趙仙華

（丹陽市第二人民醫(yī)院，江蘇 丹陽 212300）

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

Salmonella enterica serovar Typhi GIFU10007野生株和phoP 缺陷株，Escherichia coli SPY372λpir，Escherichia coli DH5α。

1.1.2 引物

在mig－14基因上游和下游設(shè)計兩對特異性PCR引物：P1A／P1B和P2A／P2B。根據(jù)treC，eutG和otsB 基因序列設(shè)計RT－PCR引物。

1.1.3 主要試劑

限制性內(nèi)切酶BglII、BamHI、T4DNA Ligase、堿性磷酸酶、Ex Taq、dNPT、Ex Taq Buffer、RNase H、X－Gal、DL2000。

1.1.4 主要儀器

PCR儀，高速冷凍離心機，凝膠成像及分析系統(tǒng)，核酸檢測儀，電穿孔儀，電熱恒溫干燥箱，超純水分離系統(tǒng)：PL5243（PALL），超低溫冰箱，GenePix Personal 4100A 芯片掃描儀。

1.2 方法與步驟

1.2.1 基因芯片分析實驗

先將傷寒沙門菌野生株和mig－14缺陷株分別接種于1mL的低滲的LB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，次日以1：100轉(zhuǎn)種于30mL高滲的LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)3～4h至對數(shù)生長期。然后在冰上放置20min后離心收集菌體，按照QIAGEN RNA提取試劑盒的方法提取細菌總RNA，分析總RNA的質(zhì)量；再用DNaseI消化痕量的DNA后，在－70℃條件下保存待用。隨后按照文獻中的方法進行RNA逆轉(zhuǎn)錄和cDNA熒光標(biāo)記、RNA的滅活、cDNA的純化以及芯片預(yù)雜交和數(shù)據(jù)分析的步驟。

1.2.2 RT－PCR實驗

先將傷寒沙門菌野生株和mig－14缺陷株分別接種于1mL的LB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，次日以1：100轉(zhuǎn)種于30mL的LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)3～4h至對數(shù)生長期，然后在冰上放置20min后離心收集菌體，按照QIAGEN RNA提取試劑盒的方法提取細菌總RNA，分析總RNA的質(zhì)量，再用DNaseI消化痕量的DNA后，在－70℃條件下保存待用，隨后按照文獻中的方法進行RT－PCR逆轉(zhuǎn)錄，將反應(yīng)體系放PCR儀器上擴增。

2 結(jié)果

2.1 基因芯片分析結(jié)果

采用GenePix Pro6.0軟件，對全基因組芯片分析結(jié)果進行圖片處理和數(shù)據(jù)分析，計算每個點雜交后不同熒光物質(zhì)標(biāo)記所得信號比值，以log（2）Ratio值描述結(jié)果，?。?和1（表達1倍差異）作為閾值?？梢钥闯?，mig－14缺陷后受影響的基因較多，但比值普遍較低。

2.2 RT－PCR結(jié)果

從基因芯片分析結(jié)果表中選擇幾個基因做實時熒光定量PCR分析，以進一步確證它們受mig－14的影響情況。RT－PCR結(jié)果與基因芯片的結(jié)果基本一致。

3 討論

傷寒沙門菌是腸侵染性病原菌，在侵入宿主時會遭受各種環(huán)境應(yīng)激。食物和小腸中的NaCl濃度分別約為50和300mM。在高滲應(yīng)激早期，我們利用基因芯片技術(shù)分析mig－14缺陷株的全基因組表達變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)約140個基因的表達受到mig－14影響。

跨膜的甲基結(jié)合性趨化蛋白（MCPs）當(dāng)感受外界的化學(xué)刺激信號時，位于細胞周質(zhì)空間的MCPs蛋白區(qū)域構(gòu)象發(fā)生變化，并將信號通過胞漿中的連接蛋白CheW傳遞給可溶性的蛋白激酶CheA。CheA自身磷酸化，將磷酸基團轉(zhuǎn)移給反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白CheY，磷酸化的CheY結(jié)合到鞭毛的傳動器蛋白上，使鞭毛由逆時針運動改為順時針運動。CheR和CheB分別是甲基轉(zhuǎn)移酶和甲基酯酶，前者能將甲基團轉(zhuǎn)移給MCPs，后者促使甲基團與MCPs分離。磷酸化的CheA蛋白能誘導(dǎo)CheB的酶活性。cheZ編碼磷酸酶，使CheY－P去磷酸化。MotA和MotB位于膜上，是鞭毛傳動器的定子蛋白，能引導(dǎo)質(zhì)子跨膜運動，質(zhì)子流動為鞭毛提供旋轉(zhuǎn)動力。

鞭毛是沙門菌的運動器官，也是一種重要的致病因子。約有50個基因與鞭毛的結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)，按照轉(zhuǎn)錄等級關(guān)系將這些基因分成3類。它們編碼的產(chǎn)物分別是鞭毛裝配過程中的早中晚期產(chǎn)物，即：Ⅰ類基因flhDC操縱子是Ⅱ類基因的調(diào)節(jié)單元，能激活Ⅱ類基因的轉(zhuǎn)錄；Ⅱ類基因編碼中期產(chǎn)物如鞭毛基底部和彎鉤部以及調(diào)節(jié)子σ28因子（FliA）和σ70因子（FliZ）；Ⅲ類基因主要編碼的是鞭毛絲的組成部分以及和鞭毛動力相關(guān)的蛋白。屬于Ⅲ類基因的有flgN、flgM、flgKL、cheZ、cheY 、cheB、cheR、cheW、cheA、motB、motA、fliC、fliDST。fliAZ與flhDC構(gòu)成正反饋回路，F(xiàn)liZ先激活flhDC，后者又激活fliAZ。與Ⅱ類基因共表達的FlgM是抗σ28因子，能干擾FliA對Ⅲ類基因的激活表達作用。而在鞭毛基底部和彎鉤部裝配完成之后，F(xiàn)lgM能通過生長的鞭毛被分泌到胞外，去除對FliA的阻抑作用。flgK、flgL 和 fliD 編 碼 HAP1，HAP2and HAP3，它們與FliC蛋白單體輸出到胞外及聚合形成鞭毛絲有關(guān)。FliS是FliC特異性的伴侶分子，在胞質(zhì)溶膠中阻礙鞭毛素各亞單位的聚合，能與FliC蛋白C末端無規(guī)則區(qū)結(jié)合，促使FliC蛋白C末端形成穩(wěn)定的α螺旋結(jié)構(gòu)，有利于FliC輸出到胞外。FlgN是Ⅲ型分泌系統(tǒng)的分子伴侶，能與FlgKL相互作用，形成傳感裝置。當(dāng)感受到鞭毛裝配過程進入中期時，F(xiàn)lgN能阻礙FlgM 的翻譯過程，從而釋放FliA，促進FliA對Ⅲ類基因的激活作用。FlgT不僅是Ⅱ類基因的負調(diào)節(jié)因子，也是FliD的分子伴侶，能與FliD結(jié)合，防止FliD寡聚化，更有利于FliD從鞭毛特異性的Ⅲ型分泌系統(tǒng)輸出。

本次芯片實驗結(jié)果中除了cheY、motB和fliT沒有明顯表達變化外，其他Ⅲ類基因和fliAZ在mig－14缺陷株中均表達量下調(diào)。因此推測mig－14可能對鞭毛裝配的中晚期以及鞭毛的運力有正調(diào)控作用。芯片分析結(jié)果還顯示，在mig－14缺陷株中pagP表達量降低，而ybjX表達量增高，這兩個基因菌與細菌拮抗抗菌肽的殺傷作用有關(guān)。沙門菌的somA與大腸埃希菌中的ybjX有較高的同源性，沙門菌中也有ybjX基因，其功能未知。SomA蛋白是msbB的抑制因子，因此推測ybjX可能與msbB有相似的作用。

本實驗只是通過基因芯片分析，對傷寒沙門菌mig－14基因在高滲應(yīng)激早期對其他基因表達調(diào)控的影響進行了初步探討，有關(guān)mig－14的功能還有待進一步研究。

［1］茅凌翔，朱超望，許化溪，等.傷寒沙門菌phoP基因缺陷變異株的制備［J］.江蘇大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2007，17（2）：145－149.

［2］VALDIVIA R H，S FALKOW.Fluorescence－based isolation of bacterial genes expressed within host cells［J］.Science，1997，277（5334）：2007－2011.

［3］FRASER G M，BENNETT J C Q，HUGHES，C.Substratespecific binding of hook－associated proteins by FlgN and FliT，putative chaperones for flagellum assembly［J］.Mol.Microbiol，1999，32（3）：569－580.