王冬梅， 丁瑞豐， 李海強， 李號賓， 汪 飛，阿克旦·吾外士， 徐 遙， 劉 建

（新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所，烏魯木齊 830091）

棉鈴蟲［Helicover pa ar miger a （Hübner）］是影響我國棉花生產(chǎn)的主要害蟲之一。自20世紀(jì)80年代開始種植轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉花，既增加了棉花產(chǎn)量，又節(jié)約了生產(chǎn)成本，同時減少了農(nóng)藥使用，轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉花迅速得到大面積推廣應(yīng)用。但各地轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉花的抗蟲性表現(xiàn)差異很大，主要是由于不同品種轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉花不同生長期或同一生長期的不同組織器官殺蟲蛋白表達量不同所致［1－8］。由于新疆南部棉花種植面積的迅速擴大及糧食作物復(fù)種次數(shù)的增加，棉鈴蟲同樣成為新疆棉花生產(chǎn)持續(xù)發(fā)展的主要障礙之一，轉(zhuǎn)Bt基因棉花在新疆的種植面積迅猛發(fā)展。然而有關(guān)新疆轉(zhuǎn)Bt基因棉花品種的Bt殺蟲蛋白的時空動態(tài)少有報道。本文利用ELISA技術(shù)對南疆種植的轉(zhuǎn)Bt基因棉花品種的Bt殺蟲蛋白時空表達規(guī)律進行研究，為該地區(qū)有效利用轉(zhuǎn)Bt基因棉花來防治棉鈴蟲提供依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 轉(zhuǎn)基因抗蟲棉

轉(zhuǎn)Bt基因棉花‘SGK321’由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所提供，‘236’、‘K9030’和‘T3’由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所提供，‘中棉所41’（‘CCRI 41’）、‘中棉 所 43’（‘CCRI 43’）、‘中 棉 所 44’（‘CCRI 44’）、‘中棉所45’（‘CCRI 45’）和‘K7’在當(dāng)?shù)胤N子公司購買。

供試棉花品種在喀什地區(qū)莎車縣塔尕爾其鄉(xiāng)于2009年4月5日－6日和2010年4月7日－9日播種，2009年種植的品種有‘CCRI41’、‘CCRI43’、‘236’、‘K9030’、‘T3’和‘SGK321’，2010年種植的品 種 有 ‘CCRI41’、‘CCRI43’、‘CCRI44’、‘CCRI45’、‘K7’和‘SGK321’，每品種的種植面積為333．3 m2。種植密度、水肥管理、噴施縮節(jié)胺等化控管理采用當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)管理技術(shù)。棉花播種時采用80%多菌靈粉劑按照m（制劑）∶m（種子）＝1∶50的比例拌種，防治爛種和爛根，保證出苗。子葉期噴灑30%乙酰甲胺磷乳油150 mL／667 m2防治棉薊馬和地老虎，保護棉花生長點，保證棉花正常生長。子葉期后不使用任何殺蟲劑。

1．2 棉花組織Bt殺蟲蛋白含量測定

2009年分別在棉花生長的子葉期（4月15日）、三葉期（5月10日）、七葉期（6月2日）、現(xiàn)蕾期（6月24日）、花鈴期（7月15日）和吐絮期（9月28日），2010年分別在棉花生長的子葉期（4月25日）、三葉期（5月15日）、七葉期（6月11日）、現(xiàn)蕾期（6月27日）、開花期（7月12日）、花鈴期（7月26日）、結(jié)鈴期（8月23日）和吐絮期（10月3日）等生育期進行采樣，分別采摘子葉、主莖頂端完全展開的第2片葉、棉蕾（直徑約0．5～0．7 c m）、花（未授粉前）、鈴（直徑約1．2 c m），每品種每器官采集20個，所有樣品在低溫狀態(tài)帶回室內(nèi)于－20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

酶聯(lián)免疫生測試劑盒選用美國EnviroLogix公司Cryl Ab／Cryl Ac的ELISA定量檢測試劑盒（AP003，檢測極限為0．1 ng／g）進行棉花組織Bt殺蟲蛋白含量檢測，每處理重復(fù)3次。按試劑盒說明書上的步驟進行測定。所有結(jié)果均由酶標(biāo)儀（MK3）讀取，波長為450 nm。每次試驗均用Cryl A標(biāo)樣制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出樣品中的Bt殺蟲蛋白含量，換算成每克鮮重殺蟲蛋白含量，用ng／g表示。

1．3 數(shù)據(jù)處理

采用DPS統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析和Duncan多重比較。

2 結(jié)果與分析

2．1 轉(zhuǎn)Bt基因棉花不同發(fā)育時期葉片中Bt殺蟲蛋白含量

在2009年隨著棉花發(fā)育期的推進，‘CCRI41’、‘CCRI43’、‘236’、‘K9030’、‘T3’和‘SGK321’各時期葉片的Bt殺蟲蛋白均在子葉期達到最高，隨后呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，至吐絮期到達最低點，僅‘T3’在花鈴期達到低點?！瓹CRI41’、‘CCRI43’、‘236’、‘K9030’和‘T3’在現(xiàn)蕾期顯著升高（表1）。

表1 轉(zhuǎn)Bt基因棉花不同發(fā)育時期葉片中Bt殺蟲蛋白含量（2009年）1）

6個品種子葉期子葉的Bt殺蟲蛋白含量平均值為1 514．6 ng／g，三葉期、七葉期、現(xiàn)蕾期、花鈴期和吐絮期頂葉中的Bt殺蟲蛋白含量平均值為1 046．7、544．7、804．5、399．8 ng／g和222．0 ng／g，與子葉相比，分別下降了30．9%、64．0%、46．9%、73．6%和85．3%。

在同一棉花發(fā)育期，不同品種間的Bt殺蟲蛋白差異顯著，以‘SGK321’葉片中Bt殺蟲蛋白含量在各時期均表現(xiàn)為最高，其次是‘CCRI41’。

從表2可以看出，在2010年，所有供試品種葉片的Bt殺蟲蛋白在子葉期最高，隨后逐漸下降，其中，‘CCRI41’、‘CCRI43’和‘CCRI44’至現(xiàn)蕾期達到低點，花鈴期明顯上升，‘CCRI45’和‘K7’在現(xiàn)蕾期達到低點，持續(xù)到吐絮期，‘SGK321’到開花期達到低點，持續(xù)到吐絮期。

6個品種子葉期子葉的Bt殺蟲蛋白含量平均值為1 791．7 ng／g，三葉期、七葉期、現(xiàn)蕾期、開花期、花鈴期、結(jié)鈴期和吐絮期頂葉中的Bt殺蟲蛋白含量平均值為1 070．1、633．4、358．6、22．8、68．0、14．4 ng／g和25．3 ng／g，與 子 葉 相比，分 別 下降 了 40．3%、64．7%、80．0%、98．7%、96．2%、99．2%和98．6%。

表2 轉(zhuǎn)Bt基因棉花不同發(fā)育時期葉片中Bt殺蟲蛋白含量（2010年）1）

此外，在同一發(fā)育期內(nèi)不同品種間Bt殺蟲蛋白含量明顯不同。其中，‘SGK321’葉片中Bt殺蟲蛋白含量在子葉期、三葉期、七葉期、現(xiàn)蕾期和花期表現(xiàn)為最高，其次是‘CCRI41’。

2．2 轉(zhuǎn)Bt基因棉花花鈴期不同器官Bt殺蟲蛋白含量

2009年花鈴期不同器官的Bt殺蟲蛋白含量差異顯著。供試6個品種均以棉鈴和花苞葉中Bt殺蟲蛋白含量最低，其他器官依含量高低可分成2類：一是葉（棉蕾）、花柱和花瓣，品種有‘CCRI41’、‘CCRI43’和‘T3’；二是葉、棉蕾、花瓣和花柱，品種有‘236’、‘K9030’和‘SGK321’（表3）。

‘CCRI41’、‘CCRI43’和‘T3’葉片中的Bt殺蟲蛋白含量平均值為472．3 ng／g，棉蕾、花瓣、花柱、花苞葉和鈴中的Bt殺蟲蛋白含量分別為405．4、162．3、272．5、54．4 ng／g和112．5 ng／g，與葉片相比，分別下降了14．2%、65．6%、42．3%、88．5%和76．2%。

‘236’、‘K9030’和‘SGK321’葉片中的Bt殺蟲蛋白含量平均值為644．72 ng／g，棉蕾、花瓣、花柱、花苞葉和鈴中的Bt殺蟲蛋白含量分別為414．6、251．3、293．6、58．9 ng／g和79．0 ng／g，與葉片相比，分別下降了35．7%、61．0%、54．5%、90．9%和87．8%。

表3 轉(zhuǎn)Bt基因棉花花鈴期不同器官中Bt殺蟲蛋白含量（2009年）1）

2010年6個品種花苞葉的Bt殺蟲蛋白含量最低。其中4個品種‘CCRI41’、‘CCRI43’、‘CCRI44’和‘CCRI45’均依次表現(xiàn)為葉片＞棉蕾＞花瓣＞花苞葉，僅‘K7’和‘SGK321’表現(xiàn)為花瓣＞葉片＞棉蕾＞花苞葉（表4）。

‘CCRI41’、‘CCRI43’、‘CCRI44’和‘CCRI45’葉片中的Bt殺蟲蛋白含量平均值為82．9 ng／g，棉蕾、花瓣和花苞葉中的Bt殺蟲蛋白含量分別為31．7、16．1 ng／g和6．1 ng／g，與葉片相比，分別下降了61．7%、80．5%和92．6%。

‘K7’和‘SGK321’葉片中的Bt殺蟲蛋白含量平均值為48．18 ng／g，棉蕾、花瓣和花苞葉中的Bt殺蟲 蛋 白 含 量 分 別 為 25．64、63．57 ng／g 和10．77 ng／g，與葉片相比，棉蕾和花苞葉分別下降了46．8%和77．6%，而花瓣增加了31．9%。

表4 轉(zhuǎn)Bt基因棉花花鈴期不同器官中Bt殺蟲蛋白含量（2010年）1）

3 討論

本文利用ELISA技術(shù)分2年對南疆種植的轉(zhuǎn)Bt基因棉‘CCRI41’、‘CCRI43’、‘236’、‘K9030’、‘T3’、‘CCRI44’、‘CCRI45’、‘K7’和‘SGK321’的Bt殺蟲蛋白含量進行測定，結(jié)果表明大多數(shù)棉花葉片的殺蟲蛋白含量隨著棉花發(fā)育進程而逐漸下降，到鈴期或吐絮期達到低點，這與許多學(xué)者［1－2，4］的觀點相同，這些學(xué)者均認(rèn)為隨著棉花生育期的推進，葉片的Bt殺蟲蛋白表達逐漸減弱；與邢朝柱、張俊和陳鵬等［6－8］的觀點不同，他們認(rèn)為棉花不同發(fā)育時期葉片的Bt殺蟲蛋白含量表現(xiàn)為初花期＞蕾期、花鈴期＞苗期＞吐絮期。在空間表達上，在花鈴期，所有品種的花苞葉和棉鈴的殺蟲蛋白含量最低，大多數(shù)品種表現(xiàn)為葉片、棉蕾、花瓣（花柱）、棉鈴和花苞葉殺蟲蛋白含量依次降低，與張永軍、王保民、Bakhsh、陳鵬和邢朝柱等［2－3，5－6，8］的觀點基 本吻 合，他們認(rèn)為在花鈴期，不同棉花器官的Bt殺蟲蛋白含量從高到低依次為葉、小蕾、幼鈴、花器官和苞葉，而本文中花器官高于棉鈴中的Bt殺蟲蛋白含量。

通過本文和國內(nèi)外學(xué)者對轉(zhuǎn)Bt基因棉花Bt殺蟲蛋白表達的研究，均認(rèn)為Bt殺蟲蛋白含量存在明顯變化，呈現(xiàn)時空表達，在棉花生長前期，Bt殺蟲蛋白含量快速上升，在棉花生長后期，則開始下降，這主要是因為在棉花生長前期Bt基因過量表達，導(dǎo)致后期基因沉默或啟動子甲基化［9］。這種時空差異受到品種［10］、作物年齡［11］、基因類型和基因插入位點［12－13］、特定的環(huán)境壓力［14－17］以及農(nóng)事操作［18］等影響。

喀什地區(qū)莎車縣位于新疆西南邊陲，屬暖溫帶極干旱氣候區(qū)，棉花種植采用“矮、密、早”栽培模式，與國內(nèi)外其他棉區(qū)的轉(zhuǎn)基因棉品種、氣候、生態(tài)條件和栽培模式等都有很大不同，這也是造成轉(zhuǎn)Bt基因棉花種植到不同地區(qū)，其Bt殺蟲蛋白含量有很大不同的原因。

然而，從本文2年的試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)在南疆莎車地區(qū)種植的轉(zhuǎn)Bt基因棉花的Bt殺蟲蛋白含量也明顯不同，尤其是2009年在現(xiàn)蕾期后葉片中的Bt殺蟲蛋白含量增加，2010年現(xiàn)蕾期后葉片中的Bt殺蟲蛋白含量卻下降，一方面可能是由品種特性決定的，另一方面可能是由于2年中的氣候差異所造成的。

由于轉(zhuǎn)Bt基因棉花在時空表達上存在明顯差異，主要表現(xiàn)為棉花生長后期Bt蛋白表達量下降，這些現(xiàn)象對轉(zhuǎn)Bt基因棉花的持續(xù)發(fā)展十分不利。而新疆南疆棉區(qū)的棉鈴蟲主要是第1代和第2代為害棉田（即5月初－7月中旬），本文中所選用的轉(zhuǎn)Bt基因棉在棉鈴蟲高峰期間具有較高的Bt蛋白表達，能夠較好地防治1代和2代棉鈴蟲，再加強后期棉鈴蟲的化學(xué)防控，就能取得良好的經(jīng)濟效益。本文研究結(jié)果可為選擇高效、穩(wěn)定的轉(zhuǎn)Bt基因棉來合理有效防治棉鈴蟲奠定基礎(chǔ)。

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