侯鈺榮，安沙舟，劉 冬，王 衛(wèi)，徐彩芹

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 新疆草地資源與生態(tài)重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830052)

地理居群和地形對伊犁絹蒿遺傳多樣性的影響

侯鈺榮，安沙舟，劉 冬，王 衛(wèi)，徐彩芹

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 新疆草地資源與生態(tài)重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830052)

對不同地理居群和不同地形的160株伊犁絹蒿(Seriphidiumtransiliense)個體進行SRAP分析，以期為伊犁絹蒿遺傳資源的有效利用提供理論依據(jù)。試驗結(jié)果表明，1)伊犁絹蒿種群的多態(tài)位百分率為78.43%；2)不同地理居群的伊犁絹蒿各居群間沒有明顯的分界點，說明地理距離差異對伊犁絹蒿遺傳分化物質(zhì)的影響較??；3)不同地形的伊犁絹蒿可以聚為2類，將陽坡和平原聚為一類，陰坡和丘陵聚為一類。由結(jié)果可見，地形對伊犁絹蒿遺傳物質(zhì)分化的影響較大。

地理居群；地形；遺傳多樣性；伊犁絹蒿

伊犁絹蒿(Seriphidiumtransiliense)是新疆北疆荒漠地區(qū)最主要的牧草資源，是我國野生牧草資源遺傳育種和生物技術(shù)研究的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，是生物多樣性的重要組成部分。近年來，不少學(xué)者針對伊犁絹蒿的生物學(xué)特性、生育規(guī)律、生理生態(tài)特性及繁殖等進行了大量的研究，但有關(guān)伊犁絹蒿種群的分子生物學(xué)方面的研究較少。遺傳多樣性是指某一物種群體中的可遺傳物質(zhì)的差別程度[1]。目前，遺傳多樣性在農(nóng)作物[2-5]、蔬菜[6-7]、果木[8-9]、花卉[10-11]、藥材[12-13]、牧草[14-16]中的應(yīng)用有大量文獻報道，但對菊科植物關(guān)于遺傳多樣性方面的研究較少，僅在個別花卉品種和蒿屬植物中有研究。蒿屬植物以冷蒿(Artemisiafrigida)[17-18]、青蒿(A.carvifolia)[19]和蔞蒿(A.selengensis)[20]為例，其他植物鮮見有報道。

對植物種群的遺傳分化和遺傳多樣性研究以往多采用ISSR方法[21]，而相關(guān)序列擴增多態(tài)性(Sequence-related amplified polymorphism，SRAP)是一種新型的基于PCR擴增的標(biāo)記系統(tǒng)，標(biāo)記采用長17～18 bp的引物對開放閱讀框(ORFs)進行擴增，因不同物種的內(nèi)含子、啟動子與間隔長度不等而產(chǎn)生多態(tài)性[22]。與其他分子標(biāo)記相比，該標(biāo)記有穩(wěn)定可靠、多態(tài)性高、共顯性高、產(chǎn)率中等；在基因組中分布均勻、易測序、引物具有通用性、操作簡單、成本低廉等優(yōu)點[23-24]。利用SRAP分子標(biāo)記方法，對伊犁絹蒿在不同生境的遺傳多樣性進行了研究，初步從分子水平了解伊犁絹蒿種群對生境和地形的響應(yīng)，為探討伊犁絹蒿種群的分子水平對環(huán)境的生態(tài)適應(yīng)性提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1供試材料的準(zhǔn)備 本試驗材料共計5個居群，160個個體。樣地路線選擇從伊犁河谷西部的察布查爾縣開始，路經(jīng)新源縣、沙灣縣、烏魯木齊市，以奇臺縣為落腳點。為了取到具有代表性的樣品，首先將陽坡、陰坡、平原和丘陵從地貌類型上劃分開，在選擇樣地時，陽坡和陰坡都選擇在山體明顯地段，平原都選擇在山前沖積扇處，而丘陵地帶選擇在地勢起伏不大，基本分不出陰陽坡的地帶上，且在每個地理居群的不同坡向(以實際地形為準(zhǔn)，包括陽坡、陰坡、平原和丘陵)，選擇生長健康的植株10株，即同一生境共采樣30株(除新源縣為40株)。單株距離>10 m，采其綠葉及花蕾共5～10 g，記號標(biāo)簽，放入密封袋，保存在冰盒內(nèi)(底部有冰袋，內(nèi)部溫度<5 ℃)，帶回實驗室供試驗分析。

1.2SDS-CTAB法DNA的提取 采用SDS-CTAB法提取葉片基因組DNA[25-28]，提取的部分結(jié)果見圖1。儲存緩沖液配備如表1。

圖1 伊犁絹蒿基因組DNA電泳圖

類項 劑量及藥品名溶液A50mL100mmol/LTris-HCl(pH值8.0)50mmol/LEDTA(pH值8.0)1mol/LNaCl2%SDS2%PvP40蒸餾水溶液B25mL100mmol/LTris-HCl(pH值8.0)50mmol/LEDTA(pH值8.0)1mol/LNaOH10%CTAB蒸餾水1%β-巰基乙醇20%CTAB

具體提取步驟如下：1)稱取各樣品0.2 g，放入研缽中，在液氮下迅速磨成粉末，將粉末轉(zhuǎn)入50 mL Beckman離心管中，加入0.8 mL 65 ℃預(yù)熱的CTAB緩沖液(A液)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的β-巰基乙醇40～50 μL，用玻璃棒攪拌使其混勻。 2)在65 ℃下水浴加熱50 min，期間搖勻2次。 3)水浴后，加5 mol/L KAc 300 μL，冰浴60 min平衡后12 000 r/min離心10 min，取上清液0.8 mL，加B液200 μL，均勻水浴20 min，室溫冷卻。 4)加入500 μL氯仿異戊醇(24∶1)，輕輕倒轉(zhuǎn)搖動10 min，平衡后12 000 r/mim離心5 min。重復(fù)2次。 5)取上清液500 μL(不能吸到分界面)，加水冷的異丙醇500 μL，-20 ℃冰箱放置60 min以上，平衡后6 000 r/min離心5 min，棄上清。 6)沉于管底的DNA用70%乙醇洗滌2～3次，風(fēng)干加ddH2O(雙蒸水) 40 μL，加1/10體積3 mol/L NaCl(pH值5.2)20 μL，乙醇400 μL，-20 ℃放置10 min，6 000 r/mim離心，將DNA真空抽干。 7)將DNA沉淀溶于50～100 μL的TE緩沖液中， -20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

從樣品中提取的基因組DNA經(jīng)過紫外分光光度計檢測，將DNA濃度稀釋至50 ng/μL，放入-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3SRAP反應(yīng)體系的建立 一個標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系包括： 0.2 mmol/L dNTPs， 1.5 mmol/L MgCl2，0.3 μmol/L 引物，1 U TaqDNA聚合酶，30 ng模板DNA，最后加ddH2O補充體積至25 μL。PCR 反應(yīng)采用復(fù)性變溫法：開始94 ℃變性5 min，之后的35個循環(huán)在94 ℃變性1 min，35 ℃退火1 min，72 ℃延伸1～2 min，最后72 ℃延伸5～7 min進行。4 ℃終止反應(yīng)并保存。

1.4引物的篩選 從現(xiàn)有的97個引物中逐一進行篩選，最后選出21條擴增條帶清晰，重復(fù)性較好且穩(wěn)定的引物對伊犁絹蒿160個樣品進行DNA擴增。上游和下游自由組合結(jié)果序號為18、24、27、38、41、42、49、72、79、80、81、82、84、87、89、107、108、110、117、119、120；選用的引物序列號如表2。

表2 用于SRAP分析的標(biāo)準(zhǔn)引物

1.5聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測

1.5.1溶液配制

1)30%非變性聚丙烯酰胺母液：丙烯酰胺為亞甲基雙丙烯酰胺(29∶1)。丙烯酰胺290 g亞甲基雙丙烯酰胺10 g 加ddH2O定容至1 000 mL (定性濾紙過濾4 ℃ 放置)放置備用。

2)5×TBE(pH值為8.0)母液： 54 g Tris-base， 27.5 g硼酸， 20 mL 0.5 mol/L EDTA，加ddH2O定容至1 000 mL放置備用。

3)質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%(NH4)2S2O8液(APS，過硫酸銨)：1 g(NH4)2S2O8定容至10 mL， -20 ℃放置備用。

4)質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%Na2S2O3溶液100 mL：1 g Na2S2O3定容至100 mL，4 ℃放置備用。

5)固定/終止液配方1 L： 5 mL冰乙酸，100 mL無水乙醇，加ddH2O定容至1 000 mL 放置備用。

6)染色液1 L： 質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%的 AgNO3溶液。

7)顯色液1 L：質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.4%的NaOH溶液使用前加入10.0 mL 37%甲醛。

8)終止顯色液1 L：質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.75% Na2CO3。

9)質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的非變性聚丙烯酰胺凝膠的配置：13.3 mL 30%非變性聚丙烯酰胺母液，10 mL 5×TBE，700 μL APS，50 μL TEMED(四甲基乙二胺)，25.5 mL ddH2O。

1.5.2非變性聚丙烯酰胺凝膠檢測 PCR產(chǎn)物上樣量為3.0 μL；恒壓電泳60～80 min。

1.5.3銀染檢測程序 1)電泳結(jié)束，用蒸餾水洗膠2～3 min，加固定液固定10 min，輕輕搖動，直至染料消失； 2)用蒸餾水洗膠2次，加入染色液染色20 min，過程中輕輕搖動；3)用蒸餾水洗膠1次，加入顯色液中直至條帶清晰出現(xiàn)即可；4)條帶清晰后，將顯色液倒出，加入0.75%Na2CO3終止顯色；5)取出膠片用保鮮膜包裹，記錄編號并照相，對每個引物在每個樣品產(chǎn)生的條帶進行統(tǒng)計記錄，在相同遷移率位置上有DNA條帶的記為“1”，無DNA條帶的記為“0”。

1.6數(shù)據(jù)處理 試驗數(shù)據(jù)用PopGene32軟件完成遺傳多樣性供試樣品多態(tài)性的檢測統(tǒng)計分析(表3)，用UPGMA進行聚類分析。

表3 SRAP引物配對明細(xì)表

注：“+”代表上游引物，“-”代表下游引物，“-”代表未配對。

2 結(jié)果與分析

2.1多態(tài)位點分析 21個引物對不同地理居群和不同地形的伊犁絹蒿的160個DNA樣品進行擴增(圖2)，共擴增出153個條帶，平均每個引物擴增出7.3個條帶。其中，有120條重復(fù)性高、清晰的多態(tài)性條帶，擴增片段的大小均在1 000 bp以下，多態(tài)位點的百分率為78.43%。不同的引物組合擴增的多態(tài)性帶數(shù)明顯不同，21對引物擴增的多態(tài)性帶數(shù)范圍從5條(me3+em2)到55條(me7+em6) 不等，而同一引物組合在不同群體擴增的多態(tài)性帶數(shù)基本相同。

圖2 引物18對樣品49～96的擴增結(jié)果

2.2不同地理居群間遺傳多樣性聚類分析 伊犁絹蒿5個居群間的遺傳聚類結(jié)果見圖3，5個居群基本被聚為2組，一組為察布查爾縣和奇臺縣，另一組為沙灣縣、烏魯木齊市和新源縣，但從遺傳距離來看，沒有明顯的分界點；說明地理距離差異對伊犁絹蒿遺傳分化物質(zhì)的影響較小。同時也說明，荒漠區(qū)降水量的細(xì)微差別對伊犁絹蒿種群的遺傳特性影響不大。

圖3 不同生境間伊犁絹蒿居群間聚類分析

2.3不同地形居群間遺傳多樣性聚類分析 不同地形的伊犁絹蒿聚為2類，將陽坡和平原聚為一類，陰坡和丘陵聚為一類(圖4)。這表明，接受光照時間長、光照強度大、地表溫度較高的陽坡和平原分化明顯，而陰坡和丘陵地帶接受光照和地表溫度較相似，聚為一類。說明地形對伊犁絹蒿遺傳物質(zhì)的分化有重要影響。

圖4 不同地形間伊犁絹蒿居群間聚類分析

3 討論與結(jié)論

伊犁絹蒿在分類上屬于菊科植物，在新疆草地中主要出現(xiàn)在干旱和半干旱的荒漠區(qū)，生活型是小半灌木，實生苗是其種群更新的主要繁育系統(tǒng)，在群落的演替系列上，存在于演替的各個階段，特別是在草地重度放牧下，由荒漠草地的建群種演替為伴生種或偶見種。伊犁絹蒿在時空變化上廣泛分布，面臨的環(huán)境差異也很大，個體和種群數(shù)目多，適應(yīng)幅度大，基因交流頻繁，因此維持遺傳變異的能力強，產(chǎn)生新的遺傳變異的機會也多，這都有利于其增加遺傳多樣性水平。Grant[29]、Millar和Libby[30]都認(rèn)為一個物種的進化潛力和抵御不良環(huán)境的能力取決于遺傳多樣性水平的高低。因此，伊犁絹蒿較高的遺傳多樣性水平是其耐啃食、耐踐踏、耐干旱、耐貧瘠、再生生長能力強的遺傳基礎(chǔ)。

通過SRAP分子標(biāo)記對不同地理居群和不同地形的伊犁絹蒿天然居群的研究表明，伊犁絹蒿種群的多態(tài)位百分率為78.43%，隨著生境的改變，伊犁絹蒿遺傳多態(tài)位點數(shù)變化不大，地形的改變對伊犁絹蒿遺傳多態(tài)位點數(shù)有一定影響，與其他采用SRAP標(biāo)記進行檢測的植物多態(tài)性百分率有差異，如新疆野蘋果(Malussieversii)(P=98.56%)[21]、多花黑麥草(Loliummultiflorum)(P=77.09%)[31]、不結(jié)球白菜(Brassicapestrisssp.chinensis)(P=41.86%)[32]、苧麻(Boehmerianivea)(P=85.54%)[33]等。與之相比，伊犁絹蒿的遺傳多樣性水平屬于中等。但與牧草相比，伊犁絹蒿遺傳多樣性具有相似性，這與牧草的生活特性也有一定的相關(guān)性。本研究表明，遺傳距離和地理距離兩者之間的關(guān)系不明顯。這與Cui等[34]對松嫩草原羊草(Leymuschinensis)、穆立薔和劉贏男[35]對紫椴(Tiliaamurensis)種群的研究結(jié)果基本一致，均顯示遺傳距離與地理距離間不存在顯著的相關(guān)性。遺傳距離受地形因素影響鮮見有報道。

目前，由于在不同的種、不同個體間具有一定得多態(tài)性SPAP技術(shù)已經(jīng)成功用于種質(zhì)資源的鑒定與評價工作[36]。對同一植物材料在分子標(biāo)記方法上進行遺傳多樣性和形態(tài)學(xué)對比已有大量報道，尤其在蔬菜方面更是成熟，結(jié)果均表明SRAP標(biāo)記比AFLP、RAPD、SSR等方法更能提供優(yōu)良信息。但關(guān)于牧草方面的研究還遠遠不夠，有待于深入研究。

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InfluenceofdifferentlygeographicalpopulationsandterrainsongeneticdiversityofSeriphidiumtransiliense

HOU Yu-rong, AN Sha-zhou, LIU Dong, WANG Wei, XU Cai-qing

(College of Grassland and Environment Science, Xinjiang Agricultural University; Key Laboratory of Grassland Resources and Ecology of Xinjiang, Xinjiang Urumqi 830052, China)

The 160 plants ofSeriphidiumtransiliensewith the different geographical population growing at different terrains was used to screen the genetic diversity by SRAP technical analysis for providing the useful information for utilization this plant resource. The results of this study showed the percentage of polymorphism loci ofS.transiliensepopulationwas 78.43. This study also indicated that the obvious demarcation point was not found among the different geographical population ofS.transiliense, implying that the difference in geographical distance betweenS.transiliensepopulations did not affect the hereditary substance ofS.transiliense. However, 160 plants were clustered into two groups, and one group consisted of sunny slope and plain populations, the other group consisted of shady slope and hilly populations, indicating that terrain showed a greatly effect on the hereditary substance ofS.transiliense.

geographical population; terrains; genetic diversity;Seriphidiumtransiliense

S540.3；Q948

A

1001-0629(2011)01-0094-06

2010-02-23 接受日期：2010-04-27

教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金項目(20096504110002);新疆草地資源與生態(tài)重點實驗室開放課題(XJDX0209-2007-05)

侯鈺榮(1982-)，女，新疆瑪納斯人，在讀博士生，從事草地資源與生態(tài)研究。

E-mail:houyurong0994@sina.com

安沙舟 E-mail:xjasz@126.com