劉 卉 宮 喜 徐 麗 蔣繼浩 周瑞祥

褪黑素對小鼠MFC前胃癌細(xì)胞的survivin、caspase-3表達(dá)的影響

劉 卉 宮 喜 徐 麗 蔣繼浩 周瑞祥＊

（福建醫(yī)科大學(xué)人體解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)系；神經(jīng)生物學(xué)研究中心，福州350004）

目的 探討褪黑素（Melatonin，MLT）對小鼠前胃癌細(xì)胞（murine foregastric carcinoma，MFC）的生存素survivin和半胱天冬酶-3（cysteinyl aspartate-specific protease-3，caspase-3）表達(dá)的影響。方法 使用不同濃度褪黑素處理培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞，運(yùn)用細(xì)胞免疫組化、實(shí)時熒光定量PCR、免疫印跡法、分光光度法等方法檢測褪黑素在抑制小鼠MFC前胃癌細(xì)胞增殖過程中對細(xì)胞survivin、caspase-3的表達(dá)影響。結(jié)果 與空白對照組相比，6mmol／L濃度褪黑素干預(yù)組的胃癌細(xì)胞survivin表達(dá)下調(diào)，caspase-3蛋白表達(dá)上調(diào)，并呈劑量依賴性。結(jié)論 褪黑素能夠降低胃癌細(xì)胞survivin的表達(dá)，進(jìn)而激活caspase-3的活性，是褪黑素體外抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用機(jī)制之一。

褪黑素；胃癌細(xì)胞；生存素；半胱天冬酶-3

胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，大部分地區(qū)仍居惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率之首，胃癌不理想的治療效果主要源于其發(fā)病機(jī)制尚未明確。生存素survivin是凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis proteins，IAPs）家族中分子量最小且結(jié)構(gòu)獨(dú)特的成員，它特異性高表達(dá)于腫瘤組織并通過抑制caspase-3而抑制凋亡，從而有促腫瘤發(fā)展作用。Survivin的表達(dá)下調(diào)可提高腫瘤細(xì)胞的凋亡率和增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性，從而延緩腫瘤生長［1］。褪黑素主要是由哺乳動物的松果體分泌的一種神經(jīng)內(nèi)分泌活性物質(zhì)，隨著對它的深入研究，發(fā)現(xiàn)它對預(yù)防、治療腫瘤和延緩其發(fā)展有一定效果［2］。本文旨在通過建立褪黑素對胃癌細(xì)胞干預(yù)模型，運(yùn)用細(xì)胞免疫組化、實(shí)時熒光定量PCR、免疫印跡法、ELISA、分光光度法等方法檢測褪黑素在抑制胃癌細(xì)胞增殖過程中對細(xì)胞survivin、caspase-3的表達(dá)影響，進(jìn)一步闡明褪黑素體外抑制胃癌細(xì)胞增殖的作用機(jī)制。

材料和方法

1.小鼠MFC前胃癌細(xì)胞株的培養(yǎng)

小鼠MFC前胃癌細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院，培養(yǎng)基為RPMI-1640，含10%胎牛血清（Gibco，Invitrogen公司）。用0.25%胰酶消化30sec，每隔3d細(xì)胞融合時傳代，在37°C，5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

2.實(shí)時熒光定量RT-PCR檢測褪黑素對 MFC細(xì)胞survivin mRNA表達(dá)的影響

稱取褪黑素 （Sigma公司，MW 232.2）0.0232g，用無水乙醇完全溶解，加入培養(yǎng)基稀釋成濃度0.1 mol／L母液。MFC細(xì)胞接種于六孔板，密度3×105個／ml，用2，4，6，8，10mmol／L不同濃度的褪黑素干預(yù)，并設(shè)空白對照組。24h后收集，用Trizol（美國Invitrogen公司）一步法提取總RNA，取RNA 2μg分別逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。Survivin和GAPDH的序列如下：Survivin （306bp）：F 5′-TGGACAGACAGAGAGCCAAGAA-3′， R 5′-TAGAGCAAAGCCACAAACCCAA-3′；GAPDH （231bp）：F 5′-CCGAGAATGGGAAGCTTGTC-3′，R 5′-TTCTCGTGGTTCACACCCAT C-3′。PCR反應(yīng)管中加入1μl cDNA，1μl引物對，ddH2O 6.7μl，DYE 0.3μl，2×BrillionⅡSYBR Green PCR buffer 10μl（美國Stratagene公司），總體積20μl，混勻后置熒光定量 PCR儀（美國Applied Biosystems公司，7500型）進(jìn)行檢測。按下列條件反應(yīng)：95℃預(yù)變性10min，95℃變性30s，60℃延伸1min，共45個循環(huán)。應(yīng)用相對定量的方法進(jìn)行分析：分析各孔的CT值，根據(jù)公式ΔΔCt＝ （Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）實(shí)驗(yàn)組-（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）對照組，算出2-ΔΔCt，用單樣本t檢驗(yàn)方法分析進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。

3.細(xì)胞免疫組化定位檢測MFC細(xì)胞survivin蛋白表達(dá)

將清潔的蓋玻片置于六孔板中，每孔接種3×105個MFC細(xì)胞。細(xì)胞貼壁后吸去培養(yǎng)基，用PBS沖洗5min×3，4%多聚甲醛固定20min，PBS洗后滴加3%H2O210min，PBS洗2min×3。滴加一抗survivin（美國Santa Cruz公司，工作濃度1∶50），室溫孵育2h后PBS洗2min×3。滴加試劑1聚合物工作液15min后PBS洗2min×3，滴加試劑2辣根酶標(biāo)記的抗兔IgG工作液15min后PBS洗2min×3。應(yīng)用DAB溶液顯色20sec，蘇木素復(fù)染，1%鹽酸酒精分化，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

4.免疫印跡法檢測MFC細(xì)胞survivin蛋白表達(dá)變化

褪黑素體外干預(yù)細(xì)胞模型同上，24h后收集細(xì)胞，加入0.5ml裂解液 （RIPA 強(qiáng)裂解液495μl，PMSF蛋白酶抑制劑5μl）中，提取的總蛋白樣品經(jīng)BCA法測定其蛋白濃度，配置15%SDS-PAGE分離膠與5% 濃縮膠，取40μg蛋白上樣，電泳（100 V，1.5h），轉(zhuǎn)膜（100V，45min），轉(zhuǎn)膜后先后與 Western封閉液、抗survivin（1∶200）抗體4℃孵育過夜，再用HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育，運(yùn)用BeyoECL Plus工作液顯色，凝膠成像分析。

5.分光光度法檢測褪黑素對細(xì)胞裂解上清caspase-3濃度的影響

根據(jù)檢測試劑盒說明書（南京凱基生物技術(shù)公司）進(jìn)行操作，主要步驟如下：用以上濃度褪黑素對細(xì)胞干預(yù)24h后，收集細(xì)胞，PBS洗兩次，收集3-5×106細(xì)胞數(shù)。加50μl細(xì)胞裂解液冰上裂解60 min，4℃12000g離心1min，吸上清待測。并用常規(guī)BCA法測定其中蛋白濃度。取待測液50μl與50μl 2×反應(yīng)液混合。加入5μl caspase-3底物于37℃避光孵育4h，405nm波長測光吸收值。通過計算OD誘導(dǎo)劑／OD陰性對照的 倍 數(shù) 來 確 定 凋 亡 誘 導(dǎo) 組 的caspase-3活化程度，并以50μl細(xì)胞裂解液＋50μl 2×反應(yīng)液為空白對照組。

6.統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，所有數(shù)據(jù)行單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，有關(guān)實(shí)時熒光定量PCR檢測基因水平變化的數(shù)據(jù)用單樣本t檢測，均以P＜0.05為有顯著性差異。

結(jié) 果

1.MFC細(xì)胞的survivin蛋白表達(dá)

免疫組化染色結(jié)果顯示，MFC細(xì)胞的survivin蛋白表達(dá)分布在胞質(zhì)，核不著色。圖A、B、D可見胞質(zhì)有明顯黃色顆粒，圖C為陰性對照，可見核被蘇術(shù)素染成紫藍(lán)色，胞質(zhì)無黃色顆粒，其中圖D顯示細(xì)胞無蘇木素復(fù)染。

2.褪黑素對MFC細(xì)胞survivin基因表達(dá)的影響

Survivin基因主要功能是抗凋亡，實(shí)時熒光定量RT-PCR檢測結(jié)果如圖2所示：與空白對照組相比，8、10mmol／L褪黑素組survivin mRNA 表達(dá)開始明顯下降，差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

3.褪黑素對MFC細(xì)胞Survivin蛋白表達(dá)的影響

凋亡抑制蛋白survivin由142個氨基酸組成，分子量為16.5kD。免疫印跡法檢測結(jié)果如圖3所示：圖A為各組MFC細(xì)胞表達(dá)的survivin條帶。圖B顯示與空白對照組相比，從6mmol／L褪黑素組起survivin表達(dá)明顯下降，差別有統(tǒng)計學(xué)意義P＜0.05。

4.褪黑素對細(xì)胞上清Caspase-3濃度的影響

Caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵酶及終末執(zhí)行酶，結(jié)果如圖4所示，MFC細(xì)胞用不同濃度褪黑素干預(yù)后細(xì)胞裂解上清的caspase-3蛋白含量從褪黑素6mmol／L濃度開始上調(diào)，并呈劑量依賴性，且差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 MFC細(xì)胞的survivin蛋白定位表達(dá)。C為陰性對照，D顯示細(xì)胞無蘇木素復(fù)染，（A：×200，B.C.D：×400）。Fig.1 Expression and location of survivin protein in MFC cell.C shows negative control，D shows cells were not restrained with hematoxylin，（A：×200，B.C.D：×400）.

圖2 褪黑素對細(xì)胞survivin mRNA表達(dá)的影響。與空白對照組相比，＊P＜0.05。Fig.2 Effect of melatonin on the survivin mRNA expression of MFC cell.＊P＜0.05vs Blank control.

圖3 褪黑素對細(xì)胞survivin蛋白表達(dá)的影響。與空白

圖4 褪黑素對MFC細(xì)胞裂解上清的caspase-3含量影響。與空白對照組相比，＊P＜0.05。Fig.4 Effect of melatonin on the concentration of caspase-3in the cell culture supernatant（A）and lysate supernatant（B）.＊P＜0.05vs Blank control.

討 論

大量前期研究證實(shí)［3-7］褪黑素體外能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞株增殖，如乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、骨髓瘤、前列腺癌以及惡性皮膚黑色素瘤細(xì)胞株等等。生存素survivin于1997年由Ambrosini等［8］從人類基因庫雜交篩選中首先分離得到，它是目前已知作用最強(qiáng)的凋亡抑制蛋白，通過直接抑制caspase-3的活性，從而阻斷由各種刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的共同通路。Survivin主要在細(xì)胞周期的G2／M期選擇性地表達(dá)，Li等［9］對survivin轉(zhuǎn)染的 Hela細(xì)胞株細(xì)胞周期的各時段表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，它的轉(zhuǎn)錄活性在G2／M期增加3.5-5倍，因此survivin是一種具有細(xì)胞周期依賴性表達(dá)和抗凋亡雙重作用的蛋白質(zhì)。Yao等［10］發(fā)現(xiàn)胃癌患者survivin高表達(dá)，與其預(yù)后不良呈正相關(guān)，它的表達(dá)下調(diào)可增加胃癌細(xì)胞的凋亡［11］。Fu［12］等通過向人胃癌裸鼠移植瘤模型注射survivin反義寡核苷酸觀察其對胃癌移植瘤的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)survivin表達(dá)下調(diào)并抑制了裸鼠胃癌移植瘤的生長。本課題組前期研究［13］也發(fā)現(xiàn)在褪黑素抑制荷胃癌小鼠的移植瘤過程中，胃癌組織中survivin的表達(dá)水平下降，表明褪黑素體內(nèi)具有下調(diào)胃癌細(xì)胞survivin表達(dá)的作用。盧啟明等［14］用小干擾RNA沉默人胃癌SGC-7901細(xì)胞survivin的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)下調(diào)survivin可以在體外顯著抑制腫瘤細(xì)胞的生長。本研究同樣也發(fā)現(xiàn)褪黑素體外抑制小鼠MFC胃癌細(xì)胞增殖過程中，從6mmol／L濃度的褪黑素就能明顯下調(diào)腫瘤細(xì)胞的survivin蛋白表達(dá)，而前期研究發(fā)現(xiàn)也是從6mmol／L濃度褪黑素組的胃癌細(xì)胞G2／M期發(fā)生阻滯［15］，可能與survivin表達(dá)減少有關(guān)。因?yàn)閟urvivin過度表達(dá)，細(xì)胞失去了正常的增殖周期中“凋亡開關(guān)”的限制，造成細(xì)胞增殖與凋亡平衡打破，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。

天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶家族caspase家族是一組調(diào)控哺乳動物細(xì)胞凋亡的蛋白酶，簡稱半胱天冬酶 （cysteinyl aspartate-specific protease，caspase）。其中caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵酶，它是細(xì)胞凋亡過程中終末執(zhí)行酶。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，caspase-3活化的兩條途徑都可被survivin抑制，且與胃癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［16-17］。正常情況下caspase-3以酶原的形式存在，沒有活性，凋亡階段被激活?；罨痗aspase-3由兩個大亞基和兩個小亞基組成，裂解相應(yīng)胞漿胞核底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。分光光度法檢測是將caspase-3序列特異性的多肽偶聯(lián)至發(fā)色集團(tuán)，底物被剪切后，發(fā)色集團(tuán)游離，通過酶標(biāo)儀檢測OD值，觀察caspase-3的活化程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞裂解上清的caspase-3蛋白從褪黑素6mmol／L濃度開始上調(diào)，并呈劑量依賴性，與MFC細(xì)胞從褪黑素6mmol／L濃度開始出現(xiàn)凋亡，survivin基因表達(dá)下調(diào)的結(jié)果相對應(yīng)。且本課題組前期研究［18］也發(fā)現(xiàn)在褪黑素抑制荷胃癌小鼠的移植瘤過程中，外周血清中caspase-3的表達(dá)明顯上調(diào)。

總之，褪黑素體外抑制小鼠MFC胃癌細(xì)胞的增殖過程中，降低MFC胃癌細(xì)胞survivin基因的表達(dá)，進(jìn)而激活caspase-3的活性，是褪黑素體外抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用機(jī)制之一。

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Effect of melatonin on survivin and caspase-3 expression in murine foregastric cancer cells

Liu Hui，Gong Xi，Xu Li，Jiang Jihao，Zhou Ruixiang＊
（Department of Human Anatomy ＆ Histology and Embryology，Neurobiology Research Center，F(xiàn)ujian Medical University，F(xiàn)uzhou350004，China）

Objective To investigate the effect of melatonin on survivin and caspase-3expression in murine foregastric cancer（MFC）cells.Methods MFC cells were treated with different concentrations of melatonin，and then we used immunocytochemistry，real-time fluorescence quantitative PCR，Western blot，spectrophotometry and other methods to detecte the effect of MLT on the cytokines of survivin and caspase-3expression in MFC cells during their proliferation.Results Compared with the blank control，the 6mmol／L concentration of MLT down-regulated the expression of survivin and up-regulated caspase-3expression in a dose dependent manner.Conclusion MLT can down-regulate the expression of survivin and activate the activity of caspase-3protein in MFC cells，which is one of the anti-tumer mechanisms of melatonin in vitro.

Melatonin；Gastric cancer cell；Survivin；Caspase-3

R735.2

A

10.3870／zgzzhx.2011.06.002

2011-04-15

2011-07-10

國家自然科學(xué)基金資助（30971541）；福建省科技廳重點(diǎn)項目（2009Y0023）；福建醫(yī)科大學(xué)校苗圃基金資助（2010MP024）。

劉卉，女（1978年），漢族，講師。

＊通訊作者（To whom correspondence should be addressd）