高于Ⅰ-Ⅱ期（P＜0.05），高、中和低分化組HE4蛋白陽性表達率分別為35.3%、70.0%和84.8%，MMP-9蛋白陽性表達率分別為 5.9%、60.0%和81.8%，NF-κBp65蛋白陽性表達率分別為5.9%、60.0%和72.7%，其陽性表達率均隨著腫瘤惡性級別的增高而顯著增加（P＜0.05），有腹腔器官及淋巴結轉移者均高于無轉移者（P＜0.05）（表2）。

表1 卵巢EOC、交界性及良性上皮性腫瘤中HE4、MMP-9及NF-κBp65蛋白的表達Table 1 Expression of HE4，MMP-9and NF-κBp65in EOC，borderline and benign epithelial ovarian tumor

表2 80例EOC組織中HE4、MMP-9及NF-κBp65的表達與臨床病理因素的關系Table 2 Correlation of HE4，MMP-9and NF-κB expression to clinicopathologic indexes of 80cases of EOC

3.EOC中 NF-κBp65與 HE4、MMP-9表達的關系 Spearman相關分析顯示，在EOC中NF-κBp65分別與 HE4、MMP-9的表達呈正相關性（r1＝-0.775，P＜0.05；r2＝-0.673，P＜0.05）（表3）。

表3 EOC中NF-κBp65表達與HE4、MMP-9表達的關系Table 3 Correlation of NF-κBp65expression to HE4and MMP-9expression in EOC

圖1 HE4蛋白在卵巢漿液性癌中的陽性表達（SP×400）；圖2MMP-9蛋白在卵巢粘液癌中的陽性表達（SP×400）；圖3NF-κBp65蛋白在卵巢子宮內膜樣癌中的陽性表達（SP×400）Fig.1 Expression of HE4protein was observed in ovarian serous carcinoma（SP×400）；Fig.2 Expression of MMP-9protein was observed in ovarian mucinous papillary carcinoma（SP×400）；Fig.3 Expression of NF-κBp65protein was observed in ovarian endometrioid carcinoma（SP×400）

4.多因素分析 將年齡（分為≤50歲組與＞50歲組）、組織學分型（漿液性癌、黏液性癌及子宮內膜樣癌）、PTNM分期（分為Ⅰ-Ⅱ期組與Ⅲ-Ⅳ期組）、病理組織分化（分為高、中、低分化組）、腫瘤直徑（分為≤6.0cm組與＞6.0cm組）、腹腔器官及淋巴結轉移（分為有轉移組與無轉移組）、NF-κBp65表達（分為陽性組與陰性組）、HE4表達（分為陽性組與陰性組）和 MMP-9表達（分為陽性組與陰性組）等因素引入Cox模型進行多因素分析，結果顯示：MMP-9的表達及PTNM分期是影響EOC術后患者預后的獨立因素（表4）。

表4 80例卵巢癌患者多因素分析Table 4 Multivariate survival analysis of 80patients with EOC

5.生存分析

本組病例總的5年生存率為35.0%。Kaplan-Meier生存分析顯示HE4陽性組與陰性組5年生存率分別為12.7%和84.0%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；MMP-9陽性組與陰性組5年生存率分別為8.7%和70.6%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），生存曲線見圖4和圖5。

圖4 HE4表達陽性組與陰性組EOC患者生存曲線；圖5 MMP-9表達陽性組與陰性組EOC患者生存曲線Fig.4 Survival curves of EOC patients with positive or negativeHE4expression；Fig.5 Survival curves of EOC patients with positive or negative MMP-9expression

討 論

基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是一類與腫瘤的侵襲和轉移關系十分密切的蛋白水解酶家族成員，通過降解細胞外基質（extracellular matrix，ECM）和 基 底 膜 （basement membrane，BM），促進惡性腫瘤的血管形成以及侵襲和轉移。MMP-9是MMPs家族中的重要一員，又名Ⅳ型膠原酶或明膠酶，能降解細胞膜基質中的主要成分Ⅳ、Ⅴ型膠原和明膠，從而在腫瘤的惡性演變中發(fā)揮重要作用［1］。大量的研究證明，在乳腺癌［2］、卵巢癌［3］、胃腸癌、頭頸鱗癌等許多腫瘤中MMP-9均有不同程度表達，并且其表達情況與這些惡性腫瘤的預后密切相關。

人附睪蛋白 4（human epididymis protein 4，HE4）是WFDC2基因的產(chǎn)物。1991年由Kirchhoff等［4］首先從人的附睪遠端上皮細胞中克隆到HE4基因的cDNA，并進行了報道。HE4基因位于染色20q12～13.1上，由兩個“乳清酸性蛋白（whey acidic proteins，WAP）域”和一個“4-二硫化中心”組成，屬于 WAP基因家族成員，其家族成員還包括SLPI和 Elafin。1999年Schummer等［5］通過cDNA微陣列、反轉錄聚合酶鏈反應和Northerm印跡雜交等方法分析了不同來源的卵巢癌及癌旁組織中的HE4基因表達水平，發(fā)現(xiàn)其mRNA在卵巢癌組織中有較高表達，但在癌旁組織中卻未見表達。最近研究發(fā)現(xiàn)［6］，HE4在肺癌、胰腺癌、移行細胞癌、胃腸癌、乳腺癌、卵巢癌等惡性腫瘤組織中高表達，并且發(fā)現(xiàn)在卵巢癌中表達增高的最明顯。2005年Drapkin等［7］用免疫組織化學方法進一步描述了HE4在不同組織類型卵巢癌的表達，發(fā)現(xiàn)HE4在50%卵巢透明細胞癌、93%的卵巢漿液性癌及100%卵巢子宮內膜樣癌表達，而在卵巢黏液性癌及正常卵巢組織中不表達。Lu等［8］研究結果顯示，通過HE4檢測可篩查出正常人群中100%的漿液性腫瘤、89%的子宮內膜腫瘤、43%的透明細胞瘤、22%的黏液性癌。提示該基因可能是一個卵巢癌相關基因，其啟動子有可能應用于卵巢癌的靶向性基因治療。盧仁泉等［9］應用酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測116例EOC患者與對照者血清的HE4濃度水平，卵巢癌患者血清HE4水平隨著腫瘤分級、分期的升高而升高，淋巴結轉移患者HE4水平顯著高于未轉移者（U值為665.5，P均＜0.01）。張東妹等［10］研究結果表明，HE4可作為卵巢癌診斷的獨立生物學指標。管桂峰［11］的研究表明，OPN通過促進HE4蛋白刺激基質金屬蛋白酶和血管內皮生長因子的產(chǎn)生，能夠引起細胞外基質降解和腫瘤組織血管形成，從而增強腫瘤細胞的侵襲浸潤能力，導致腫瘤轉移發(fā)生。目前，國內關于HE4蛋白在卵巢癌組織中表達的研究還較少，相關研究大多還集中于血清學方面。

本實驗通過免疫組化檢測了卵巢良性、交界性以及各組惡性上皮性腫瘤中HE4、MMP-9蛋白的表達，結果表明卵巢漿液性癌、黏液性癌、子宮內膜樣癌、卵巢交界性及良性上皮性腫瘤五個組間HE4及MMP-9陽性表達率差異均分別具有顯著性（P＜0.05）。并且HE4、MMP-9的陽性表達率在卵巢漿液性癌、交界性及良性上皮性腫瘤組間以及在子宮內膜樣癌、交界性及良性腫瘤組組間都存在顯著性差異（P＜0.05）。進一步的分析發(fā)現(xiàn)，HE4、MMP-9陽性表達率均隨著EOC的病理分級增高而顯著增加（P＜0.05），臨床分期愈晚表達愈高（P＜0.05），有腹腔器官及淋巴結轉移者明顯高于無轉移者（P＜0.05）。這些結果與上述國內外文獻報道基本一致。

核轉錄因子κB （nuclear factor-κB，NF-κB）是一個廣泛存在于哺乳動物細胞中的轉錄因子，最先在成熟的B細胞中被發(fā)現(xiàn)，因其能夠與B細胞免疫球蛋白上的κB輕鏈基因增強子κB序列特異結合而得名。Shishoodia等［12］研究表明，NF-κB通過調節(jié)許多與黏附及侵襲相關因子的轉錄過程而參與惡性腫瘤的侵襲和轉移。乳腺癌、子宮頸鱗癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤中都發(fā)現(xiàn)有 NF-κB的活化［13］。本實驗顯示，NF-κBp65蛋白表達陽性率在各組上皮性卵巢癌與卵巢交界性及良性上皮性腫瘤組比較，組間差異具有顯著性 （P＜0.05），卵巢癌組表達陽性率較高。NF-κBp65陽性表達率均隨著EOC的病理分級增高而顯著增加（P＜0.05），臨床分期愈晚表達愈高（P＜0.05），有腹腔器官及淋巴結轉移者明顯高于無轉移者（P＜0.05）。當細胞受多種因素的刺激時，通過一系列細胞信號轉導作用NF-κB被釋放出來，在入核引導序列的作用下進入細胞核，啟動下游靶基因的表達。目前有研究［14］認為，MMP-9的轉錄激活機制依賴于 NF-κB，活化的NF-κB與 MMP-9啟動子上的κB序列結合，使MMP-9表達上調，進一步降解腫瘤基底膜和細胞外基質，促進腫瘤的侵襲和轉移。我們的實驗結果通過Spearman相關分析顯示，在EOC中NF-κBp65與 MMP-9 的 表 達 呈 正 相 關 性 （r＝-0.673，P＜0.05），隨著 NF-κBp65表達的增加，MMP-9也表達增加，這可能表明是NF-κB的活化上調了 MMP-9的表達。Adam［15］研究發(fā)現(xiàn)，WAP基因家族在卵巢癌中均有較高的表達，該基因家族也可以與NF-κB的基因位點結合促使其活化，從而表現(xiàn)出在卵巢癌細胞中的過表達，并與卵巢癌的預后不良有關。因此，HE4作為WAP基因家族的一員，在卵巢癌中高表達很可能是受到NF-κB誘導的結果。我們的實驗結果顯示，在EOC中NF-κBp65與HE4的表達也呈現(xiàn)正相關性（r＝-0.775，P＜0.05），這與 Adam的實驗結果具有一致性。

本次實驗數(shù)據(jù)進行多因素分析，結果顯示MMP-9的表達和PTNM分期是影響EOC的獨立預后因素。生存分析顯示，HE4陽性組與陰性組5年生存率分別為12.7%和84.0%；MMP-9陽性組與陰性組5年生存率分別為8.7%和70.6%，兩組間差異均有顯著性（P＜0.05），這提示 HE4及MMP-9表達陽性的卵巢EOC患者術后生存時間更短，預后更差，HE4和MMP-9可能協(xié)同促進了卵巢癌的惡性進展。

本實驗初步探討了EOC組織中 HE4、NF-κBp65以及 MMP-9的表達與其侵襲、轉移以及預后的關系。實驗結果提示，聯(lián)合檢測 HE4、NF-κBp65和MMP-9蛋白的表達對早期篩選卵巢癌高危病例、判斷其惡性程度及評估預后有重要意義。同時，HE4基因和MMP-9將有望成為控制卵巢癌細胞生長、侵襲以及治療腫瘤的新靶點。

［1］Lee SO，J eong YJ，Kim M，et al.Suppression of PMA-induced tumor cell invasion by capillarisin via the inhibition of NF-kappaB-dependent MMP-9expression.Biochem Biophys Res Commun，2008，366（4）：1019-1024

［2］Wu ZS，Wu Q，Yang JH，et al.Prognostic significance of MMP-9and TIMP-1serum and tissue expression in breast cancer.Int J Cancer，2008，122（9）：2050-2056

［3］Sillanp S，Anttila M，Voutilainen K，et al.Prognostic significance of matrixmetallopro-teinase-9（MMP-9）in epithelial ovarian cancer.Gynecol Oncol，2007，104（2）：296-303

［4］Kirchhoff C，Habben I，Ivell R，et al.A major human epididymis-specific cDNA encodesa protein with sequencehomology to extracellular proteinase inhibitors.BiolRep rod，1991，45（2）：350-357

［5］Schummer M，Ng WV，Bumgarner RE，et al.Comparative hybridization of an array of 21，500ovarian cDNAs for the discovery of genes overexpressed in ovarian carcinomas.Gene，1999，238（2）：375-385

［6］Galgano MT，Hampton GM，F(xiàn)rierson HF Jr.Comprehensive analysis of HE4expression in normal and malignant human tissues.Mod Pathol，2006，19（6）：847-853

［7］Drapkin R，Lin Y，Mok SC，et al.Human epididymis protein 4（HE4）is a secreted glycolprotein that is overexpressed by serous and endometrioid ovarian carcinomas.Cancer Res，2005，65（6）：2162-2169

［8］Lu KH，Patterson AP，Wang L，et al.Selection of potentialmarkers for epithelial ovarian cancer with gene expression arrays and recursive descent partition analysis.Clin Cancer Res，2004，10（10）：3291-3300

［9］盧仁泉，郭林，沈燁紅.HE4在卵巢癌診治中的臨床應用評價 .中國癌癥雜志，2010，20（9）：680-685

［10］張東妹，徐惠貞，楊景陽 .血清HE4及CA125水平檢測在早期卵巢惡性腫瘤診斷中的價值 .中國腫瘤臨床與康復，2010，4：327-330

［11］管桂峰 .OPN及HE4基因在上皮性卵巢癌中的表達及臨床意義 .醫(yī)藥論壇雜志，2009，30（10）：9-13.

［12］Shishoodia S，Aggarwal BB.Nuclear factor kappa B activation mediates cellular transformation，proliferation，invasion angiogenesis and metastasis of cancer.Cancer Treat Res，2004，119（3）：139-173

［13］Shin SR，Sanchez-Velar N，Sherr DH，et al.7，12-dimethyl-benz（a）anthracene treatment of a c-rel mouse mammary tumor cell line induces epithelial to mesenchymal transition via activation of nuclear factor-kappaB.Cancer Res，2006，66（5）：2570-2575

［14］Gasparian AV，F(xiàn)edorova MD，Kisselev FL.Regulation of matrixmetalloproteinase-9transcription in squamous cell carcinoma of uterine cervix：the role of human papillomavirus gene E2expression and activation of transcript ion fact or NF-kappaB.Biochemistry（Mosc），2007，72（8）：848-853

［15］Clauss A，Ng V，Liu J，et al.Overexpression of elafin in ovarian carcinoma is driven by genomic gains and activation of the nuclear factor kappaB pathway and is associated with poor overall survival.Neoplasia，2010，12（2）：161-172

Expression of HE4，NF-κB p65，MMP-9and Their Clinical Significance in Epithelial Ovarian Noeplasm

Guo Bingqin，Yu Lan，Wu Shiwu，Song Wenqing，Cheng Zenong
（Department of Pathology，The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical Collge；Anhui Key Laboratory of Infection and Immunology，Bengbu233030，China）

Objective To study the association of the expression of HE4，NF-κBp65and MMP-9with the clinicobiologic behavior and prognosis of epithelial ovarian neoplasm.Methods Immunohistochemical staining was used to detect the expression of HE4，NF-κBp65and MMP-9proteins in 80cases of EOC，10 cases of borderline epithelial tumors and 10cases of benign epithelial tumors.Results The positive expression of HE4，NF-κBp65and MMP-9proteins in EOC were higher than those in borderline and benign tumors of the ovary，and there were significant differences among the three（P＜0.05）.The 3indexes in EOC were significantly related to differentiation，abdominal organ and lymph node metastasis，and PTNM stage，respectively（P＜0.05）.There was a positive correlation between the expression of NF-κBp65and HE4（r1＝-0.673，P＜0.05），MMP-9（r2＝-0.775，P＜0.05）.PTNM stage and MMP-9expression were independent prognosis factors of EOC （P＜0.05）.The 5-year survival rate was significantly different between the HE4-positive and HE4-negative groups（12.7%vs 84.0%，P＜0.05），and between the MMP-9-positive group and the MMP-9-negative group （8.7%vs 70.6%，P＜0.05）.Conclusion Through upregulationing the expression of HE4and MMP-9，NF-κBp65may promote invasion and metastasis of EOC.Thus detecting HE4，NF-κBp65and MMP-9can be used as markers to predict the prognosis of EOC patients.

EOC；Human epididymis protein 4；Nuclear factor-κB；Matrix metalloproteinase-9；Immunohistochemistry；Prognosis

R737.3

A

10.3870／zgzzhx.2011.06.008

2011-06-21

2011-07-14

安徽省科技廳研究項目（09020304050）

郭冰沁，男（1972年），漢族，講師。