曾慶飛， 黃惠琴， 朱 軍， 鮑時(shí)翔＊

（1．海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，海口 570228； 2．中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，?？?571101；3．貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草業(yè)研究所，貴陽(yáng) 550006）

根結(jié)線蟲（Meloidogyne spp．）是一類可侵害多種農(nóng)作物根系的固著型內(nèi)寄生植物病原線蟲，由于其寄主范圍廣、致病性強(qiáng)，而且繁殖快、易于傳播擴(kuò)散，已成為世界上最具破壞性的土傳病原物之一，給許多國(guó)家的農(nóng)林、園藝等產(chǎn)業(yè)造成巨大損失［1－2］。在我國(guó)的溫帶及寒冷地區(qū)的溫室中都有根結(jié)線蟲的發(fā)生，特別在熱帶、亞熱帶地區(qū)，蟲卵無需休眠越冬，根結(jié)線蟲的危害十分普遍［3］。在根結(jié)線蟲病害的防治方法中，化學(xué)防治一直占據(jù)著主要地位，但大量高毒高殘留殺線蟲藥劑長(zhǎng)期使用所帶來的人畜中毒及環(huán)境污染等一系列負(fù)面效應(yīng)正日趨明顯，生物防治線蟲病害已成為符合現(xiàn)代農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略理念的首選措施［4－5］。

在眾多的線蟲生防資源中，篩選線蟲生防菌，開發(fā)利用高活性的生防菌株是根結(jié)線蟲生物防治的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，對(duì)線蟲防控具有十分重要的意義［6］。目前世界各國(guó)研究較多的根結(jié)線蟲生防菌主要有真菌、細(xì)菌和放線菌。在生物防治研究領(lǐng)域，利用生物源天然物質(zhì)控制抑殺線蟲被證明是一種有效的防治途徑，從微生物代謝產(chǎn)物中開發(fā)具有殺線蟲活性的物質(zhì)是國(guó)內(nèi)外都很重視的一個(gè)研究課題［5，7－8］。本課題組從海南東寨港紅樹林海泥和五指山原始森林等地的土壤中采集樣品，從中分離篩選具有抗根結(jié)線蟲活性的放線菌，本文報(bào)道了高效菌株HA10002分離篩選、分類鑒定及其活性物質(zhì)的研究結(jié)果。

1 材料與方法

1．1 樣品采集與培養(yǎng)基的配制

從海南東寨港紅樹林采集海泥樣品9份，從五指山原始森林、儋州熱帶植物園、瓊海及定安根結(jié)線蟲發(fā)病胡椒園采集土壤樣品51份。放線菌分離采用高氏1號(hào)合成培養(yǎng)基，添加0．005%的K2Cr2O7作為真菌、細(xì)菌抑制劑；放線菌發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：玉米粉10．0 g，大豆粉10．0 g，可溶性淀粉5．0 g，K2HPO40．5 g，蒸餾水1 000 mL，p H7．2。由于海洋微生物長(zhǎng)期生活在含鹽的海水環(huán)境中，為提高分離效果，對(duì)于紅樹林樣品，培養(yǎng)基中的蒸餾水改用750 mL陳海水＋250 mL蒸餾水。

1．2 供試線蟲

南方根結(jié)線蟲（M．incognita）由本室盆栽保存。保存方法：從海南省農(nóng)科院植保所獲得經(jīng)鑒定純化保存的南方根結(jié)線蟲，在寄主根部挑取純種卵囊孵化出2齡幼蟲（J2）水溶液，接種于用滅菌土培育的盆栽番茄根部，溫室內(nèi)繁殖保存。需要靶標(biāo)線蟲時(shí)，從感染根部挑取卵囊，消毒清洗后置于淺盤濾紙上恒溫遮光孵化，制備2齡線蟲液。

1．3 放線菌分離與待測(cè)樣品的制備

將土壤及海泥樣品經(jīng)處理制成的水懸液作梯度稀釋，分別涂布于分離培養(yǎng)基平板，28℃倒置培養(yǎng)。5～7 d后，經(jīng)肉眼觀察判斷菌落的差異，挑取單菌落純化、保存。菌株分別接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，200 r／min、28℃搖床內(nèi)振蕩培養(yǎng)，7 d后離心，取發(fā)酵液上清，用于活性檢測(cè)。

1．4 拮抗根結(jié)線蟲的活性測(cè)定

初篩 取0．2 mL（約200條J2）線蟲液和1 mL發(fā)酵液分別加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，混勻，25～28℃靜置24 h后倒置顯微鏡下觀察，蟲體僵直不動(dòng)視作被擊倒，計(jì)算校正擊倒率；將被擊倒的線蟲吸入清水中24 h后鏡檢，不能復(fù)活的算作死亡，計(jì)算線蟲校正死亡率。每處理3次重復(fù)，并設(shè)立無菌空白發(fā)酵培養(yǎng)基處理作為對(duì)照［7］。

復(fù)篩選取線蟲校正死亡率在80%以上的菌株，并將發(fā)酵液分別作2、5、10倍和20倍稀釋后再處理線蟲，方法同1．4．1，觀察記錄活性情況。

1．5 菌株鑒定

菌株的培養(yǎng)及形態(tài)特征的觀察參照閻遜初［9］的方法進(jìn)行；生理生化特征鑒定參照Lechevalier等［10］的方法進(jìn)行；以16 S r DNA序列為基礎(chǔ)，參照曾慶飛等［11］的方法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析。

1．6 活性物質(zhì)的分離純化與結(jié)構(gòu)鑒定

過濾收集發(fā)酵液，乙酸乙酯萃取獲得浸膏，通過硅膠柱（粗孔2CX－II）層析、Sephadex L H－20柱色譜等對(duì)所得浸膏進(jìn)行分離純化。純化過程中采用1．4所述的測(cè)定方法進(jìn)行活性跟蹤以確定活性部位，對(duì)活性部分采用HSGF254高效薄層板進(jìn)行薄層層析分析，合并層析帶型相同及相似的組分，并進(jìn)行純度檢測(cè)。采用UV（使用Beck man Coulter Du800核酸蛋白分析儀）、MS（使用 MAT－4510質(zhì)譜儀）和NMR（使用A M－400、核磁共振儀）等技術(shù)，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)分離到的活性化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

2 結(jié)果與分析

2．1 放線菌的分離與篩選結(jié)果

在9份海泥樣品中分離得到93株菌落特征各不相同的放線菌，從51份土壤樣品中分離獲得263株菌落特征有差異的菌株。初篩獲得16株線蟲校正死亡率在80%以上的菌株，占供試菌株的4．5%；復(fù)篩獲得3株線蟲校正死亡率在95%以上的菌株，其中菌株HA10002的發(fā)酵液活性最高，24 h內(nèi)線蟲校正死亡率為100%，稀釋20倍后其校正死亡率仍達(dá)58．5%。采用含75%陳海水的高氏1號(hào)培養(yǎng)基對(duì)菌株連續(xù)進(jìn)行5次繼代培養(yǎng)，同步進(jìn)行線蟲拮抗活性試驗(yàn)，結(jié)果表明，其產(chǎn)生殺線蟲活性物質(zhì)的遺傳性保持穩(wěn)定。因此選取分離自東寨港紅樹林海泥樣品中的菌株HA10002作為進(jìn)一步的研究對(duì)象。

2．2 菌株HA10002的鑒定結(jié)果

2．2．1 形態(tài)和培養(yǎng)特征

菌株HA10002在JCM、Sauton’s、土豆汁、燕麥汁、高氏1號(hào)、甘油天門冬素等6種固體培養(yǎng)基上均生長(zhǎng)良好，形成豐富的氣生菌絲和基內(nèi)菌絲，氣絲白色、淺灰白至灰色，基絲乳白至淺棕色（圖1a），在6種培養(yǎng)基上未見可溶性色素生成；孢子絲成螺旋彎曲，可見1～2級(jí)輪生，孢子圓球形（圖1b）。

圖1 菌株HA10002在高氏1號(hào)培養(yǎng)基上的菌落特征及菌絲形態(tài)（400×）

2．2．2 生理生化特征

菌株HA10002能利用D－葡萄糖、L－鼠李糖、D－甘露糖和蔗糖等幾種碳源，不能利用D－果糖、D－木糖、L－阿拉伯糖和棉子糖。明膠不液化，對(duì)牛奶不凝固、不胨化，不產(chǎn)生類黑色素和H2S，纖維素上不生長(zhǎng)，硝酸鹽反應(yīng)呈陽(yáng)性。

2．2．3 菌株分子鑒定結(jié)果

對(duì)菌株HA10002的16S r DNA擴(kuò)增獲得了約1 428 bp的序列（Gen Bank注冊(cè)號(hào) HQ171094），將該序列在Gen Bank中進(jìn)行同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與菌株HA10002同源性高的均為鏈霉菌，其中與S．a(chǎn)lbogriseol us的序列相似性最高，達(dá)99．3%。將同源性高的模式菌株構(gòu)建包括10株相關(guān)種的系統(tǒng)發(fā)育樹，從圖2看出，菌株HA10002與S．a(chǎn)lbogriseol us和S．viridodiastaticus處于同一分支，但在形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生理生化特性方面與S．viridodiastaticus差異較大，與S．a(chǎn)lbogriseol us比較，HA10002在碳源的利用、明膠液化以及硝酸鹽還原性質(zhì)方面也存在一定差異。綜合分析，將菌株HA10002初步鑒定為白淺灰鏈霉菌（Streptomyces albogriseol us）。

2．3 菌株HA10002發(fā)酵液中殺線蟲活性物質(zhì)的分離與鑒定

2．3．1 殺線蟲活性物質(zhì)的分離純化

HA10002的25L發(fā)酵液經(jīng)3次乙酸乙酯萃取后50℃下減壓濃縮，得到棕褐色膏狀物質(zhì)。利用硅膠柱層析對(duì)萃取所得浸膏進(jìn)行分離，環(huán)己烷：氯仿梯度洗脫，分部收集洗脫液，共得68個(gè)組分。減壓濃縮收集各組分，并進(jìn)行活性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)組分33對(duì)線蟲的校正死亡率為84．7%，組分22、26的殺線蟲活性最明顯，校正死亡率分別達(dá)97．6%和96．4%。

組分22采用Sephadex L H－20柱層析（甲醇與氯仿體積比1∶1為洗脫劑），得到27個(gè)組分，采用HSGF254層析板分析（展開劑氯仿與丙酮體積比＝4∶1），TLC制備，得黃色化合物 A22－1。組分26采用Sephadex L H－20柱層析（甲醇為洗脫劑），得到19個(gè)組分，層析分離后得到白色活性化合物A26－3。

2．3．2 殺線蟲活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定

化合物A26－3，白色針狀結(jié)晶；改良碘化鉍鉀顯橘紅色，提示為含氮化合物；mp 192．5～194．5℃；IRυKBrmax c m－1：3 508～3 110、2 938、2 856、1 627、1 551，表明仲酰胺、羥基和亞甲基的存在；ESI－MS m／z 601．4［M＋H］＋，表明 A26－3的分子量為600；經(jīng)Scifinder scholar聯(lián)機(jī)檢索分子量為600的化合物，共檢出154個(gè)，在將S2的1H、13C－NMR數(shù)據(jù)與154個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)符合性比較中發(fā)現(xiàn)，A26－3與諾卡胺素（nocar damine）的結(jié)構(gòu)比較相似，查閱諾卡胺素鑒定的相關(guān)文獻(xiàn)［12－13］，并進(jìn)行1H、13C－NMR的數(shù)據(jù)比對(duì)，表明兩者數(shù)據(jù)基本一致，鑒定化合物A26－3為諾卡胺素，分子式C27H48N6O9，結(jié)構(gòu)如圖3所示。

圖2 基于16Sr DNA的菌株HA10002與相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3 化合物A26－3的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

化合物A22－1，黃色無定形粉末，紫外光譜顯示在337、340 n m和320 n m處有最大吸收，表明其結(jié)構(gòu)中存在較大共軛體系。紅外光譜顯示分子中可能含有羥基（3 417、1 066、1 006 c m－1），酯鍵（1 723、1 172、1 137 c m－1），共軛雙鍵（3 023、1 639、849 c m－1），4個(gè)以上相連的亞甲基單元（721 c m－1）。13C NMR和 DEPT譜共顯示36個(gè)碳信號(hào)。FAB－MS圖譜顯示m／z 707（M＋Na），表明 A22－1的分子量為684。經(jīng) Scifinder scholar聯(lián)機(jī)檢索，發(fā)現(xiàn)A22－1可能為一新化合物。由于該化合物分子量較大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其結(jié)構(gòu)還在進(jìn)一步的解析中。

3 討論

放線菌是一類重要的抗生素產(chǎn)生菌，是微生物農(nóng)藥的重要來源，世界各國(guó)從放線菌中尋找新抗生素和為抗生素開辟新途徑的工作一直十分活躍［14］。放線菌中的一些種類能夠產(chǎn)生具有抗生或殺線蟲特性的化合物，已報(bào)道的主要有鏈霉菌及其變種［15］。本文篩選出的較高活性菌株HA10002來源于海岸紅樹林中的海泥樣品，經(jīng)鑒定為白淺灰鏈霉菌。古靜燕等［16］研究報(bào)道，她們篩選出的海洋來源白淺灰鏈霉菌菌株A2002具有抗腫瘤活性，并鑒定出其活性成分主要為三環(huán)縮醛內(nèi)酯素類化合物，它們具有細(xì)胞周期抑制活性、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞毒性作用。但尚未見白淺灰鏈霉菌中有線蟲拮抗菌株的報(bào)道。

本文從菌株HA10002的發(fā)酵產(chǎn)物中分離出了2個(gè)具有殺線蟲活性的化合物A26－3和A22－1，其中A26－3為諾卡胺素，屬于大環(huán)內(nèi)酯化合物。據(jù)報(bào)道，諾卡胺素有抗菌尤其是抗四環(huán)素耐藥菌株的活性［17］，但與鐵離子絡(luò)合成Ferrioxamine E后，抗菌活性會(huì)消失［18］；另外，諾卡胺素還能誘導(dǎo)昆蟲BMN4細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生改變［19］，但未見諾卡胺素有線蟲拮抗活性的報(bào)道，本文拓展了該活性物質(zhì)的抗性譜。另?yè)?jù)報(bào)道，Nocar dia sp．［20］、Streptomyces hygroscopicus var．gel danus［17］、Pseudomonas stutzeri［13］能產(chǎn)生諾卡胺素，但也未見Streptomyces albogriseol us能產(chǎn)生諾卡胺素的報(bào)道，本文同時(shí)擴(kuò)展了鏈霉菌中諾卡胺素產(chǎn)生菌的種類范圍。另外，A22－1可能為一新的殺線蟲化合物，而且HA10002發(fā)酵產(chǎn)物中的組分33對(duì)線蟲也具有較高的殺滅活性，這對(duì)菌株產(chǎn)活性次生代謝產(chǎn)物的進(jìn)一步研究具有重要意義。

從菌株HA10002的發(fā)酵產(chǎn)物中分離出的化合物在實(shí)驗(yàn)測(cè)定條件下都具有較強(qiáng)的殺線蟲活性，但在大田環(huán)境中的生防效果還有待于進(jìn)一步鑒定。下步研究除繼續(xù)鑒定活性物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)外，主要任務(wù)將集中在生防菌劑的研制及其田間防效的系統(tǒng)測(cè)定上，并對(duì)活性物質(zhì)的線蟲毒殺機(jī)理作出探討。

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