巫劍紅（綜述），代蔭梅（審校）

（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院婦科微創(chuàng)中心，北京 100026）

宮頸癌的發(fā)病率僅次于乳腺癌，居女性惡性腫瘤第2位，是最常見的女性生殖道惡性腫瘤之一［1］。人類乳頭狀瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染被認(rèn)為是宮頸癌病因?qū)W最重要的危險(xiǎn)因素，幾乎存在于所有的宮頸癌中。雖然HPV的感染只是宮頸癌發(fā)生的必需但病因不充分，即在宮頸癌的自然形成過(guò)程中尚需要其他輔助因素的參與，但其誘導(dǎo)宮頸癌變發(fā)生的分子生物學(xué)機(jī)制尚不明確。近年的研究發(fā)現(xiàn)，表觀遺傳學(xué)的改變可能在宮頸癌變發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，這提示通過(guò)檢測(cè)基因的甲基化水平來(lái)進(jìn)行宮頸癌的早期診斷具有重要的臨床意義，DNA甲基化可能作為有效的分子標(biāo)志物應(yīng)用于宮頸癌篩查［2］。現(xiàn)就DNA甲基化與宮頸癌關(guān)系的研究進(jìn)展予以綜述。

1 DNA甲基化與CpG島

DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的重要研究?jī)?nèi)容，其實(shí)質(zhì)是在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNA methytrasferase）的作用下，將S-腺苷甲硫氨酸提供的甲基共價(jià)結(jié)合到胞嘧啶的第5位碳原子上，生成5-甲基胞嘧啶的過(guò)程。幾乎所有的甲基化胞嘧啶殘基都出現(xiàn)在對(duì)稱序列的5'-GC-3'核苷酸（5'-GC-3'nucleotide，CpG）上。在哺乳動(dòng)物基因組中，CpG二核苷酸以兩種形式存在:一種分散于DNA中，約70%以甲基化形式存在，可稱其為甲基化CpG位點(diǎn);另一種是非甲基化的CpG二核苷酸高度聚集在基因的5'端，其范圍為0．5～2．0 kb，富含CG（60%～70%），稱 CpG島（CpG island）。人類基因組中約有45 000個(gè)CpG島，以非隨機(jī)化的方式分布于蛋白編碼基因的啟動(dòng)子和第一外顯子區(qū)域，雖然僅占基因組DNA的1%～2%，但存在于所有管家基因和少量組織特異基因的5'端調(diào)控區(qū)。CpG島在正常組織中處于非甲基化狀態(tài)，而在腫瘤組織中卻被甲基化，這種甲基化狀態(tài)的改變抑制基因轉(zhuǎn)錄，使基因表達(dá)沉默，從而誘發(fā)細(xì)胞癌變，是引起腫瘤發(fā)生的一個(gè)重要因素。

2 DNA異常甲基化與宮頸癌

目前很多研究已經(jīng)在多種腫瘤中證實(shí)腫瘤相關(guān)基因的異常甲基化現(xiàn)象，如p16甲基化是表觀遺傳學(xué)上腫瘤抑制基因失活的典型。近20年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)宮頸癌DNA甲基化的研究也越來(lái)越多，研究中采用了各種各樣的方法分析宮頸脫落細(xì)胞、宮頸活檢組織和血漿樣本，證明了宮頸癌中DNA甲基化現(xiàn)象的普遍存在。

2009年，Wentzensen等［3］對(duì) Medline中的文獻(xiàn)進(jìn)行綜合分析，發(fā)現(xiàn)共有51項(xiàng)研究對(duì)4376例宮頸癌樣本的68種不同基因的甲基化狀態(tài)進(jìn)行了研究，其中在5項(xiàng)或超過(guò)5項(xiàng)的研究中分析了15種基因，7種基因的甲基化頻率在宮頸癌中＞60%，其中死亡相關(guān)蛋白激酶 1（death-associated protein kinase，DAPK1）、細(xì)胞黏附分子1（cell adhesion molecule 1，CADM1）和β視黃酸受體（retinoic acid receptorβ，RAR-β）在整個(gè)研究中始終顯示出甲基化增高。這些數(shù)據(jù)說(shuō)明，在宮頸癌腫瘤組織中基因甲基化現(xiàn)象廣泛存在。不僅如此，研究還發(fā)現(xiàn)，部分基因甲基化的頻率隨著宮頸病變級(jí)別的增加而增加，甲基化基因的數(shù)目也隨著宮頸上皮內(nèi)瘤變程度的加重而增多［4-7］。這提示DNA甲基化發(fā)生于宮頸癌變過(guò)程的早期階段，表觀基因不穩(wěn)定性逐漸增加可能與宮頸病變逐漸加重有關(guān)。但目前研究涉及的有關(guān)基因數(shù)目眾多，研究結(jié)果各異。Feng等［8］采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)（methylation-specific PCR，MSP）技術(shù)研究了319例脫落細(xì)胞樣本中21個(gè)甲基化基因，最后確定了3個(gè)基因（DAPK1、RAR-β和堿性螺旋蛋白基因）對(duì)檢測(cè)宮頸浸潤(rùn)癌和宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅲ的靈敏度和特異度較高，均為95%。Kim等［9］采用巢式MSP技術(shù)檢測(cè)12個(gè)基因的甲基化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RAR-β、堿性螺旋蛋白基因和O-6甲基鳥嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因最能區(qū)別鱗狀細(xì)胞癌/鱗狀上皮內(nèi)高度瘤變（squamous cell carcinomas/high-grade SIL，SCC/HSIL）和鱗狀上皮內(nèi)低度病變/正常宮頸組織（low-grade SIL/normal cervix，LSIL/NC），靈敏度和特異度分別為 78．7% 和 82．2%。Apostolidou 等［10］在HSIL/NC的液基細(xì)胞樣本中，采用熒光定量MSP方法研究了28個(gè)基因，發(fā)現(xiàn)3個(gè)基因（同源盒基因、同源框A11基因和CADM1）的甲基化水平明顯升高，并且證明同源框A11基因可作為液基細(xì)胞樣本的DNA甲基化標(biāo)志物。這些結(jié)果表明，即使同一個(gè)基因，在各項(xiàng)研究中的DNA甲基化水平也相差很大。

上述研究都是隨機(jī)選擇已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的在腫瘤中普遍甲基化的基因，逐個(gè)評(píng)估它們?cè)趯m頸癌及癌前病變中的甲基化狀態(tài)。近年來(lái)，隨著甲基化檢測(cè)的深入開展，涌現(xiàn)出限制性標(biāo)記基因組掃描、甲基化敏感性隨機(jī)引物MSP、甲基化CpG島擴(kuò)增和甲基化基因芯片等高通量檢測(cè)甲基化的新技術(shù)。應(yīng)用這些新技術(shù)可以直接針對(duì)宮頸癌篩選出甲基化變異程度最高的基因。Lai等［11］采用 CpG島芯片技術(shù)在 NC、LSIL、HSIL和SCC樣本中分析基因甲基化狀態(tài)，篩選出了6個(gè)新的甲基化基因:同源盒基因、配對(duì)核基因X1、LIM同源框轉(zhuǎn)錄因子1基因、NK6轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)基因座1、Wilm's腫瘤基因和ONECUT1（one cut homeobox 1），并評(píng)估了這6個(gè)基因的甲基化水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)配對(duì)核基因X1的甲基化變異程度最高，對(duì)于SCC的靈敏度和特異度分別為86%和82%，對(duì)于HSIL/SCC的靈敏度和特異度分別為54%和99%。Wang等［12］采用限制性標(biāo)記基因組掃描技術(shù)檢測(cè)20例SCC和NC的甲基化狀態(tài)，最早篩選出核仁蛋白基因和脂肪瘤高遷移率組融合配偶體4基因在宮頸癌中存在明顯甲基化。Sova等［13］利用表達(dá)芯片篩選浸潤(rùn)性宮頸癌的差異表達(dá)基因，然后分析差異表達(dá)基因的甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)了分泌型富含半胱氨酸酸性蛋白基因、組織因子旁路抑制物2基因、Ras相關(guān)糖尿病基因、分泌型卷曲相關(guān)蛋白1基因、富含半胱氨酸金屬硫蛋白1G基因和15號(hào)染色體開放閱讀框架48基因的甲基化與浸潤(rùn)性宮頸癌相關(guān)。高通量檢測(cè)技術(shù)大大促進(jìn)了宮頸癌早期診斷甲基化標(biāo)志物的篩查工作。但是，目前尚未真正篩選到滿足臨床需要的高特異度敏感診斷標(biāo)記的甲基化基因，仍需要進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)更好、更多的甲基化標(biāo)志物，以提高敏感性和特異性。

3 DNA甲基化在宮頸癌診斷中的臨床應(yīng)用前景

宮頸癌是全世界婦女死亡的主要疾病之一。近年來(lái)細(xì)胞學(xué)篩查大大降低了宮頸癌的發(fā)生率和病死率，但是在可疑微小病灶中，它的敏感性低，重復(fù)率差，尤其對(duì)于宮頸上皮內(nèi)低度病變組織。HPV-DNA和宮頸細(xì)胞學(xué)聯(lián)合檢測(cè)使初步篩查宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅱ及以上的敏感性大大提高。然而，高危HPV檢測(cè)在診斷宮頸上皮內(nèi)瘤變時(shí)雖然具有敏感性，但是缺乏特異性，HPV-DNA檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性幾乎都只提示暫時(shí)性的感染而非浸潤(rùn)性宮頸癌的結(jié)局，許多HPV陽(yáng)性的患者并不發(fā)展為宮頸癌，而是處于雙向發(fā)展趨勢(shì)。因此，需要尋求合適的方法對(duì)HPV-DNA陽(yáng)性患者進(jìn)行分類，以判斷宮頸病變的發(fā)展趨勢(shì)，從而確定下一步的工作是繼續(xù)隨訪還是臨床干預(yù)。

為此，有人提議引進(jìn)DNA甲基化標(biāo)志物來(lái)提高傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)篩查的效果。利用DNA甲基化標(biāo)志物篩查宮頸癌的優(yōu)點(diǎn)是:①DNA甲基化標(biāo)志物性質(zhì)穩(wěn)定，從而使檢測(cè)可行。②可在前一次作細(xì)胞學(xué)檢查的殘留樣本中檢測(cè)，避免患者再次門診，更加方便經(jīng)濟(jì)，減少資源浪費(fèi)。③利用熒光定量MSP方法只需少量腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的DNA片段即可檢測(cè)到DNA甲基化，而用液基細(xì)胞學(xué)方法檢測(cè)時(shí)，因樣本中含有很多正常宮頸細(xì)胞，可能檢測(cè)不到相對(duì)較少的異常細(xì)胞，從這個(gè)角度來(lái)說(shuō)，熒光定量MSP檢測(cè)可能優(yōu)于細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測(cè)［14］。然而，DNA甲基化標(biāo)志物也存在缺陷。作為篩查宮頸癌的一種方法，最重要的先決條件是:①測(cè)量的可靠性，而各種甲基化基因在各項(xiàng)研究中甲基化水平差異很大。②檢測(cè)疾病時(shí)較高的敏感性和特異性，從而有較高的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值。而在Wentzensen等［3］綜合分析的68種基因中，甲基化水平最高的3個(gè)基因（DAPK1、CADM1和RAR-β）在宮頸癌中的平均甲基化率只有30%，因此單個(gè)DNA甲基化基因篩查宮頸癌的特異性并不高。

對(duì)此，有些研究者采用甲基化基因標(biāo)記系列篩選宮頸癌。Wisman等［15］在宮頸癌病例組和正常對(duì)照組的宮頸涂片中采用熒光定量MSP技術(shù)檢測(cè)了12個(gè)基因的甲基化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)降鈣素基因相關(guān)肽基因、雌激素受體基因、組織金屬蛋白酶抑制因子3、腺瘤性結(jié)腸息肉病基因、DAPK和RAR-β的甲基化水平在宮頸癌中明顯高于對(duì)照組。降鈣素基因相關(guān)肽基因、雌激素受體基因、腺瘤性結(jié)腸息肉病基因和DAPK標(biāo)記系列檢測(cè)的靈敏度達(dá)89%，與細(xì)胞形態(tài)學(xué)和高危HPV檢測(cè)的靈敏度（89%和90%）一致，而特異度優(yōu)于細(xì)胞形態(tài)學(xué)和高危HPV檢測(cè)（100%、83% 和68%）。Kahn等［16］采用熒光定量MSP技術(shù)分析了HSIL、LSIL和正常宮頸組織的液基細(xì)胞中免疫球蛋白超家族基因、分泌型富含半胱氨酸酸性蛋白基因、組織因子旁路抑制物2基因和DAPK的甲基化頻率和水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)每個(gè)基因的甲基化頻率在HSIL樣本中都高于LSIL，這4個(gè)基因的甲基化標(biāo)記系列可用于區(qū)分 HSIL和 LSIL/NC。Wentzensen等［3］認(rèn)為 DAPK1、CADM1 和 RAR-β 聯(lián)合檢測(cè)可能是最理想的，還有研究顯示甲基化標(biāo)記系列結(jié)合黏附分子3、人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶基因、紅細(xì)胞膜41L3基因和13號(hào)染色體開放閱讀框架18基因較好［17］。然而，假如這些甲基化標(biāo)志物互相排斥，完全獨(dú)立，或者只是從一定程度上關(guān)聯(lián)，都會(huì)影響標(biāo)志物系列的覆蓋范圍，從而對(duì)標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)的敏感性產(chǎn)生重要影響。因此，如果沒有經(jīng)過(guò)正式的評(píng)估和標(biāo)準(zhǔn)方法的驗(yàn)證，這些都是不確定的。Lai等［11］實(shí)驗(yàn)中同時(shí)對(duì)宮頸拭子進(jìn)行HPV和配對(duì)核基因X1檢測(cè)比單獨(dú)進(jìn)行HPV檢測(cè)提高了HSIL/SCC檢測(cè)的靈敏度（從60%到80%），而特異度變化不大（63%和64%），這說(shuō)明，采用HPV和DNA甲基化聯(lián)合檢測(cè)，高敏感性和高陽(yáng)性預(yù)測(cè)值的檢測(cè)相結(jié)合的方法是最理想的。從臨床意義上來(lái)說(shuō)，對(duì)HPV檢查結(jié)果陽(yáng)性的患者，進(jìn)一步進(jìn)行DNA甲基化檢測(cè)，可以篩查出一部分HPV陽(yáng)性卻沒有嚴(yán)重宮頸病變的患者，減少陰道鏡活檢的傷害［18，19］。

Widschwendter等［20］首次在宮頸癌患者的血清樣本中檢測(cè)降鈣素基因相關(guān)肽基因、人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶基因、肌原決定基因、孕酮受體基因和組織金屬蛋白酶抑制因子3的甲基化狀態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血漿DNA中肌原決定基因沒有甲基化的患者比甲基化的患者存活率高，提示血漿中檢測(cè)出的肌原決定基因甲基化可用于宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的預(yù)后標(biāo)志物。Yang等［21］在研究中發(fā)現(xiàn)CADM1的甲基化與宮頸癌的浸潤(rùn)程度和宮頸淋巴血管間隙浸潤(rùn)有關(guān)，提示CADM1在宮頸癌的轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)中有重要作用。這說(shuō)明，DNA甲基化標(biāo)志物不僅可用于宮頸癌的早期診斷，還可用于判斷宮頸癌的腫瘤轉(zhuǎn)移程度、臨床預(yù)后及是否復(fù)發(fā)。

4 展望

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)宮頸癌甲基化的研究已有大量報(bào)道，發(fā)現(xiàn)了一大批基因的甲基化與宮頸癌發(fā)生有關(guān)，但尚未真正篩選出在靈敏度和特異度方面都能滿足臨床需要的甲基化標(biāo)志物。既往的研究多是針對(duì)一種或多種在其他腫瘤中常見的甲基化基因在宮頸癌組織中進(jìn)行表達(dá)評(píng)估，而針對(duì)宮頸癌特異的甲基化基因進(jìn)行全基因組的系統(tǒng)篩選的研究甚少。因此，需要開展新的平臺(tái)來(lái)檢測(cè)大量的CpG島DNA甲基化位點(diǎn)，從而發(fā)現(xiàn)更好更多的宮頸癌DNA甲基化標(biāo)志物，并通過(guò)獨(dú)立樣本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證這些新的標(biāo)志物，以最終確定高特異度的敏感診斷標(biāo)記。從經(jīng)濟(jì)效益和可行性考慮，未來(lái)宮頸癌的人群篩查方法可能是建立在HPV聯(lián)合DNA甲基化的檢測(cè)系統(tǒng)上，這種聯(lián)合可達(dá)到100%的靈敏度，且特異性高于只用HPV或細(xì)胞學(xué)的方法。另外，甲基化早期診斷在臨床上往往適合于非創(chuàng)傷性的樣本?？傊?，采用全基因組篩選宮頸癌甲基化基因的方法，找到最適合的甲基化標(biāo)志物，進(jìn)而在宮頸涂片樣本中檢測(cè)宮頸癌甲基化標(biāo)志物是未來(lái)的研究方向。宮頸癌DNA甲基化標(biāo)志物將為臨床宮頸癌的早期診斷和治療提供新的思路和方法。

［1］Parkin DM．Global cancer statistics in the year 2000［J］．Lancet Oncol，2001，2（9）:533-543．

［2］Widschwendter A，Gattringer C，Ivarsson L，et al．Analysis of aberrant DNA methylation and human papillomavirus DNA in cervicovaginal specimens to detect invasive cervical cancer and its precursors［J］．Clin Cancer Res，2004，10（10）:3396-3400．

［3］Wentzensen N，Sherman ME，Schiffman M，etal．Utility ofmethylation markers in cervical cancer early detection:Appraisal of the state-of-the-science［J］．Gynecol Oncol，2009，112（2）:293-299．

［4］Shivapurkar N，Sherman ME，Stastny V，et al．Evaluation of candidatemethylation markers to detect cervical neoplasia［J］．Gynecol Oncol，2007，107（3）:549-553．

［5］LiMEH，Ng SL，Li JL，et al．Cervical dysplasia:Assessingmethylation status（Methylight）of CCNA1，DAPK1，HS3ST2，PAX1 and TFPI2 to improve diagnostic accuracy［J］．Gynecol Oncol，2010，119（2）:225-231．

［6］Lai HC，Lin YW，Huang RL，et al．Quantitative DNA methylation analysis detects cervical intraepithelial neoplasms type3 and worse［J］．Cancer，2010，116（18）:4266-4274．

［7］Henken FE，Wilting SM，Overmeer RM，et al．Sequential gene promoter methylation during HPV-induced cervical carcinogenesis［J］．Brit JCancer，2007，97（10）:1457-1464．

［8］Feng QH，Balasubramanian A，Hawes SE，etal．Detection of hypermethylated genes in women with and without cervical neoplasia［J］．JNatl Cancer Inst，2005，97（4）:273-282．

［9］KiMJH，Choi YD，Lee JS，et al．Assessment of DNA methylation for the detection of cervical neoplasia in liquid-based cytology specimens［J］．Gynecol Oncol，2010，116（1）:99-104．

［10］Apostolidou S，Hadwin R，BurnellM，etal．DNAmethylation analysis in liquid-based cytology for cervical cancer screening［J］．Int J Cancer，2009，125（12）:2995-3002．

［11］Lai HC，Lin YW，Huang TH，et al．Identification of novel DNA methylation markers in cervical cancer［J］．Int JCancer，2008，123（1）:161-167．

［12］Wang SS，Smiraglia DJ，Wu YZ，et al．Identification of novelmethylation markers in cervical cancer using restriction landmark genomic scanning［J］．Cancer Res，2008，68（7）:2489-2497．

［13］Sova P，F(xiàn)eng Q，Geiss G，et al．Discovery of novelmethylation biomarkers in cervical carcinomaby global demethylation andmicroarray analysis［J］．Cancer EpideMBiomar，2006，15（1）:114-123．

［14］Reesink N，Wisman G，Jeronimo C，et al．Detecting cervical cancer by quantitative promoter hypermethylation assay on cervical scrap-ings:a feasibility study［J］．Mol Cancer Res，2004，2（5）:289-295．

［15］Wisman GB，Nijhuis ER，Hoque MO，et al．Assessment of gene promoter hypermethylation for detection of cervical neoplasia［J］．Int JCancer，2006，119（8）:1908-1914．

［16］Kahn SL，Ronnett BM，Gravitt PE，et al．Quantitative methylationspecific PCR for the detection of aberrant DNA methylation in liquid-based pap tests［J］．Cancer Cytopathol，2008，114（1）:57-64．

［17］Eijsink J，Yang N，Lendvai A，et al．Detection of cervical neoplasia by DNA methylation analysis in cervico-vaginal lavages，a feasibility study［J］．Gynecol Oncol，2011，120（2）:280-283．

［18］Lin CJ，Lai HC，Wang KH，et al．Testing for methylated PCDH10 orWT1 is superior to the HPV test in detecting severe neoplasms（CIN3 or greater）in the triage of ASC-USsmear results［J］．AMJ Obstet Gynecol，2011，204（1）:e12-e13．

［19］Hesselink AT，Haideman DA，Steenbergen RD，et al．Combined promotermethylation analysis of CADM1 and MAL:An objective triage tool for high-risk human papillomavirus DNA-positivewomen［J］．Clin Cancer Res，2011，17（8）:2459-2465．

［20］Widschwendter A，Müller HM，F(xiàn)iegl H，et al．DNA methylation in seruMand tumorsof cervical cancer patients［J］．Clin Cancer Res，2004，10（2）:565-571．

［21］Yang N，Nijhuis ER，Volders HH，et al．Gene promotermethylation patterns throughout the process of cervical carcinogenesis［J］．Cell Oncol，2010，32（1/2）:131-143．