張品品，王 愷

（黃河水利職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 開(kāi)封 475003）

0 引言

DNA 芯片技術(shù)是20 世紀(jì)90 年代中期以來(lái)影響最深遠(yuǎn)的重大科技進(jìn)展之一，是物理學(xué)、微電子學(xué)與分子生物學(xué)綜合交叉形成的高新技術(shù)[1]。它隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃研究的進(jìn)展應(yīng)運(yùn)而生，但它的應(yīng)用已不再局限于人類(lèi)基因組的研究。目前，人類(lèi)、小鼠、布氏錐蟲(chóng)[2]和惡性瘧原蟲(chóng)[3]等多種生物的基因組圖譜已經(jīng)完成， 基因組計(jì)劃已經(jīng)進(jìn)入了功能基因?qū)W研究的時(shí)期， 充分利用各種基因組圖譜資源進(jìn)行功能基因的研究，成為基因組學(xué)研究新的熱點(diǎn)。 而DNA 芯片在研究基因的結(jié)構(gòu)和表達(dá)中有快速高效的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，使其成為“后基因組時(shí)代”基因功能分析研究的最重要技術(shù)之一[4]。

1 DNA 芯片技術(shù)

DNA 芯片也稱(chēng)DNA 陣列、寡核苷酸陣列等，是生物芯片技術(shù)中發(fā)展最成熟和最先實(shí)現(xiàn)商品化的產(chǎn)品，是基于核酸探針互補(bǔ)雜交技術(shù)原理研制而成的。與傳統(tǒng)的核酸印記雜交方法相比，DNA 芯片檢測(cè)技術(shù)具有高通量、多參數(shù)同步分析、快速全自動(dòng)分析、高精確度和高靈敏度分析等顯著特征[5]。

1.1 DNA 芯片的工作原理

DNA 芯片檢測(cè)的基本原理是，將已知的核酸片段固定在一定的固相支持物表面，制成核酸探針，利用堿基互補(bǔ)原理，使其與待測(cè)DNA 樣品進(jìn)行雜交反應(yīng)，從而得到我們需要的生物學(xué)信息。其工作原理如圖1 所示。

1.2 DNA 芯片的制備

圖1 DNA 芯片技術(shù)的原理Fig.1 DNA chip technology principal

DNA 芯片種類(lèi)很多，制備方法也不盡相同，但基本上可分為原位合成法和直接點(diǎn)樣法兩大類(lèi)。 原位合成法指在固相支持物（如：玻璃、瓷片、聚丙烯膜等）表面原位合成寡核苷酸探針。直接點(diǎn)樣法是將預(yù)先制備好的寡核苷酸或cDNA 通過(guò)自動(dòng)點(diǎn)樣裝置點(diǎn)于固相支持物上[6]。與原位合成法相比，它比較簡(jiǎn)單，多用于制備大片段DNA。原位合成法制備DNA 芯片，主要通過(guò)光刻法和壓電打印法（也稱(chēng)噴印法）兩種途徑。光刻法只能用來(lái)合成30 nts 左右的寡核苷酸，且每步縮合率較低，約為95%，合成30 nts 寡核苷酸探針的產(chǎn)率僅20%；而壓電打印法可以合成40～50 nts左右的寡核苷酸，每步縮合率可達(dá)99% 以上，合成30 nts 寡核苷酸探針的產(chǎn)率可達(dá)74%，其特異性應(yīng)比光刻法高。另外，壓電打印法制備寡核苷酸探針不需要特殊的合成試劑， 比光刻法具有更高的應(yīng)用價(jià)值。

1.3 樣品制備、雜交和檢測(cè)

對(duì)用于制備芯片的DNA 或RNA 樣品， 通常要先對(duì)其靶序列進(jìn)行高效而特異的擴(kuò)增， 待擴(kuò)增產(chǎn)物純化后再進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記可采用放射性標(biāo)記、生物素標(biāo)記或熒光標(biāo)記等不同的方式， 目前多用熒光標(biāo)記法。 常用的熒光色素有Cy-3、Cy-4 等，也可用雙色熒光對(duì)不同的樣品及對(duì)照進(jìn)行標(biāo)記。 標(biāo)記后的樣品溶于適量的雜交緩沖液中，配成合適的濃度，然后取適量加于DNA 芯片表面，進(jìn)行雜交。 雜交反應(yīng)的條件需根據(jù)組成陣列的序列的長(zhǎng)度、 芯片的用途等進(jìn)行優(yōu)化，不同的雜交強(qiáng)度必須對(duì)應(yīng)不同的序列。如利用DNA 陣列進(jìn)行多態(tài)性分析和測(cè)序，必須考慮一個(gè)基因中外顯子或易突變位點(diǎn)的每一個(gè)核酸的位置。 而用DNA 芯片進(jìn)行基因表達(dá)的研究，則無(wú)須考慮精確的序列，反應(yīng)條件相對(duì)寬松[7]。

雜交信號(hào)的檢測(cè)是DNA 芯片技術(shù)的重要組成部分。雜交信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)主要包括雜交信號(hào)的產(chǎn)生、信號(hào)的收集及傳輸、信號(hào)處理及成像3 部分。芯片在與熒光標(biāo)記過(guò)的樣品雜交后， 經(jīng)SSC 或SSPE 緩沖液清洗，檢測(cè)結(jié)合于芯片上靶基因的熒光信號(hào)，并與對(duì)照進(jìn)行比較，分析處理獲得的有關(guān)生物信息[8]。 目前， 最常用的芯片檢測(cè)系統(tǒng)是激光共聚焦熒光檢測(cè)系統(tǒng)，其主要原理是，與芯片發(fā)生雜交的待測(cè)樣品上的熒光被激發(fā)后，經(jīng)過(guò)棱鏡聚焦，剛好能通過(guò)共聚集小孔，被探測(cè)器檢測(cè)到，而芯片之外的其他熒光信號(hào)則不能被檢測(cè)到。 檢測(cè)到的熒光信號(hào)被計(jì)算機(jī)處理后， 可直接讀出雜交圖譜。 此法靈敏度和精確度較高，但是掃描所需時(shí)間較長(zhǎng)。另一種較常見(jiàn)的檢測(cè)系統(tǒng)采用CCD 攝像原理， 是以CCD 相機(jī)作為信號(hào)接收器的。 其特點(diǎn)是，掃描時(shí)間短，但靈敏度和分辨率較低。 此外，近年來(lái)還產(chǎn)生了多種檢測(cè)方法，如質(zhì)譜法、化學(xué)發(fā)光法和光導(dǎo)纖維法等[9]。

1.4 DNA 芯片結(jié)果的分析與驗(yàn)證

DNA 芯片可以在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中同時(shí)對(duì)幾千個(gè)基因的表達(dá)進(jìn)行分析，但由于自然的復(fù)雜性，產(chǎn)生的數(shù)據(jù)非常多。從這么多的數(shù)據(jù)中選擇出有意義的數(shù)據(jù)，并對(duì)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析， 是非常必要的。DNA 芯片實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析方法一般可分為監(jiān)督方法和非監(jiān)督方法。采用監(jiān)督方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，需要提供一些外部信息，如實(shí)驗(yàn)?zāi)康募皹悠穪?lái)源等。該方法適用于對(duì)與處理因素有關(guān)的關(guān)鍵基因進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，從而簡(jiǎn)潔地對(duì)樣品進(jìn)行分類(lèi)。常用的監(jiān)督方法有：最近鄰法、線(xiàn)性判別分析、分類(lèi)樹(shù)法、機(jī)器學(xué)習(xí)法、支持向量機(jī)技術(shù)等。非監(jiān)督方法主要是指聚類(lèi)分析法，包括：自組圖分析、系統(tǒng)聚類(lèi)分析和逐步聚類(lèi)分析，適用于發(fā)現(xiàn)新的基因轉(zhuǎn)錄變化。

對(duì)DNA 芯片的試驗(yàn)結(jié)果，必須用其他技術(shù)去證實(shí)其準(zhǔn)確性。目前驗(yàn)證DNA 芯片反應(yīng)結(jié)果的技術(shù)有實(shí)時(shí)定量PCR 和蛋白質(zhì)抗體反應(yīng)，前者的應(yīng)用實(shí)例較多[10]。

2 DNA 芯片技術(shù)的應(yīng)用

DNA 芯片技術(shù)本身具有可以對(duì)大量的生物樣品進(jìn)行高通量、快速、精確基因分析的特點(diǎn)。 隨著研究的不斷深入，DNA 芯片制作工藝也不斷發(fā)展，其應(yīng)用領(lǐng)域也不斷拓寬。

2.1 DNA 測(cè)序

將大量已知的核酸探針固化于支持物表面，制成DNA 芯片， 將其與待測(cè)DNA 樣品的靶序列進(jìn)行分子雜交，分析產(chǎn)生的雜交圖譜，從而確定樣品的靶序列， 這一過(guò)程稱(chēng)為DNA 測(cè)序。 當(dāng)待測(cè)DNA 樣品（已經(jīng)進(jìn)行了熒光標(biāo)記）的靶序列與芯片上的核酸探針配對(duì)后，就會(huì)在DNA 芯片表面留下可檢測(cè)的熒光斑點(diǎn)，配對(duì)的堿基越多，則信號(hào)越強(qiáng)。 目前，DNA 芯片主要用于已知序列的重測(cè)序[11]。 重測(cè)序是指對(duì)某一個(gè)種群的基因組計(jì)劃中的基因完成測(cè)序后， 由于個(gè)體基因組的序列之間存在差異， 需要對(duì)個(gè)別個(gè)體進(jìn)行再測(cè)序。 由于序列已知，由DNA 芯片進(jìn)行重測(cè)序的效率將大大提高。

2.2 食品中病原微生物的檢測(cè)

細(xì)菌污染是最常見(jiàn)的食品污染， 因此食品中病原性細(xì)菌的檢測(cè)是食品安全檢測(cè)中的一個(gè)重要方面。將DNA 芯片技術(shù)引入到食品的檢測(cè)過(guò)程，可以大大縮短檢測(cè)時(shí)間， 使一些不能培養(yǎng)或很難培養(yǎng)的細(xì)菌也可以得到精確、高效的檢測(cè)。在實(shí)際操作過(guò)程中， 會(huì)出現(xiàn)有的食品樣本成分比較復(fù)雜或其中致病菌含量較少的情況，這時(shí)DNA 芯片檢測(cè)的靈敏度會(huì)受到影響。 針對(duì)這種情況，要將樣本中待測(cè)DNA 片段的靶序列通過(guò)PCR 進(jìn)行特異性的擴(kuò)增，從而提高芯片檢測(cè)微量致病菌的靈敏度。

由于食品樣本中可能包含多種致病菌，一個(gè)芯片能否同時(shí)檢測(cè)多種病原微生物， 成了新的研究方向。 Hong[12]等設(shè)計(jì)了基于23SrRNA 的寡核苷酸芯片， 可同時(shí)檢測(cè)食品中的14 種致病菌。 將這種芯片與23SrRNA 的PCR 擴(kuò)增聯(lián)合使用，檢測(cè)精度可達(dá)到10CFU/ml 的水平。 Wilson[13]等設(shè)計(jì)了一個(gè)多病原體檢測(cè)芯片， 可以同時(shí)檢測(cè)18 種病原體。這些利用芯片檢測(cè)病原微生物研究的成果， 使芯片技術(shù)在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)入了一個(gè)新的階段。

2.3 藥物研究和開(kāi)發(fā)

高通量的數(shù)據(jù)讓研究者可以從一個(gè)比較全面的角度對(duì)藥物及疾病的多種參數(shù)進(jìn)行研究，替代了傳統(tǒng)藥物篩選的復(fù)雜方法。DNA 芯片還可以通過(guò)檢測(cè)藥物作用對(duì)生物體內(nèi)基因表達(dá)水平的影響，獲知藥物的分子機(jī)制和藥物對(duì)不同生物途徑的作用，以便更好控制藥物的使用。 目前，DNA 芯片技術(shù)正逐步成為藥物研發(fā)的一個(gè)重要手段。

2.4 疾病診斷

人類(lèi)的許多疾病與遺傳基因密切相關(guān)，細(xì)胞內(nèi)基因的突變及細(xì)胞間基因表達(dá)的差異，往往能反映出這些細(xì)胞發(fā)育是否正常。 在任何一個(gè)細(xì)胞中，都有成千上萬(wàn)的基因在表達(dá)，這就要求有同時(shí)能平行地檢測(cè)這些突變及各種基因表達(dá)差異的有效方法。DNA 芯片技術(shù)能很好地滿(mǎn)足這種要求。 利用DNA芯片技術(shù)，可對(duì)疾病進(jìn)行快速、簡(jiǎn)便、高效、準(zhǔn)確的分析。 目前，利用DNA 芯片進(jìn)行診斷的疾病主要有傳染性疾病、 遺傳性疾病、 腫瘤和藥物代謝疾病4類(lèi)。 如用于腫瘤的早期診斷及腫瘤易感性的判斷P53 基因芯片，檢驗(yàn)HIV 的芯片及有無(wú)藥物代謝缺乏癥的CytP450 芯片等。

2.5 環(huán)境微生物群落研究

環(huán)境樣品由多種生物組成，且化學(xué)成分復(fù)雜，是一種十分復(fù)雜的體系，具有菌群結(jié)構(gòu)多樣、菌群功能復(fù)雜的特點(diǎn)。 DNA 芯片技術(shù)的發(fā)展，為環(huán)境樣品的分析研究提供了全新的方法。 DeSantis 等[14]利用含297 851 個(gè)16S rDNA 探針的高密度芯片對(duì)3種環(huán)境樣品（水、土壤、氣溶膠）的微生物種類(lèi)進(jìn)行了分析，并與傳統(tǒng)的測(cè)序方法進(jìn)行了比較。 結(jié)果表明，芯片技術(shù)雖然不能鑒定新菌種，但在分析環(huán)境樣品時(shí)， 能比克隆測(cè)序方法獲得更多的生物多樣性。Palmer 等[15]制備了由10 462 個(gè)SSU rDNA 探針組成的DNA 芯片， 并優(yōu)化了其操作過(guò)程。 結(jié)果表明，利用該芯片及其操作方法可以對(duì)多種環(huán)境樣品的微生物種類(lèi)及數(shù)量進(jìn)行全面了解。

3 結(jié)語(yǔ)

DNA 芯片技術(shù)由于具有高通量、 高靈敏度、檢測(cè)效率高和對(duì)樣品需要量少等優(yōu)點(diǎn)，已成為各領(lǐng)域科學(xué)家們關(guān)注的焦點(diǎn)。 隨著生物信息學(xué)的進(jìn)步和發(fā)展，DNA 芯片技術(shù)將會(huì)進(jìn)一步成熟， 從而幫助人們認(rèn)識(shí)、掌握和利用生命科學(xué)的規(guī)律，給我們的生活提供越來(lái)越多的方便。 目前DNA 芯片技術(shù)還存在一些亟待解決的問(wèn)題。 例如，在芯片表面原位合成核酸探針時(shí)，難免發(fā)生錯(cuò)誤或混入雜質(zhì)，造成雜交特異性降低；可查的DNA 片段序列還只是少數(shù)，仍有大量的基因片段未被準(zhǔn)確測(cè)序或尚未公開(kāi)，使DNA芯片技術(shù)難以在更大的范圍內(nèi)使用。另外，昂貴的設(shè)備也是制約DNA 芯片技術(shù)發(fā)展的一大問(wèn)題，如購(gòu)買(mǎi)如激光共聚焦顯微鏡、DNA 合成儀和制造光刻膜等，都需付出很高的費(fèi)用。

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