相麗新， 楊道興， 魏彥梅， 顏丙霞

(濟(jì)寧耐特食品有限公司，山東濟(jì)寧 272075)

雞精中呈味核苷酸二鈉的高效液相色譜法測(cè)定

相麗新， 楊道興， 魏彥梅， 顏丙霞

(濟(jì)寧耐特食品有限公司，山東濟(jì)寧 272075)

建立了高效液相色譜法測(cè)定呈味核苷酸二鈉(IMP和GMP)含量的方法.以四丁基磷酸銨和磷酸二氫鉀配以一定比例的乙腈為流動(dòng)相，采用高耐水系Waters RP 18色譜柱，通過(guò)色譜條件的優(yōu)化，獲得了定性定量重復(fù)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差＜2%的標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖，其中，IMP標(biāo)準(zhǔn)曲線在60～600 μg/mL范圍內(nèi)的線性相關(guān)系數(shù)為R=1.0000，GMP標(biāo)準(zhǔn)曲線在50～480 μg/mL范圍內(nèi)的線性相關(guān)系數(shù)為R=0.999 9.測(cè)得某品牌的雞精內(nèi)IMP質(zhì)量含量為0.54%，GMP質(zhì)量含量為0.60%，兩次測(cè)定結(jié)果的精密度GMP為0.73%，IMP為1.17%.

高效液相色譜;呈味核苷酸二鈉;定性定量重復(fù)性;相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差;雞精

呈味核苷酸二鈉(IMP和GMP)一般是以淀粉為原料，經(jīng)發(fā)酵法或酶解法制得的混合物，具有較強(qiáng)的增鮮作用，被廣泛應(yīng)用于各類(lèi)食品中［1－3］.目前國(guó)內(nèi)的IMP和GMP含量檢測(cè)方法主要是紫外分光光度法［3］，此法在樣品中含大量蛋白及其他核酸時(shí)，會(huì)造成檢測(cè)結(jié)果與實(shí)際值偏差較大.采用高效液相色譜法，利用液液反復(fù)分配，并通過(guò)色譜條件的優(yōu)化選擇，可將幾種核苷酸完全分離，同時(shí)獲得定性定量重復(fù)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差＜2%的呈味核苷酸二鈉中的5'-肌苷酸二鈉(disodium 5'-inosinate，IMP)和5'-鳥(niǎo)苷酸二鈉(disodium 5'-guanylate，GMP)的標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)雞精進(jìn)行必要的前處理，獲得了雞精中呈味核苷酸二鈉的含量.與滴定法相比，高效液相色譜法的定量測(cè)定結(jié)果具有更高的重現(xiàn)性，該方法也可為香料生產(chǎn)提供一定的技術(shù)支持.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈，色譜純，美國(guó) Fisher公司;IMP、GMP標(biāo)準(zhǔn)品，美國(guó)Sigma公司，IMP和GMP水合物的純度均為99%，其中，IMP水分含量26%，GMP水分含量21%;四丁基磷酸銨，色譜純，美國(guó)Sigma公司;磷酸二氫鉀，分析純，天津市廣成化學(xué)試劑有限公司.

1.2 儀器與設(shè)備

e2695型高效液相色譜儀(配有可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器和示差檢測(cè)器，Empower色譜工作站)，美國(guó)Waters公司;XS105DU型分析天平，德國(guó)梅特勒·托利多公司;Symmetry shiled RP18型分離柱，4.6 mm×150 mm，5 μm，美國(guó) Waters公司.

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

洗脫液:0.02 mol/L磷酸二氫鉀(0.02%四丁基磷酸銨)的超純水溶液∶乙腈=97∶3(v/v);反相色譜柱(Symmetry shiled RP18，4.6 × 150 mm，5 μm);檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm;流速0.8 mL/min;進(jìn)樣量5 μL.

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)液的配制

分別稱取IMP、GMP標(biāo)準(zhǔn)品0.040 24，0.030 81 g，置于50 mL容量瓶中，用超純水超聲溶解并定容至刻度，搖勻，冷藏于保鮮柜，作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，該儲(chǔ)備液每毫升相當(dāng)于IMP干基589.64 μg，GMP干基481.92 μg，進(jìn)樣前用 0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾.

1.3.3 樣品溶液的制備

稱取雞精樣品0.2 g左右(準(zhǔn)確至0.000 1 g)，用超純水超聲溶解并定容至25 mL，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后待測(cè).

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的線性范圍與重復(fù)性

在50～480 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，HPLC的響應(yīng)峰面積與GMP的標(biāo)準(zhǔn)品濃度呈線性關(guān)系:y=12 180x－78 215(式中x為響應(yīng)峰面積，y為GMP的標(biāo)準(zhǔn)品濃度)，相關(guān)系數(shù)R=0.999 9;在60～600 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，HPLC的響應(yīng)峰面積與IMP的標(biāo)準(zhǔn)品濃度呈線性關(guān)系:y=9 305.7x－85 880(式中x為響應(yīng)峰面積，y為IMP的標(biāo)準(zhǔn)品濃度)，相關(guān)系數(shù)R=1.000 0.實(shí)驗(yàn)建立的GMP與IMP的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖如圖1和圖2;GMP與IMP的HPLC色譜圖如圖3和圖4.

圖1 GMP標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 GMP standard curve

圖2 IMP標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 IMP standard curve

圖3 GMP不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.3 GMP chromatogram of different concentrations standard samples

圖4 IMP不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.4 IMP chromatogram of different concentrations standard samples

2.2 流動(dòng)相條件的確定

參閱目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道的呈味核苷酸二鈉高效液相色譜分離條件［4－9］，先后采用了不同流動(dòng)相對(duì)其分離效果進(jìn)行了優(yōu)化選擇，結(jié)果如表1.

由表1可知，用普通的磷酸鹽緩沖液和碳十八色譜柱很難將二者完全分離，如圖5.而當(dāng)選擇辛烷磺酸鈉為離子對(duì)試劑時(shí)，樣品無(wú)保留，選擇四丁基磷酸銨效果較好.另外，流動(dòng)相中乙腈的含量對(duì)分離效果影響較明顯，通過(guò)反復(fù)對(duì)比實(shí)驗(yàn)論證，流動(dòng)相中添加0.02%的四丁基磷酸銨，3%的乙腈分離效果最好，樣品分離效果的色譜圖如圖6.

表1 不同流動(dòng)相組分對(duì)IMP和GMP分離效果的比較Tab.1 Effects of mobile phase composition on IMP and GMP separation effect comparison

優(yōu)化后的呈味核苷酸二鈉色譜分離條件可獲得分離度較好的譜圖，但由于流速過(guò)低，樣品保留時(shí)間不穩(wěn)定.通過(guò)更換色譜柱，采用System RP18反相柱，柱溫提高到40℃，流速提高到0.8 mL/min，獲得了定性重復(fù)性與定量重復(fù)性的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)＜2%的樣品IMP和GMP的分離色譜圖，獲得了滿意結(jié)果.

圖5 流動(dòng)相添加磷酸二氫鉀時(shí)IMP和GMP產(chǎn)品的色譜圖Fig.5 Production chromatogram of IMP and GMP(mobile phase containing potassium dihydrogen phosphate)

圖6 流動(dòng)相添加磷酸二氫鉀和四丁基磷酸銨時(shí)色譜圖Fig.6 Production chromatogram of IMP and GMP(mobile phase containing potassium dihydrogen phosphate and tetrabutylammonium phosphate monobasic)

2.3 雞精樣品中IMP和GMP含量的檢測(cè)分析

通過(guò)實(shí)驗(yàn)分析，獲得了雞精樣品中呈味核苷酸二鈉的含量即:IMP質(zhì)量含量為0.54%，GMP質(zhì)量含量為0.60%，兩次測(cè)定結(jié)果的精密度 GMP為0.73%，IMP為1.17%，保留時(shí)間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.036%和0.047%.譜圖如圖7.

圖7 優(yōu)化后的IMP和GMP含量色譜圖Fig.7 Chromatogram of IMP and GMP concentration in chicken extract under optimal condition

3 結(jié)論

本文以四丁基磷酸銨和磷酸二氫鉀配以一定比例的乙腈為流動(dòng)相，采用高耐水系Waters RP 18色譜柱，獲得了定性定量重復(fù)性均較優(yōu)的IMP和GMP分離方法，測(cè)得雞精樣品中呈味核苷酸二鈉的總質(zhì)量含量為1.14%，其中 IMP質(zhì)量含量為0.54%，GMP質(zhì)量含量為0.60%;測(cè)定結(jié)果的精密度GMP為0.73%，IMP為1.17%，檢測(cè)結(jié)果滿意.使用該方法測(cè)定IMP和GMP的HPLC色譜圖中，2種物質(zhì)的出峰時(shí)間均小于8 min，分離度較高，測(cè)定結(jié)果快速、簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確可靠.本檢測(cè)方法的建立可為香精及其他食品添加劑中IMP和GMP的定性定量分析提供可靠的數(shù)據(jù)支持，同時(shí)可用于香精新配方中IMP和GMP的含量測(cè)定.

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［6］任一平，黃百芬，連國(guó)義，等.應(yīng)用HPLC反相色譜快速測(cè)定增鮮味精中的鳥(niǎo)苷酸和肌苷酸［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，1994(6):36-41，21.

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(責(zé)任編輯:葉紅波)

Quantitative Determination of Disodium 5'-Inosinate and Disodium 5'-Guanylate in Chicken Extract by HPLC

XIANG Li-xin， YANG Dao-xing， WEI Yan-mei， YAN Bing-xia
(Jining Nature Foods Co.Ltd.，Jining 272075，China)

A high performance liquid chromatography method was established for quantitative determination of disodium 5'-inosinate and disodium 5'-guanylate(IMP and GMP).Using tetrabutylammonium phosphate monobasic and potassim dihydrogen phosphate mixed with a certain proportion of acetonitrile as the mobile phase，the standard samples were analyzed on Waters RP 18 column under the optimal conditions.The qualitative and quantitative reproducibility of RSD were below 2%.On the IMP standard curve，the linear range was 60 ～ 600 μg/mL，the correlation coefficient R being 1.000.On the GMP standard curve，the linear range was 50 ～480 μg/mL，the correlation coefficient R being 0.999 9.The method was used to determine IMP and GMP content in a certain brand of chicken extract，which was 0.54%and 0.60%，respectively，the precision being 0.73%for GMP，1.17%for IMP.

high performance liquid chromatography;disodium 5'-inosinate and diosidm 5'-guanylate;qualitative and quantitative reproducibility;RSD;chicken extract

TS264.2

A

1671-1513(2011)06-0032-03

2011-06-22

相麗新，女，碩士，主要從事食品及添加劑中安全指標(biāo)的檢測(cè)方面的工作.