陳天華， 歐陽建文， 唐海濤

(1.北京工商大學計算機與信息工程學院，北京 100048;2.湖南農(nóng)業(yè)大學信息科學技術(shù)學院，湖南長沙 410000)

現(xiàn)代生物傳感器在食品安全檢測中的應(yīng)用

陳天華1， 歐陽建文2， 唐海濤1

(1.北京工商大學計算機與信息工程學院，北京 100048;2.湖南農(nóng)業(yè)大學信息科學技術(shù)學院，湖南長沙 410000)

分析了生物傳感器的基本原理、結(jié)構(gòu)以及生物傳感器的類型和特點，闡述了現(xiàn)代生物傳感器技術(shù)在微生物檢測、食品藥物殘留與獸藥殘留、食品添加劑檢測和激素檢測中的各種應(yīng)用，討論了傳感技術(shù)在食品安全檢測中的重要應(yīng)用及未來發(fā)展方向.

食品檢測;生物傳感器;食品安全

近年來，由于食品安全問題頻發(fā)，食品安全受到越來越多的人的關(guān)注，隨著全球經(jīng)濟一體化和食品貿(mào)易國際化，食品安全問題已成為全世界關(guān)注的熱點和國際貿(mào)易的敏感問題，已逐步成為全球公共衛(wèi)生的焦點問題［1］.目前，應(yīng)用于食品安全檢測的技術(shù)手段或方法主要有化學方法、色譜法、酶法、免疫法和生物檢測方法等［2］.這些方法都需要采集樣品數(shù)據(jù)，在食品種類日益紛繁復(fù)雜的情況下，對食品安全檢測技術(shù)提出了更高的要求，尤其需要更為快速、準確、靈敏的檢測方法，因此，傳感器技術(shù)在食品安全檢測中發(fā)揮著越來越重要的作用.

由于生物傳感器的市場需求，20世紀60年代起，生物傳感器技術(shù)就受到了科學界的廣泛重視.1962年英國學者Clark和Lyons首先提出了酶電極的概念，其基本原理是將酶反應(yīng)的高度特異性和電極響應(yīng)的高度靈敏結(jié)合起來對特定成分進行檢測，1967年，Updike和Hicks成功地研制出了第一個以鉑電極為基礎(chǔ)的葡萄糖氧化酶傳感器［3］.20世紀70年代，出現(xiàn)了基于電流型電極、電位型微生物電極、組織電極、線粒體電極為檢測單元的生物傳感器，到80年代，已經(jīng)研制出了各種基于光效應(yīng)、熱效應(yīng)、場效應(yīng)和反應(yīng)物質(zhì)量變化的各種生物傳感器，開始了生物電子學傳感器的新時代，國內(nèi)生物傳感器也是開始于這一時期.

1 生物傳感器的原理

傳感技術(shù)是當代科學技術(shù)發(fā)展的一個重要標志，它是現(xiàn)代電子信息技術(shù)、食品檢測科學和生物醫(yī)學工程等領(lǐng)域不可缺少的功能器件，它與通訊技術(shù)、計算機技術(shù)并稱為現(xiàn)代信息產(chǎn)業(yè)的三大支柱［4］.生物傳感器是將生物感應(yīng)元件的敏感性、專一性與一個能夠產(chǎn)生和待測物濃度成比例的信號傳導(dǎo)器結(jié)合，利用各種生物材料或生物代謝產(chǎn)物如酶、抗體等做成的用于檢測、識別生物與食品的化學成分的傳感器［5］.生物傳感器主要用于食品和生物醫(yī)學信息的檢測，利用被檢測物和分子識別元件的特異性結(jié)合，檢測物進入生物活性材料后發(fā)生物理或化學反應(yīng)，產(chǎn)生的生物學信息經(jīng)物理或化學換能器轉(zhuǎn)變?yōu)榭啥?、可處理的電信號或光信號，再?jīng)電路進行放大或相應(yīng)的處理后輸出，從而實現(xiàn)對被測物的分析和檢測.

生物傳感器結(jié)構(gòu)上主要包括兩部分，如圖1.第一部分是識別部件，即來自于生物體分子、組織部分或個體細胞的分子識別組件，如酶、微生物、細胞或組織、抗原或抗體等;另一部稱為轉(zhuǎn)換部件，實現(xiàn)物理信號的轉(zhuǎn)換，主要由電化學或光學檢測元件，如熱電、光電壓電元件、離子敏場效應(yīng)晶體管等組成.其余為輔助部分，完成系統(tǒng)測量或控制功能.

圖1 生物傳感器結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of biosensor

目前，生物傳感器大致經(jīng)歷了3個發(fā)展階段.第一代生物傳感器是由固定了生物成分的非活性基質(zhì)膜和電化學電極組成;由于應(yīng)用的推動，在第一代生物傳感器的基礎(chǔ)上開發(fā)出了第二代生物傳感器，檢測時而無需非活性的基質(zhì)膜，而是將生物成分直接吸附或共價結(jié)合到換能器表面，測定時不必向樣品中加入其他試劑;第三代生物傳感器將生物識別和信號轉(zhuǎn)換與處理結(jié)合在一起，直接將生物活性成分固定在電子元件上，因而可以直接感知和放大檢測物的信息變化.

2 生物傳感器的分類及特點

生物傳感器是通過將生物識別元件和信號轉(zhuǎn)換元件緊密結(jié)合，從而實現(xiàn)對目標物成分的分析和監(jiān)測，不同的生物識別元件和信號轉(zhuǎn)換元件可形成不同類型的生物傳感器.

2.1 生物傳感器的類型

由于生物傳感器的快速發(fā)展，其分類方法多種多樣，根據(jù)生物傳感器的兩大功能部件材料或原理的不同，可以有不同的分類方法.目前主要有按分子識別元件分類和按換能器類型兩種分類方法，如圖2.

圖2 生物傳感器的分類Fig.2 Classification of biosensor

根據(jù)生物傳感器分子識別元件可分為酶傳感器、免疫傳感器、細胞傳感器、組織傳感器、微生物傳感器、DNA傳感器、分子印跡傳感器及智能傳感器等.按照傳感器轉(zhuǎn)換元件的原理可分為光學生物傳感器、熱敏生物傳感器、聲波道生物傳感器、電導(dǎo)生物傳感器、電化學生物傳感器、FET生物傳感器、酶電極生物傳感器等.

2.2 生物傳感器的特點

生物傳感器具有選擇性好、無需試劑、操作簡便、可重復(fù)使用及在線分析等優(yōu)點［6－7］.通常具有如下特點［1］［3］.

1)專一性好，可選擇特異性強，只對特定的底物起反應(yīng)，且不易受到外界干擾.

2)采用固定化生物活性物質(zhì)作催化劑，對于一些貴重的檢測試劑可重復(fù)多次使用.

3)檢測速度快，可以在幾分鐘甚至幾秒鐘內(nèi)完成對特定成分的檢測.

4)測試準確度高，一般相對誤差可以達到1%以內(nèi).

5)成本低，由于技術(shù)的進步，各種生物化學試劑成本不斷下降，對于多次連續(xù)測試，其單次測試成本僅幾分錢.

6)操作簡單，容易實現(xiàn)自動檢測、自動分析.

3 生物傳感器的應(yīng)用

傳統(tǒng)的食品安全檢測通常需要使用較為復(fù)雜、昂貴的儀器設(shè)備和相關(guān)的預(yù)處理，且難以實現(xiàn)現(xiàn)場檢測，生物傳感器的應(yīng)用提高了分析速度和靈敏度，使測定過程變得更為簡單，便于實現(xiàn)自動化.使傳感器從定性檢測發(fā)展到了定量測量階段，延伸了檢測人員的感覺器官，擴大了觀測范圍，提升了檢測的穩(wěn)定性.目前，傳感器已廣泛應(yīng)用于食品中微生物監(jiān)測、藥物殘留監(jiān)測、添加劑監(jiān)測和激素檢測等.

3.1 微生物檢測

生物傳感器在微生物檢測方面的應(yīng)用是當今檢測技術(shù)研究的熱點.據(jù)美國疾病預(yù)防控制中心資料顯示，微生物及其產(chǎn)生的毒素是危害食品安全的重要因素之一，1993～1997年美國食物中毒事件55.6%與微生物有關(guān)［8］.而生物傳感器可以實現(xiàn)對食品中的微生物進行監(jiān)測.

Matssunage等開發(fā)了一種用于檢測啤酒酵母和乳酸桿菌濃度的傳感器，其測定范圍較寬，可達5×107～4×108細胞/ml.Liu等用光學免疫傳感器實現(xiàn)了鼠傷寒沙門菌的快速檢測［9］，利用抗體抗原原理，采用含有抗沙門菌的磁性微珠分離出待測溶液中的沙門菌，加入用堿性磷酸酯酶作標記的二抗，形成抗體“沙門菌一酶標抗體”的結(jié)構(gòu)，經(jīng)磁性分離后，在酶的水解作用下，底物對硝基苯磷酸產(chǎn)生對硝基苯酚，通過在404nm下測定對硝基苯酚的吸光度來測量沙門菌的總數(shù).大量的實驗表明，在2.2×104～2.2×106cfu/ml范圍內(nèi)，該測試方法具有良好的線性關(guān)系.國內(nèi)盧智遠等人研制了可快速測定乳制品細菌含量總數(shù)的電化學生物傳感器，可快速測定鮮牛奶中的微生物含量［7］.

Wayne等用表面等離子體共振(SPR)免疫傳感器檢測玉米抽提物中的FB1(伏馬菌素B1 Fumonisins B1))濃度［5］，該方法檢測時間為 10分鐘左右，檢測下限為50g/L.其基本原理是將抗FB1的多克隆抗體吸附到Kretschmamn裝置中的玻璃棱鏡的金膜上，二極管產(chǎn)生的光束通過棱鏡聚焦于膜表面以激發(fā)等離子體共振，加入檢測物時引起反射光角度改變，且FB1濃度大小與該角度變化成正比.Carlson等人研制了用于檢測農(nóng)產(chǎn)品中的黃曲霉毒素的生物傳感器，主要基于免疫熒光原理，可在2 min內(nèi)檢測出0.1～50 ppb的濃度，連續(xù)使用100次數(shù)可達 100 次［10］.

基因芯片檢測技術(shù)也可以用于檢測食品中的微生物信息［11］.即將數(shù)以萬計的核酸探針固化于支持物表面，采用原位合成或顯微打印手段與標記的檢測樣品進行雜交，通過檢測雜交信號來實現(xiàn)對樣品快速、并行的準確檢測.在食品安全檢測中，基因芯片技術(shù)具有信息量大、操作簡單、重復(fù)性好、可靠性高、可重復(fù)利用等諸多特點，是鑒別有害微生物和轉(zhuǎn)基因成分最快速、有效的手段之一.

近年來，國內(nèi)外許多學者開始利用基因芯片對食品中的致病菌進行分析檢測.Volokhovd等通過單管復(fù)合體擴增和基因芯片技術(shù)檢測和鑒別了6種李斯特菌［12］.Jack等通過設(shè)計通用引物擴增細菌核糖體16S rRNA，并將擴增產(chǎn)物與含有探針的低密度芯片進行雜交，實現(xiàn)了對多種微生物的直接檢測.在食品安全檢測中，核酸探針檢測技術(shù)可以用于檢測致病性病原菌.Wilson等采用病原體診斷區(qū)基因擴增和20寡核苷酸藻紅素標記探針，開發(fā)出一套多病原體識別微陣列，可以準確識別18種致病性病毒、原核生物和真核生物［13］.

3.2 食品中的藥物殘留檢測

3.2.1 農(nóng)藥殘留檢測

隨著檢測技術(shù)和食品科學技術(shù)的發(fā)展，人們對食品中的農(nóng)藥與獸藥殘留更加關(guān)注和重視，對如何實現(xiàn)食品中的農(nóng)藥殘留的快速檢測進行了持續(xù)的研究與探索.Starodub等根據(jù)農(nóng)藥對靶標酶的活性抑制作用，分別以乙酰膽堿酯酶(AchE)和丁酰膽堿酯酶(BchE)作為敏感元件，研制出了不同的離子酶場效應(yīng)晶體管酶傳感器，可測量蔬菜中有機磷農(nóng)藥，檢測限為10－5～10－7mol/L.Fernando以鰻魚乙酰膽堿作為生物敏感材料，采用酯酶光尋址電位型傳感器測定了有機磷和氨基甲酯類農(nóng)藥，并具有較高的靈敏度，可檢測出10 mmol/L的馬拉硫磷和惡蟲威.Zhao等人用多克隆抗PCB抗體制作的敏感膜光纖免疫傳感器可測定水、食物和牛奶中的多氯聯(lián)苯(PCBs殺蟲劑)，檢測時間在幾分鐘內(nèi)，檢測下限為10 ng/mol［14］.

基于免疫原理的生物傳感器也可用于食品中農(nóng)藥殘留的檢測.Pribyl等將莠去津(atrazine)的單克隆抗體用蛋白A法固定在壓電晶體上的金電極表面［15］，檢測樣品中的莠去津的吸附作用可引起石英晶體的振蕩頻率發(fā)生改變，根據(jù)頻率的變化可檢測待測物濃度，其檢測下限可達1.5 ng/ml.該項目人員通過實驗還發(fā)現(xiàn)，也可將莠去津固定在壓電晶體表面，采用間接方法測定莠去津，檢測下限可達0.025 ng/m.

3.2.2 獸藥殘留檢測

食品中的獸藥殘留通常采用基于表面等離子體共振技術(shù)的生物傳感器進行檢測［10］.SPR是一種新的生物化學檢測技術(shù)，是基于表面等離子體共振的物理光學現(xiàn)象的敏感折射率的高精度光學傳感器，通過感測傳感器表面折射率的微小變化而實現(xiàn)定量檢測.如果金屬表面介質(zhì)的折射率或被測物介電常數(shù)發(fā)生變化，其共振峰的位置共振角或共振波長將發(fā)生改變，因此通過測定角度或波長的變化，即可測量出被測物在界面上發(fā)生反應(yīng)的信息.SPR技術(shù)具有無須標記、實時快速、專一性、靈敏度高以及大量平行篩選等優(yōu)點.GE的Biacore儀器是應(yīng)用最廣泛的SPR生物傳感器，因而SPR生物傳感器已由最初的生物大分子相互作用(例如:蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)、藥物－蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)－核酸、核酸－核酸之間的相互作用分子間)研究逐漸發(fā)展到用于食品安全和環(huán)境污染物中眾多小分子化合物的檢測.SPR生物傳感器主要用于食品安全、品質(zhì)檢測，包括病原體、毒素、藥物殘留、維生素、抗體、化學污染物、過敏源、蛋白和寄生蟲等方面，可實現(xiàn)牛奶、牛肉、蘋果汁中的E.coliO157:H7的檢測，其檢測下限可達102－103cfu/ml.

包括內(nèi)酰胺類抗生素在內(nèi)的一些青霉素常用于治療奶牛炎癥，因此，內(nèi)酰胺類抗生素是牛奶中常見抗生素殘留物.2002年，Gustavsson等將帶有羧肽酶活性的微生物受體蛋白作為探測分子，采用基于表面等離子共振技術(shù)的生物傳感器檢測牛奶中內(nèi)酰胺類抗生素，通過檢測酶的活性值檢測奶品中的抗生素，其檢測極門限可達2.6 g/kg，達到了歐洲4 g/kg的最大殘留(MRL)標準［12］.磺胺和盤尼西林是獸藥中常用的抗生素之一，其殘留會污染動物性食品.Stemesjoes采用免疫傳感器測定牛奶中硫胺二甲嘧啶，檢出下限為1×10－9mol/L.

3.3 食品添加劑檢測

食品添加劑對食品工業(yè)的發(fā)展和益處是無容置疑的，但過量的使用添加劑也會對人體產(chǎn)生一定的危害性.目前，已研制出了一些檢測食品添加劑的生物傳感器［13］.Camoannella等將氨氣敏電極與天門冬酶聚合并固定在滲析膜上，成功研制出了可直接檢測甜味素(天門冬酰苯丙氨酸甲酯)的生物傳感器，并具有較高的靈敏度，其測量線性范圍為3.8×10－3～ 2.6 ×10－2mol/L，檢測下限可達 2.6 ×10－3mol/L.

亞硝酸鹽在一些存放過久的熟蔬菜、蔬菜制品和泡菜中具有一定的含量，目前的研究表明它具有潛在的致癌作用，并可導(dǎo)致嬰兒高鐵血紅蛋白血癥.Carla CRosa等利用光生物傳感器原理對亞硝酸鹽進行檢測，其檢測下限為0.93mol/L，完全滿足了歐盟對亞硝酸鹽的限定標準［14］.該傳感器基于絡(luò)合沉淀凝膠法(CPG法)將亞硝酸鹽還原酶固定在光纖一端的可控微孔玻璃珠上，根據(jù)亞硝酸鹽與酶接觸時引起的分光變化與亞硝酸鹽的濃度在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，從而實現(xiàn)對亞硝酸鹽的定量檢測.

Mesarost等曾采用卟啉微電極可檢測食品中的亞硝酸鹽，這種方法簡便而快速，準確度和精確度較好［15］.此外，高效液相色譜(HPLC)技術(shù)可用于食品添加劑和生物毒素的定量檢測和分析，并具有成本較低、操作簡便、靈敏度高、重復(fù)好、結(jié)果準確可靠等優(yōu)勢.

3.4 激素的檢測

在肉類食品中，激素的積累和殘留也是人們關(guān)注的重點，激素檢測通?？梢圆捎妹庖邔W方法.酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)就是其中的一種重要方法，基本原理是利用抗原和抗體的特異性免疫反應(yīng)和酶的高效催化作用檢測激素殘留［16］，即在不破壞其免疫活性的條件下，將抗原或抗體預(yù)先結(jié)合到某一固相載體表面，檢測過程中根據(jù)特定程序?qū)⒚笜丝乖蚩贵w和受檢樣品與結(jié)合在固相載體上的抗原或抗體進行反應(yīng)，形成抗原或抗體復(fù)合物，固相載體上酶標抗原或抗體被結(jié)合量(免疫復(fù)合物)與被測樣本中待檢抗體或抗原的量存在線性關(guān)系，并經(jīng)過其他相關(guān)處理后，可確定樣品中待測物質(zhì)及其含量.研究表明，ELISA測定方法具有快速、簡便、成本低、自動化程度高，對儀器設(shè)備要求不高，試劑保存時間較長等特點［17－18］，目前 ELISA 已廣泛應(yīng)用于食品安全分析的各個領(lǐng)域.

國內(nèi)在激素殘留檢測方面也取得了很多成果.上海交通大學農(nóng)業(yè)與生物學院研究人員根據(jù)競爭酶免疫反應(yīng)原理，采用己烯雌酚抗體膜和過氧化氫電極組成傳感器主體，將一定量的己烯雌酚和過氧化氫酶標記加到受檢物品中，酶標記的和未標記的己烯雌酚將與膜上的己烯雌酚抗體產(chǎn)生競爭反應(yīng)，根據(jù)酶標己烯雌酚與抗體的結(jié)合率可檢測食品中己烯雌酚激素的含量［12］.目前，該類型傳感器在檢測肉類食品激素殘留方面得到了較好的應(yīng)用.

上海交通大學農(nóng)業(yè)與生物學院研究人員根據(jù)競爭酶免疫反應(yīng)原理設(shè)計的傳感器在檢測肉類食品中的激素殘留獲得了較好的效果［11］.其設(shè)計的己烯雌酚傳感器是由過氧化氫電極和己烯雌酚抗體膜組成，將一定量的過氧化氫酶標記的己烯雌酚加到待測樣品中，酶標記的及未標記的己烯雌酚會與膜上的己烯雌酚抗體發(fā)生競爭反應(yīng)，測定酶標己烯雌酚與抗體的結(jié)合率便可知食品中己烯雌酚的含量.

4 生物傳感器的前景

生物傳感器是一個多學科交叉、融合的高技術(shù)領(lǐng)域，未來生物傳感器的發(fā)展趨勢和主要方向是以微型化、多功能化、芯片化和智能化為前提，開發(fā)新一代低成本、高靈敏度、高可靠性、高壽命和具有仿生功能的生物傳感器，特別是具有生物視覺、聽覺和觸覺等功能的仿生生物傳感器，適應(yīng)食品安全的復(fù)雜形勢，實現(xiàn)食品中各種有害成分的快速、準確測試.未來，生物傳感器將在食品檢測、醫(yī)療保健、疾病診斷、環(huán)境監(jiān)測、發(fā)酵工業(yè)等多個領(lǐng)域得到更加廣泛的應(yīng)用.

21世紀是生命科學的世紀，為生物傳感器的研究提供了前所未有的發(fā)展機遇.各種新型生化物感器微系統(tǒng)將逐步進入人們生活之中，在食品檢測、生物信息學和基因檢測分析等方面發(fā)揮越來越重要的作用.將現(xiàn)代傳感器檢測技術(shù)引入食品安全監(jiān)測中，積極開展食品安全檢測，對保證食品安全和保護人民身體健康有重要的意義.

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(責任編輯:王 寬)

Application of Modern Biosensors in Food Safety Inspection

CHEN Tian-hua1， OUYANG Jian-wen2， TANG Hai-tao1
(1.School of Computer Science and Information Engineering，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China;2.Information Science and Technology College，Hunan Agricultural University，Changsha 410000，China)

The basic principles，structure，types and characteristics of biosensors were introduced in this review.The applications of modern biosensor technology in microbial testing，drug residues and veterinary drug residues detection，food additives and hormones detection in food were elaborated.The important application and development of biosensor technology in food safety inspection were presented.

food testing;biosensors;food safety

TS207

A

1671-1513(2011)01-0070-05

2011-01-08

陳天華，男，教授，主要從事智能信息處理、計算機網(wǎng)絡(luò)測控等方面的研究.