謝 明， 張艷軍， 吳 剛， 徐 鵬

（1．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所／植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室／農(nóng)業(yè)部生物防治重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，北京 100193； 2．南京農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物系，南京 210095）

中國是世界上轉(zhuǎn)基因作物種植大國之一，種植的轉(zhuǎn)基因作物以轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉為主，其種植面積約350萬hm2，占我國棉花種植總面積的80%以上［1］。隨著轉(zhuǎn)Bt基因棉花的大面積商品化種植，其植株殘體［2］、根系分泌物［3］和花粉［4］等不斷向土壤中釋放 Bt毒蛋白，且進(jìn)入土壤的Bt毒素可被土壤黏粒吸附而不易被微生物降解，引起B(yǎng)t毒素在土壤中的累積［5］，有可能對土壤生態(tài)系統(tǒng)的安全產(chǎn)生一定的影響。

土壤生態(tài)系統(tǒng)是物質(zhì)循環(huán)和能量轉(zhuǎn)化過程的重要場所，而其中碳、氮、硫、磷等各類元素的物質(zhì)循環(huán)都需要土壤酶的參與。土壤酶主要來自微生物細(xì)胞，也可來自動植物組織，它同活細(xì)胞一同推動著土壤生態(tài)系統(tǒng)中物質(zhì)的循環(huán)和能量的流動。土壤酶活性已被證實(shí)可作為衡量土壤生物學(xué)活性及肥力的重要指標(biāo)［6－7］，其中代表性的土壤酶為土壤脫氫酶、脲酶和磷酸酶，它們的活性可分別表征土壤呼吸狀況、土壤氮素狀況和土壤磷素狀況。國內(nèi)外已有一些關(guān)于轉(zhuǎn)Bt棉花對土壤酶活性影響的報道，主要是室內(nèi)或可控環(huán)境下的試驗(yàn)結(jié)果［8－14］。本研究以大田棉花為研究對象，全季節(jié)系統(tǒng)檢測自然條件下轉(zhuǎn)基因棉對土壤酶活性的影響，以期為評價轉(zhuǎn)基因植物的安全性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 供試植物及試驗(yàn)地設(shè)置

供試棉花品種選用‘GK－12’（轉(zhuǎn)cr y1 Ac抗蟲棉）和‘SM－3’（親本常規(guī)棉），種植于河北省廊坊市舊州鄉(xiāng)炊莊村，每個棉花品種設(shè)3個小區(qū)，每個小區(qū)面積為64 m2，按隨機(jī)區(qū)組排列。

1．2 土壤樣品采集

采用5點(diǎn)取樣法，取樣位點(diǎn)距棉花主根分別設(shè)5、15 cm和25 cm 3個距離，每個小區(qū)5點(diǎn)土樣混合均勻后留取200 g作為一個樣品。取樣時，先用鐵鏟去掉2 cm表層土，然后用管式采樣器垂直取2～20 c m深的土壤，裝入10號自封袋帶回實(shí)驗(yàn)室，保存于－20℃冰箱待測。根據(jù)棉花生育期，共安排6次樣品采集，分別為苗期（6月7日）、蕾期（7月15日）、開花盛期（8月24日）、結(jié)鈴期（9月10日）、吐絮前期（9月25日）和枯死期（11月12日）。

1．3 土壤酶活性及理化性質(zhì)測定

土壤脫氫酶活性采用氯代三苯基四氮唑（TTC）法測定（以24 h內(nèi)1 g干土中生成的TPF量計），脲酶活性采用靛酚比色法測定（以24 h內(nèi)1 g干土中生成的NH3－N量計），磷酸酶活性采用對硝基苯磷酸二鈉法（以24 h內(nèi)1 g干土中生成的酚量計），具體測定參照關(guān)松蔭法［15］。試驗(yàn)地土壤理化性質(zhì)：黏性壤土，土壤有機(jī)碳含量9．0 g／kg，有機(jī)質(zhì)含量15．6 g／kg，全氮含量310 mg／kg，堿解氮含量431．8 mg／kg，速效磷含量21．9 mg／kg，速效鉀含量377．7 mg／kg，p H為8．1。

1．4 數(shù)據(jù)分析

用SAS 6．12（SAS Instit ute Inc．USA，1996）統(tǒng)計分析軟件分析處理間試驗(yàn)數(shù)據(jù)的差異顯著性。單因素方差分析比較轉(zhuǎn)基因棉花與常規(guī)親本棉花同一生育期同一根系距離區(qū)域內(nèi)酶活性的差異，處理間的顯著性測定采用LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2．1 轉(zhuǎn)基因棉‘GK－12’和親本棉‘SM－3’根區(qū)土壤脫氫酶的差異

轉(zhuǎn)基因棉‘GK－12’和親本棉‘SM－3’根區(qū)土壤脫氫酶活性在整個生育期呈先升高后降低再升高的變化趨勢，兩棉花品種均以吐絮期的土壤脫氫酶活性最低，但是兩者土壤脫氫酶活性最高點(diǎn)的出現(xiàn)時期不同，轉(zhuǎn)基因棉‘GK－12’盛花期酶活性最高，而常規(guī)親本棉‘SM－3’酶活性最高值則出現(xiàn)在蕾期（圖1a，b，c）。轉(zhuǎn)基因棉‘GK－12’盛花期和枯死期根區(qū)5 c m的土壤脫氫酶活性顯著高于親本棉‘SM－3’（p＜0．05）（圖1a），而轉(zhuǎn)基因棉‘GK－12’根區(qū)15 c m和25 c m的土壤脫氫酶活性在盛花期顯著高于親本棉‘SM－3’（p＜0．05）（圖1b，c）。在棉花其他生育期，轉(zhuǎn)基因棉‘GK－12’根區(qū)5、15 c m和25 c m土壤脫氫酶活性與其親本棉‘SM－3’無顯著差異（p＞0．05）（圖1a，b，c）。

2．2 轉(zhuǎn)基因棉‘GK－12’和親本棉‘SM－3’根區(qū)土壤脲酶的差異

轉(zhuǎn)基因棉‘GK－12’和親本棉‘SM－3’根區(qū)土壤脲酶活性在整個生育期未表現(xiàn)出明顯的起伏變化。土壤脲酶活性在轉(zhuǎn)基因棉‘GK－12’與其親本棉‘SM－3’根區(qū)5、15 c m和25 c m范圍內(nèi)無顯著差異（p＞0．05）（圖2 a，b，c）。

2．3 轉(zhuǎn)基因棉‘GK－12’和親本棉‘SM－3’根區(qū)土壤磷酸酶的差異

常規(guī)親本棉‘SM－3’根區(qū)土壤磷酸酶活性在蕾期顯著低于其他生育期。在整個生育期，轉(zhuǎn)基因棉‘GK－12’和親本棉‘SM－3’根區(qū)土壤脲酶活性無顯著差異（p＞0．05）（圖3 a，b，c）。轉(zhuǎn)基因棉‘GK－12’在蕾期根區(qū)5 c m和15 c m的土壤磷酸酶活性顯著高于親本棉‘SM－3’（p ＜0．05）（圖3a，b），而對根區(qū)25 c m的土壤磷酸酶活性無顯著影響（p＞0．05）（圖1c）。在棉花其他生育期，轉(zhuǎn)基因棉‘GK－12’根區(qū)5、15 c m和25 c m土壤磷酸酶活性與其親本棉‘SM－3’無顯著差異（p ＞0．05）（圖3 a，b，c）。

3 討論

土壤酶是土壤生態(tài)系統(tǒng)中最活躍的組分之一，主要來自土壤微生物，如細(xì)菌、真菌、放線菌等［6］，轉(zhuǎn)基因作物對土壤酶活性影響的文獻(xiàn)已有大量報道，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為轉(zhuǎn)基因作物對土壤酶活性有一定影響［8，11－12］，極少部分學(xué)者認(rèn)為轉(zhuǎn)基因作物對土壤酶活性無明顯影響［9］。在本研究中，轉(zhuǎn)cr y1 Ac抗蟲棉‘GK－12’根區(qū)土壤脫氫酶活性在盛花期顯著高于其親本棉‘SM－3’，所得結(jié)果與已有文獻(xiàn)關(guān)于轉(zhuǎn)Bt棉‘蘇抗103’和親本棉‘蘇棉12’土壤脫氫酶的研究結(jié)果類似［12］。轉(zhuǎn)cr y1 Ac抗蟲棉‘GK－12’根區(qū)土壤磷酸酶活性在蕾期顯著高于其親本棉‘SM－3’，馬麗莉等［14］的研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)cr y1 Ac抗蟲棉‘GK－12’根區(qū)土壤磷酸酶活性與親本棉相比無差異，這可能與試驗(yàn)地土壤理化性質(zhì)及采樣時間不同有關(guān)。

轉(zhuǎn)基因作物對土壤生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生影響的途徑有兩種，一是通過轉(zhuǎn)基因作物在生長過程中或收割后遺留在田間的植株殘體及花粉向土壤中釋放，這是外源蛋白進(jìn)入土壤的主要途徑。二是通過轉(zhuǎn)基因植物根系分泌物進(jìn)入土壤，從而影響土壤生態(tài)系統(tǒng)［17］。如：通過無菌土培和水培試驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)Bt基因玉米、馬鈴薯和水稻能通過根系分泌物的形式分泌一定量的Bt蛋白。轉(zhuǎn)基因毒素能通過吸附作用與土壤活性顆粒結(jié)合在一起，在土壤中會逐漸富集。如黏土礦物、腐殖酸、有機(jī)礦物聚合體等可吸附外源蛋白。Bt毒蛋白基因多達(dá)幾百種，用于轉(zhuǎn)基因植物研究的僅為個別基因，常見的如cry1Ab和cry1Ac，不同Bt基因?qū)ν寥郎鷳B(tài)帶來的影響可能很不一樣。吳偉祥等［18］研究發(fā)現(xiàn)，在實(shí)驗(yàn)室條件下，添加水稻秸稈粉碎組織后，土壤脫氫酶和磷酸酶活性均顯著提高，但轉(zhuǎn)cry1Ab基因克螟稻和非轉(zhuǎn)基因親本稻間沒有差異。在大田條件下，劉微等［19］研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)cry1Ab基因克螟稻和非轉(zhuǎn)基因親本稻根際土壤脫氫酶和磷酸酶活性沒有顯著差異?？梢?，轉(zhuǎn)基因作物對土壤中的酶活性影響是一個復(fù)雜的問題，縱觀本試驗(yàn)的結(jié)果，可以看出，供試的轉(zhuǎn)基因棉花對土壤酶活在一些時期存在明顯的影響，但影響的程度不是很大，在棉花的后期生長中基本可得到恢復(fù)。本文的數(shù)據(jù)僅為一個生長季節(jié)的數(shù)據(jù)，結(jié)論尚為初步，更全面的評價有待深入研究。

［1］ James C．Global status of co mmercialized Biotech／GM crops：2010［R］．ISAAA Brief No．42．ISAAA：Ithaca，NY，2010．

［2］ Saxena D，F(xiàn)lorest S，Stotzky G．Insecticidal toxin in root exudates fr o m Bt cor n［J］．Nature，1999，402：480．

［3］ 王建武，駱世明，馮遠(yuǎn)嬌，等．轉(zhuǎn)Bt基因作物Bt毒素在土壤中的環(huán)境去向及其生態(tài)效應(yīng)［J］．生態(tài)學(xué)報，2003，23（4）：797－804．

［4］ Losey J E，Rayor L S，Cartet M E．Transgenic pollen har msmonarch larvae［J］．Nature，1999，399：214．

［5］ Tapp H，Stotzky G．Adsor ption and binding of t he insecticidal pr oteins fr o m Bacill us t huringiensis subsp．kurstaki and subsp．tenebrionis on clay［J］．Soil Biol Biochem，1994，26：663－679．

［6］ Ku mar J D，Shar ma G D，Mishra R R．Soil micr obial population nu mbers and enzy me activities in relation to altitude and f orest degradation［J］．Soil Biol Biochem，1992，24：761－767．

［7］ 張?jiān)伱?，周國逸，吳寧．土壤酶學(xué)的研究進(jìn)展［J］．熱帶亞熱帶植物學(xué)報，2004，12（1）：83－90．

［8］ Jepson P C，Croft B A，Pratt G E．Test systems to deter mine t he ecological risks posed by toxin release f or Bacill us thuringiensis genes in crop plants［J］．Mol Ecol，1994，3（1）：81－89．

［9］ Ren F S，Hong C，Wan H G．Transgenic Bt cotton has no apparent effect on enzy matic activities or f unctional diversity of microbial communities in rhizosphere soil［J］．Plant Soil，2006，285：149－159．

［10］張麗莉，武志杰，陳利軍，等．轉(zhuǎn)基因棉種植對土壤水解酶活性的影響［J］．生態(tài)學(xué)雜志，2006，25（11）：1348－1350．

［11］Sun C X，Chen L J，Wu Z J，et al．Soil persistence of Bacill us thuringiensis（Bt）toxin fr o m transgenic Bt cotton tissues and its effect on soil enzy me activities［J］．Biol Fertil Soils，2007，43：617－620．

［12］萬小羽，梁永超，李忠佩，等．種植轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉對土壤生物學(xué)活性的影響［J］．生態(tài)學(xué)報，2007，27（12）：5414－5420．

［13］葉飛，牛高華，劉慧芬，等．轉(zhuǎn)基因棉花種植對根際土壤酶活性的影響［J］．華北農(nóng)學(xué)報，2008，23（4）：201－203．

［14］馬麗穎，崔金杰，陳海燕．種植轉(zhuǎn)基因棉對4種土壤酶活性的影響［J］．棉花學(xué)報，2009，21（5）：383－387．

［15］關(guān)松蔭．土壤酶及其研究法［M］．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1986：45－60．

［16］鮑士旦．土壤農(nóng)化分析［M］．第3版．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2000．

［17］Liu B，Zeng Q，Yan F M，et al．Effects of transgenic microorganis ms［J］．Plant Soil，2005，271：1－13．

［18］Wu W X，Ye Q F，Min H，et al．Bt－transgenic rice straw affects t he cult urable micr obiota and dehydrogenase and phosphatase activities in a flooded paddy soil［J］．Soil Biol Biochem，2004，36：289－295．

［19］Liu W，Lu H H，Wu W X，et al．Transgenic Bt rice does not affect enzy me activities and micr obial co mposition in t he r hizosphere during cr op develop ment［J］．Soil Biol Bioche m，2008，40：475－486．