王燕華(綜述)，曲軍英(審校)

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，福州350004)

干細(xì)胞是一類具有高度增殖、自我更新和分化潛能的細(xì)胞，分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞為囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，具有高度自我更新和全能性，能夠分化為三個胚層的各種細(xì)胞［1］。成體干細(xì)胞是一類位于很多組織器官中的一小群細(xì)胞，也稱為祖細(xì)胞，其可通過不對稱分裂進(jìn)行自我更新和產(chǎn)生不同譜系的子細(xì)胞［2］。由于人子宮內(nèi)膜干細(xì)胞在現(xiàn)實研究中受到限制，小鼠子宮內(nèi)膜干細(xì)胞研究可能成為一個重要的研究模型。

1 小鼠子宮內(nèi)膜干細(xì)胞鑒別與定位技術(shù)

在干細(xì)胞鑒別與定位常用的技術(shù)中最常用的是標(biāo)記滯留細(xì)胞技術(shù)。標(biāo)記滯留細(xì)胞技術(shù)是利用溴脫氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine，BrdU)標(biāo)記細(xì)胞，在DNA復(fù)制過程中攝取BrdU為合成原料而標(biāo)記細(xì)胞，利用DNA半保留復(fù)制的特點，在注入BrdU后的追蹤過程中快速增殖的細(xì)胞將稀釋甚至丟失標(biāo)記，由于干細(xì)胞有慢細(xì)胞周期和半保留復(fù)制等特點，細(xì)胞內(nèi)將仍保留有BrdU標(biāo)記，通過用特異性的抗BrdU抗體，檢測到的BrdU滯留細(xì)胞有可能是成體干細(xì)胞［3］。由于BrdU標(biāo)記后對子宮內(nèi)膜干細(xì)胞定位和定量是通過免疫組織化學(xué)技術(shù)反應(yīng)進(jìn)行的，因此其不適用活體子宮內(nèi)膜干細(xì)胞研究，且其定量受到免疫組化過程中各種因素的影響，不能準(zhǔn)確地反映實際子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的量。

Hoechst 33342-SP法是近年來廣泛用于篩選成體干細(xì)胞的一種方法。Hoechst 33342是一種能與 DNA特異性結(jié)合的熒光染料，癌細(xì)胞［4］和 干 細(xì) 胞［5］可 以 將Hoeehest 33342排出細(xì)胞，表現(xiàn)為細(xì)胞核不著色或者低程度著色，利用流式細(xì)胞儀可以將這些不著色細(xì)胞加以分離，人們將這種可以排除Hoechest 33342的特性稱為SP表型，將利用該特性分離的這部分細(xì)胞稱為SP細(xì)胞［6］，Hoechst 33342-SP法可用于研究小鼠子宮內(nèi)膜干細(xì)胞［7］，也可用于研究人子宮內(nèi)膜干細(xì)胞［8］，但都只適用于體外研究，不適用于干細(xì)胞體內(nèi)細(xì)胞定位。

2 小鼠子宮內(nèi)膜干細(xì)胞在子宮內(nèi)膜的定位

子宮內(nèi)膜干細(xì)胞常處于靜止期(G0期)，位于保護(hù)的微環(huán)境中，這種環(huán)境稱為“壁龕”［9］。隨著細(xì)胞的分裂分化，子宮內(nèi)膜干細(xì)胞在子宮內(nèi)膜的位置將發(fā)生變化。Cervelló等［10］研究發(fā)現(xiàn)，出生3 d的小鼠注射BrdU后追蹤，注射后7 d，所有上皮和間質(zhì)細(xì)胞均表達(dá)BrdU，隨后在小鼠青春期前(21～49 d)BrdU陽性細(xì)胞劇減，21 d時，所有上皮細(xì)胞均丟失BrdU，表達(dá)BrdU的間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量劇減，到成年(49 d)后，只有少量位于內(nèi)膜基層連接處，血管周圍旁邊的間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)BrdU。

有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)后小鼠子宮內(nèi)膜具有更多的干/祖細(xì)胞(SP細(xì)胞)，其用Hoechst 33342-SP法在產(chǎn)后第1、3、7、14、17．5、21、28 天的小鼠內(nèi)膜中均可測得SP細(xì)胞群，其含量隨產(chǎn)后時間的延長呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在產(chǎn)后17．5 d子宮內(nèi)膜中SP細(xì)胞群達(dá)到最大含量，隨后逐漸下降，在產(chǎn)后60 d幾乎無法測得，原因可能為分娩過程中子宮內(nèi)膜受損所致［6，11］。因此，認(rèn)為產(chǎn)后是子宮內(nèi)膜干細(xì)胞生理性募集的時間點，在這一時期，某些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)啟動細(xì)胞募集、增殖、分化，重建完整的組織;但在研究中并未對這些干/祖細(xì)胞在子宮內(nèi)膜中的定位進(jìn)行分析。

3 子宮內(nèi)膜干細(xì)胞表面標(biāo)志

目前尚未發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜干細(xì)胞表達(dá)特異性標(biāo)記。與人子宮內(nèi)膜干細(xì)胞一樣，小鼠子宮內(nèi)膜干細(xì)胞也表達(dá)未分化的干細(xì)胞標(biāo)志。Szotek等［2］研究發(fā)現(xiàn)，小鼠子宮內(nèi)膜干細(xì)胞表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志(干細(xì)胞抗原1、sca-1)、內(nèi)皮標(biāo)志CD31、成纖維細(xì)胞標(biāo)志平滑肌激動因子α、雌激素受體α，不表達(dá)造血細(xì)胞標(biāo)志CD45。Cervelló等［10］研究發(fā)現(xiàn)，小鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞表達(dá)未分化標(biāo)志c-Kit和POU5F1(一種核轉(zhuǎn)錄因子)。而Chan等［12］研究發(fā)現(xiàn)，小鼠子宮內(nèi)膜干細(xì)胞表達(dá)干細(xì)胞抗原 1、CD31、CD45、Ki-67(增殖標(biāo)志)、雌激素受體α、平滑肌激動因子α，不表達(dá)c-Kit。總之，子宮內(nèi)膜干細(xì)胞表面標(biāo)志目前尚無統(tǒng)一定論，眾多學(xué)者仍致力于此方面的研究。

4 子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

胡菲菲等［6］從生育期小鼠四個動情期(動情前期、動情期、動情后期、動情間期)和產(chǎn)后小鼠子宮內(nèi)膜分離干細(xì)胞，并比較從這些小鼠子宮內(nèi)膜中分離出的子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的量，首先用酶法獲得子宮內(nèi)膜細(xì)胞，再用Hoechst 33342染色，維拉帕米阻止細(xì)胞內(nèi)Hoechst 33342排出，再用流式細(xì)胞儀熒光活化分選系統(tǒng)將被染色細(xì)胞分選出來培養(yǎng)，結(jié)果從未孕小鼠四個動情期均未分離出干細(xì)胞，而能從產(chǎn)后小鼠子宮內(nèi)膜中分離出干細(xì)胞，其原因為正常動情期鼠子宮內(nèi)膜干細(xì)胞較少，Hoechst 33342-SP法不能靈敏地將其分離出來。分離獲得的子宮內(nèi)膜干細(xì)胞采用有限稀釋法培養(yǎng)，培養(yǎng)液成分為dulbecco modified eagle medium(DMEM)/Ham's，10% 胎牛血清，1%青/鏈霉素，培養(yǎng)15 d后見細(xì)胞克隆，并認(rèn)為添加上皮生長因子和17β雌二醇對小鼠子宮內(nèi)膜干細(xì)胞體外培養(yǎng)并不能增加其克隆形成率，且雌激素在體外有促進(jìn)腺體克隆細(xì)胞分化的作用。有研究發(fā)現(xiàn)上皮生長因子在一定濃度范圍內(nèi)可促進(jìn)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞生長［13］。Komatsu 等［14］研究發(fā)現(xiàn)，上皮生長因子和轉(zhuǎn)錄生長因子α可刺激子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞生長，但對這種促進(jìn)作用產(chǎn)生的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路并未闡明。小鼠子宮內(nèi)膜干細(xì)胞體外培養(yǎng)目前是比較新的研究領(lǐng)域，對于內(nèi)膜干細(xì)胞分離培養(yǎng)技術(shù)、細(xì)胞因子添加的種類和量及其作用機(jī)制目前尚無統(tǒng)一的研究結(jié)果。

5 小鼠子宮內(nèi)膜干細(xì)胞體外培養(yǎng)分化

Meng等［15］研究發(fā)現(xiàn)，從人的月經(jīng)血中收集子宮內(nèi)膜干細(xì)胞在體外培養(yǎng)，用完全DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜貼壁后，更換成成骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)21 d可誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞;換成肝細(xì)胞和胰腺細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基，并添加肝細(xì)胞生長因子、纖維母細(xì)胞等細(xì)胞因子培養(yǎng)30 d，可誘導(dǎo)成肝細(xì)胞和胰腺細(xì)胞;培養(yǎng)過夜貼壁后，用含有5-氮雜胞苷的DMEM處理24 h后，用添加有骨骼肌生成因子、纖維母細(xì)胞生長因子等細(xì)胞因子的DMEM培養(yǎng)40 d，可誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞;用完全DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)到細(xì)胞至100%匯合時，更換成脂肪細(xì)胞、肺上皮細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)10 d后可誘導(dǎo)成脂肪細(xì)胞和肺上皮細(xì)胞。Dimitrov等［16］從子宮內(nèi)膜基底層分離子宮內(nèi)膜干細(xì)胞體外培養(yǎng)可形成克隆，將這些細(xì)胞培養(yǎng)與脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基后可誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞。而在小鼠子宮內(nèi)膜干細(xì)胞培養(yǎng)方面，目前尚未有體外誘導(dǎo)分化的報道。

6 結(jié)語

子宮和子宮內(nèi)膜是維持女性生理功能和生育能力的重要器官，子宮內(nèi)膜具有強(qiáng)大的增殖能力。然而，子宮內(nèi)膜極易受流產(chǎn)、感染和內(nèi)分泌影響，而導(dǎo)致增生能力下降，從而嚴(yán)重影響女性的生育能力。同樣，子宮內(nèi)膜增殖能力過度也會導(dǎo)致諸如子宮內(nèi)膜異位癥、功能性子宮出血、子宮內(nèi)膜增生過長、子宮內(nèi)膜癌等諸多疾病，嚴(yán)重影響女性健康和生活質(zhì)量。子宮內(nèi)膜干細(xì)胞研究對于諸如此類的女性生殖健康疾病有著重要意義，可從根本上解決這些問題。人子宮內(nèi)膜干細(xì)胞研究受到很多方面的限制，因此，小鼠模型起著重要的作用。目前，小鼠子宮內(nèi)膜干細(xì)胞研究尚處于初級階段，還有許多尚未解決的問題，因此小鼠子宮內(nèi)膜干細(xì)胞研究具有廣闊的前景。

［1］ Yin Z，Chen X，Chen JL，et al．Stem cells for tendon tissue engineering and regeneration［J］．Expert Opin Biol Ther，2010，10(5):689-700．

［2］ Szotek PP，Chang HL，Zhang L，et al．Adult mouse myometrial label-retaining cells divide in response to gonadotropin stimulation［J］．Stem Cells，2007，25(5):1317-1325．

［3］ Angert D，Berretta RM，Kubo H，et al．Repair of the injured adult heart involves new myocytes potentially derived from resident cardiac stem cells［J］．Circ Res，2011，108(10):1226-1237．

［4］ Zou J，Yu XF，Bao ZJ，et al．Proteome of human colon cancer stem cells:a comparative analysis［J］．World J Gastroenterol，2011，17(10):1276-1285．

［5］ 李紅敏，梅香．大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植在心肌梗死區(qū)長期存活的觀察［J］．中華心血管雜志，2011，39(2):171-175．

［6］ 胡菲菲，劉嘉茵．產(chǎn)后小鼠子宮內(nèi)膜邊緣群干/祖細(xì)胞的分離純化［J］．生殖醫(yī)學(xué)雜志，2008，17(4):281-285．

［7］ Kato K，Takao T，Kuboyama A，et al．Endometrial cancer side-population cells show prominent migration and have a potential to differentiate into the mesenchymal cell lineage［J］．Am J Pathol，2010，176(1):381-392．

［8］ 曲雯雯，汪成孝．人早孕蛻膜組織干細(xì)胞的分離與鑒定［J］．中華醫(yī)學(xué)雜志，2008，88(33):2369-2371．

［9］ Cervello I，Simon C．Somatic stem cells in the endometrium［J］．Reprod Sci，2009，16(2):200-205．

［10］ Cervelló I，Martínez-Conejero JA，Horcajadas JA，et al．Identification，characterization and co-localization of label-retaining cell population in mouse endometrium with typical undifferentiated markers［J］．Human Reproduction，2007，20(1):45-51．

［11］ Hu FF，Xu J，Cui YG，et al．Isolation and characterization of side population cells in the postpartum murine endometrium［J］．Reprod Sci，2010，17(7):629-642．

［12］ Chan RW，Gargett CE．Identification of label-retaining cells in mouse endometrium［J］．Stem Cells，2006，24(6):1529-1538．

［13］ Shiraga M，Komatsu N，Teshigawara K，et al．Epidermal growth factor stimulates proliferation of mouse uterine epithelial cells in primary culture［J］．Zoolog Sci，2000，17(5):661-666．

［14］ Komatsu N，Maekawa T，Takeuchi S，et al．Epidermal growth factor and transforming growth factor-alpha stimulate the proliferation of mouse uterine stromal cells［J］．Zoolog Sci，2003，20(5):639-645．

［15］ Meng X，Ichim TE，Zhong J，et al．Endometrial regenerative cells:a novel stem cell population［J］．J Transl Med，2007，5:57．

［16］ Dimitrov R，Timeva T，Kyurkchiev D，et al．Characterization of clonogenic stromal cells isolated from human endometrium［J］．Reproduction，2008，135(4):551-558．