李俊平，劉 岷，毛麗紅，石 科，李 靚，許 堯，薛樂勛

鄭州大學(xué)生物工程系細(xì)胞生物學(xué)研究室鄭州 450001

#通訊作者，男，1944年2月生，教授，博士研究生導(dǎo)師，研究方向:腫瘤標(biāo)志物與基因工程，E-mail:xuelx@zzu.edu.cn

杜氏鹽藻FLA8基因全長的克隆及鑒定*

李俊平，劉 岷，毛麗紅，石 科，李 靚，許 堯，薛樂勛#

鄭州大學(xué)生物工程系細(xì)胞生物學(xué)研究室鄭州 450001

#通訊作者，男，1944年2月生，教授，博士研究生導(dǎo)師，研究方向:腫瘤標(biāo)志物與基因工程，E-mail:xuelx@zzu.edu.cn

杜氏鹽藻;FLA8基因;驅(qū)動蛋白-2

目的:獲得FLA8基因cDNA序列。方法:根據(jù)衣藻、小球藻等驅(qū)動蛋白-2亞基的氨基酸高度保守序列GYNGTIF、NEDPKDA設(shè)計(jì)一對簡并引物，采用RT-PCR及3’RACE和5’RACE的方法擴(kuò)增杜氏鹽藻FLA8基因的全長。結(jié)果:克隆得到的杜氏鹽藻FLA8基因cDNA全長序列為2 612 bp，序列分析顯示其包括90 bp的5’UTR、167 bp的3’UTR以及2 355 bp的開放閱讀框，其編碼784個氨基酸殘基，蛋白質(zhì)的理論等電點(diǎn)為6.65，相對分子質(zhì)量為85 097。氨基酸序列同源性分析顯示其與其他物種有較高的同源性:團(tuán)藻(98%)、衣藻(99%)、小球藻(92%)。結(jié)論:得到杜氏鹽藻驅(qū)動蛋白-2亞基FLA8的基因全長。

鞭毛/纖毛在感知和向細(xì)胞內(nèi)傳遞外界環(huán)境信號的過程中擔(dān)任重要角色，多囊腎疾病、癌癥等多種發(fā)育異常均與纖毛缺陷相關(guān)［1］。近年來，以有鞭毛的低等生物作為模式生物來研究鞭毛/纖毛相關(guān)性疾病成為一個重要的研究方向［2］，但到目前為止，鞭毛長度的調(diào)控機(jī)制依然不清楚［3-4］。鞭毛的組裝由鞭毛內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)(intraflagellar transport，IFT)調(diào)控，分別由正向運(yùn)輸和逆向運(yùn)輸完成，鞭毛內(nèi)顆粒從基體沿著軸絲運(yùn)輸?shù)奖廾敳康恼蜻\(yùn)輸是通過驅(qū)動蛋白(kinesin-2)進(jìn)行的，而由鞭毛頂端向基體的逆向運(yùn)輸則通過動力蛋白(Dynein)進(jìn)行。驅(qū)動蛋白作為一個正向末端的微管動力蛋白包括2個驅(qū)動蛋白亞基(FLA10，F(xiàn)LA8)和1個非動力結(jié)合亞基(KAP)3個亞單位［5-7］。目前對FLA8的功能研究相對較少。作者對杜氏鹽藻FLA8基因全長進(jìn)行了克隆，為進(jìn)一步研究FLA8在鞭毛運(yùn)輸過程中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 杜氏鹽藻藻株UTEX-LB-1644購自美國得克薩斯州大學(xué)，載體 pMD19T-vector購自大連寶生物工程公司，大腸桿菌 DH5α為該室保存，EcoRⅠ、HindⅢ、LA Taq酶、rTaq酶、膠回收試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒均購自大連寶生物工程公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas公司。

1.2 杜氏鹽藻cDNA的制備 按5×105mL－1的接種量將杜氏鹽藻細(xì)胞接種于改良的PKS液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為26℃，光照強(qiáng)度為4 500 Lux，光/暗培養(yǎng)各12 h。取處于對數(shù)生長期的鹽藻細(xì)胞，用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳及分光光度計(jì)檢測所提取總 RNA的質(zhì)量和濃度。取2 μg RNA作為模板，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得cDNA，置于－20℃保存。

1.3 杜氏鹽藻FLA8基因部分序列的克隆及鑒定從GenBank上搜索已登錄的kinesin-2蛋白(KS2)的氨基酸序列進(jìn)行比對，根據(jù)其在衣藻、小球藻等物種中的保守性找出兩段相對比較保守的序列設(shè)計(jì)簡并引物，KS2上游引物:5’-GGNTA(T/C)AA(T/C) GGNCANAT(T/C/A)TT-3’，下游引物:5’-GC(G/ A)TC(C/T)TTNGG(G/A)TC(C/T)TC(G/A)TT-3’，由上海博尚生物技術(shù)有限公司合成。以制備的cDNA為模板，利用合成的簡并引物PCR法擴(kuò)增鹽藻細(xì)胞FLA8的部分基因序列。PCR反應(yīng)體系:cDNA 1 μL，10×LA Buffer(Mg2+plus)10 μ L，dNTP Mixture(10 mmol/L)8 μL，上、下游引物(50 μmol/ L)各1 μL，LA Taq 1 μL，dH2O補(bǔ)至100 μ L。PCR反應(yīng)程序:95℃5 min;94℃30 s，40～60℃30 s，72℃ 2 min，30個循環(huán);72℃ 10 min，4℃終止反應(yīng)。PCR反應(yīng)結(jié)束后，用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果。將PCR產(chǎn)物膠回收，與pMD19-T-vector連接，過夜并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 DH5α，用含有Ampr、IPTG和X-Gal的平板進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取陽性菌落培養(yǎng)，提取質(zhì)粒pMD-K1后經(jīng)雙酶切鑒定。

1.4 杜氏鹽藻FLA8基因cDNA 3’端序列擴(kuò)增

根據(jù)簡并引物擴(kuò)增得到的已知序列，設(shè)計(jì)鹽藻FLA8的3’RACE引物(外側(cè)引物 K1:5’-GTC CAACCGCACCGTCTTAG-3’，內(nèi)側(cè)引物 K2:5’-ACAAGGGATGGAAGATATACAGGA-3’);3’RACE試劑盒中自帶的引物序列如下:外側(cè)引物K3:5’-GCGAGCACAGAATTAATACGACT-3’，內(nèi)側(cè)引物K4:5’-CGCGGATCCGAATTAATACGACTCACTAT AGG-3’。提取對數(shù)期的杜氏鹽藻的總 RNA，按照First Choice RLM-RACE Kit說明進(jìn)行操作。PCR反應(yīng)程序:95℃5 min，94℃30 s，58℃ 30 s，72℃ 3 min，30個循環(huán);72℃ 10 min，4℃終止反應(yīng)。巢式PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳，膠回收目的片段，連接于pMD19-T-vector上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，挑取陽性菌落培養(yǎng)，提取質(zhì)粒pMD-K2后用EcoRⅠ、HindⅢ雙酶切鑒定。

1.5 杜氏鹽藻FLA8基因cDNA 5’端序列擴(kuò)增根據(jù)簡并引物擴(kuò)增得到的已知序列設(shè)計(jì)鹽藻FLA8 5’RACE引物鹽藻FLA8外側(cè)引物K2-1:5’-ACAC GAAGACTGTGATGGT-3’，內(nèi)側(cè)引物FLA6:5’-CAG GCTGTCCAGTCATTGTG-3’;試劑盒自帶外側(cè)引物序列:外側(cè)引物為5’-CATGGCTACATGCTGACAGC CTA-3’，內(nèi)側(cè)引物為5’-CGCGGATCCACAGCCTA CTGATGATCAGTCGATG-3’。按照TaKaRa公司的5’RACE說明書制備模板，設(shè)置反應(yīng)條件和程序。巢式PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳，膠回收目的片段，連接于pMD19-T-vector上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 DH5α，挑取陽性菌落培養(yǎng)，提取質(zhì)粒pMD-K3后用EcoRⅠ、HindⅢ雙酶切鑒定。

1.6 杜氏鹽藻FLA8基因cDNA全長的克隆 根據(jù)所得到的3段cDNA序列，重新設(shè)計(jì)FLA8基因的特異性引物，然后用RT-PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增獲得杜氏鹽藻FLA8基因的cDNA全長序列。設(shè)計(jì)的引物序列如下:FLA8F序列為5’-ATGAGCAGCGGAGC CAATCC-3’，F(xiàn)LA8R序列為 5’-TCATGCAGGCT TAGAAGAC-3’。以獲得的杜氏鹽藻cDNA為模板，以FLA8F、FLA8R為引物，擴(kuò)增獲得杜氏鹽藻FLA8基因的cDNA全長。PCR反應(yīng)程序:95℃5 min;94℃30 s，58℃30 s，72℃1 min，30個循環(huán);72℃10 min，4℃終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，膠回收目的片段，轉(zhuǎn)化并挑選陽性克隆，提取質(zhì)粒pMD-K4，鑒定正確后測序并進(jìn)行同源性分析。

2 結(jié)果

2.1 杜氏鹽藻總RNA的純度和質(zhì)量鑒定 根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，所提取的杜氏鹽藻總RNA質(zhì)量較好，無拖尾現(xiàn)象，28S與18S亮度比約為2∶1，且無RNA降解和DNA、蛋白質(zhì)污染，可以用于下步實(shí)驗(yàn)。

2.2 杜氏鹽藻FLA8基因部分序列的克隆及鑒定

見圖1。RT-PCR所得片段長度約為772 bp，與理論值相符。膠回收后pMD19-T-vector連接，提取質(zhì)粒PK-1，用EcoRⅠ和HindⅢ進(jìn)行雙酶切，得一條載體片段和一條插入片段，插入片段與回收片段大小一致。

圖1 FLA8 RT-PCR及pMD-K1的酶切鑒定

2.3 杜氏鹽藻FLA8基因cDNA 3’RACE結(jié)果見圖2。3’RACE所得片段長度約為1 700 bp，膠回收后連接于 pMD19-T-vector，得質(zhì)粒 pMD-K2，經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切，得到一條載體片段和一條插入片段，插入片段與回收片段大小一致。

圖2 FLA8 3’RACE及pMD-K2的酶切鑒定

2.4 杜氏鹽藻FLA8基因cDNA 5’RACE結(jié)果見圖3。用EcoRⅠ和HindⅢ對pMD-K3質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切后瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示插入片段與膠回收得到的片段大小是相符的。

圖3 FLA8基因5’RACE及pMD-K3的酶切鑒定

2.5 杜氏鹽藻FLA8基因cDNA全長的克隆及鑒定 見圖4。對杜氏鹽藻FLA8基因cDNA全長進(jìn)行擴(kuò)增，獲得一條長為2 612 bp的片段，其大小與理論值相符。膠回收后連接于pMD19-T-vector上，得到質(zhì)粒pMD-K4，用HindⅢ和EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，可見一條載體片段和一條插入片段，插入片段與回收片段大小一致。

2.6 FLA8序列同源性分析 序列分析顯示擴(kuò)增片段包括90 bp的5’UTR、167 bp的3’UTR以及2 355 bp的開放閱讀框，其NCBI GenBank登錄號為JF825469，編碼784個氨基酸殘基，蛋白質(zhì)的理論等電點(diǎn)為6.65，相對分子質(zhì)量為85 097。該氨基酸序列與其他物種的FLA8氨基酸序列進(jìn)行比對，Blast結(jié)果、DNAMAN軟件分析和進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，與其他物種的FLA8氨基酸序列具有較高的同源性:團(tuán)藻(98%)、衣藻(99%)、小球藻(92%)。

圖4 FLA8基因cDNA全長的PCR擴(kuò)增及其酶切鑒定

3 討論

該研究所克隆的鹽藻FLA8氨基酸和衣藻、小球藻的FLA8的氨基酸同源性分別為99%、91%，和大鼠、人類的KIF3A的氨基酸同源性均為80%，說明該基因存在高度保守性，但由于物種不一樣，可能和其他物種存在差異性，提示可以利用鹽藻鞭毛來作為一種模式生物來研究。

FLA8序列已經(jīng)在多種生物中被克隆出來，除了在鞭毛運(yùn)輸及作為貨物被運(yùn)輸?shù)淖饔茫?］外，它還有一些新作用正逐漸被發(fā)現(xiàn)。杜氏鹽藻是一種單細(xì)胞真核綠藻，其FLA8作為kinesin-2的一個動力亞基參與鞭毛的正向運(yùn)輸外，其他功能尚不清楚。目前已有用基因敲除方法使物種缺失FLA8基因從而研究FLA8在鞭毛正向運(yùn)輸中的作用，但是對于FLA8對鞭毛的其他功能尚不清楚，該研究為下一步研究FLA8基因在杜氏鹽藻鞭毛再生過程中的作用以及今后研究杜氏鹽藻FLA8蛋白的純化與結(jié)晶奠定了基礎(chǔ)。

［1］Veland IR，Awan A，Pedersen LB，et al.Primary cilia and signaling pathways in mammalian development，health and disease［J］.Nephron Physiol，2009，111(3):P39

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［3］ Pedersen LB，Rosenbaum JL.Intraflagellar transport( IFT)role in ciliary assembly，resorption and signalling［J］.Curr Top Dev Biol，2008，85:23

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Cloning and identification of the full-length cDNA sequence of FLA8 gene from Dunaliella salina

LI Junping，LIU Min，MAO Lihong，SHI Ke，LI Liang，XU Yao，XUE LexunLaboratory for Cell Biology，Department of Bioengineering，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001

Dunaliella salina;FLA8;kinesin-2

Aim:To get the full-length cDNA sequence of FLA8 gene from Dunaliella salina(D.salina).Methods:A pair of degenerated primers was designed according to conserved homologous amino acid sequences of GYNGTIF and NEDPKDA of kinesin-2 motor subunit of FLA8 from microalgae and other organisms.The full-length cDNA of FLA8 gene was ob-tained by RT-PCR，3’and 5’RACE technology.Results:The results showed that the full-length cDNA sequence of the cloned FLA8 gene was 2 612 bp，possessing a 90 bp 5’UTR，a 167 bp 3’UTR and a 2 355 bp open reading frame encoding 784 amino acids.The theoretical pI value of FLA8 was 6.65 and the relative molecular weight was 85 097.Amino acid sequence homologous analysis indicated that FLA8 of D.salina shared high homology with other organisms，such as Volvox carteri f.nagariensis(98%)，Chlamydomonas reinhardtii(99%)，Micromonas(92%).Conclusion:The full-length cDNA sequence of FLA8 gene from D.salina has been cloned.

Q781

*國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 30700014;科技部國際科技合作基金資助項(xiàng)目 2007DFA01240

(2011-01-18收稿 責(zé)任編輯趙秋民)