張國偉，李彩霞，王艷峰，黃 羽，蘇芝軍，鄭 芳，曾 星*

1河北大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，保定071002;2廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣州510006; 3中國醫(yī)藥集團(tuán)四川抗菌素工業(yè)研究所，成都610051;4陜西省府谷縣人民醫(yī)院，府谷719400

豬苓及豬苓多糖對(duì)BBN聯(lián)合糖精作用Fisher-344大鼠肝臟代謝酶的影響

張國偉1，李彩霞2，王艷峰3，黃 羽2，蘇芝軍4，鄭 芳2，曾 星2*

1河北大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，保定071002;2廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣州510006;3中國醫(yī)藥集團(tuán)四川抗菌素工業(yè)研究所，成都610051;4陜西省府谷縣人民醫(yī)院，府谷719400

以BBN聯(lián)合糖精作用Fisher-344大鼠，分別使用ELISA及RT-PCR方法測定樣本中CYP450、GST和NQO1酶活性及Gstpi和NQO1 mRNA相對(duì)表達(dá)含量。結(jié)果表明，豬苓及豬苓多糖均可使樣本中CYP450酶活性顯著降低，其中豬苓對(duì)CYP450酶活性抑制呈劑量依賴性;豬苓及豬苓多糖對(duì)樣本中GST無明顯影響，豬苓可顯著升高樣本中NQO1酶活性;豬苓高劑量及豬苓多糖可上調(diào)GSTPi mRNA表達(dá)，豬苓及豬苓多糖對(duì)NQO1 mRNA表達(dá)無明顯作用。研究表明豬苓及豬苓多糖抗癌作用與降低CYP450與升高NQO1酶活性有關(guān)，但機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

豬苓;豬苓多糖;細(xì)胞色素P450;Ⅱ相代謝酶

豬苓及豬苓多糖對(duì)N-丁基-N-(4-羥丁基)亞硝胺(BBN，N-butyl-N-(4-hydroxy--butyl)-nitrosamine)聯(lián)合糖精(Saccharin)誘導(dǎo)大鼠膀胱癌具有顯著的預(yù)防作用，其預(yù)防作用與上調(diào)實(shí)驗(yàn)鼠膀胱組織中Ⅱ相酶谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶-π(GSTPi，glutathione S-transferase-π)和NADP(H)醌氧化還原酶(NQO1，NAD(P) H:quinone oxidoreductase 1)有關(guān)［1］。本文研究豬苓及豬苓多糖對(duì)BBN聯(lián)合糖精作用大鼠肝臟中代謝酶細(xì)胞色素P450(CYP450，cytochrome P450)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST，glutathione S-transferase)、NQO1活性及GSTPi、NQO1mRNA表達(dá)作用。

1 材料、試劑與儀器

豬苓，江陰天江藥業(yè)有限公司，每克相當(dāng)于10克生藥，用前按劑量溶于生理鹽水;豬苓多糖，廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司，用前按劑量溶于生理鹽水; BBN，日本TCI株式會(huì)社;糖精，上海第六制藥廠。Trizol，Invitrogen，Carlsbad，CA;PrimescriptTM RT reagent，SYBP Premix Ex TaqTM，TAKARA;氯仿、異丙醇及無水乙醇均為新開瓶分析純。

PCR儀，ABI 7500 Real Time PCR System;UV-4000紫外可見分光光度計(jì)，Pharmacia Biotech公司;電泳儀，BIO-RAD;BIO-RAD Gel Dox XR凝膠成相系統(tǒng)。

2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

雌性Fisher-344大鼠60只，7周齡，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)開始前實(shí)驗(yàn)動(dòng)物前于實(shí)驗(yàn)環(huán)境中適應(yīng)3 d。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給予含0.05% BBN飲用水階段于廣東醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行，給予供試物階段于廣東省中醫(yī)藥科學(xué)院動(dòng)物房進(jìn)行。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵守廣東省中醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理規(guī)范，動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境，溫度為23±2℃，濕度為55±5%，12 h/12 h白晝交替，自由飲水，標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)飼料。

圖1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及造模示意圖Fig.1 Experimental animal groups and bladder cancer model establishment

將大鼠隨機(jī)分為6組，每組10只，即生理鹽水組，模型組，豬苓多糖組(130 mg/kg)，豬苓50 mg/ kg組，豬苓250 mg/kg組和豬苓500 mg/kg組。除生理鹽水組外，其它5組實(shí)驗(yàn)大鼠從實(shí)驗(yàn)開始到第8周給予含0.05%BBN的飲用水;第8周后，實(shí)驗(yàn)大鼠開始給予含5%糖精的飲用水，至第20周截止;從第9周開始給予豬苓及豬苓多糖供試物，劑量為1 ml/100 g，給藥至實(shí)驗(yàn)結(jié)束為止［圖1］。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，所取肝臟組織于-80℃凍存。

3 方法

3.1 CYP450、GST和NQO1酶活性測定

3.1.1 肝臟樣本的制備

切取并稱量大鼠肝臟約100 mg，加入一定量4℃預(yù)冷PBS中，電動(dòng)勻漿器6000～8000 r/min勻漿30 s，制備成5%勻漿液，10000 g離心30 min，分離上清，置于-80℃保存。

3.1.2 酶活性測定

標(biāo)準(zhǔn)品依次濃度為360、240、120、60、30、15 mIU/L。以酶聯(lián)免疫法測定大鼠肝臟組織中各酶活性，測定波長為450 nm。

3.2 肝臟Gstpi和NQO1 mRNA相對(duì)表達(dá)含量總RNA制備及RT-PCR實(shí)驗(yàn)

取適量肝臟組織，置于0.01%DEPC處理過的玻璃勻漿器中，加入1 mlTRIZOL后于冰浴上勻漿，得TRIZOL勻漿液后，每1 mLTRIZOL加入0.2 mL氯仿，劇烈震蕩30 s后靜置15 min，之后12000×g在4℃離心15 min，取上層清液，加入0.5 mL異丙醇，上下顛倒搖晃均勻后室溫放置10 min，后12000 ×g在4℃離心10 min，棄去上清，加入0.8 mL以無水乙醇配制的75%乙醇，輕輕敲打后8000×g在4℃離心10 min，洗滌2次，之后棄去酒精，將EP管置于通風(fēng)廚中吹干酒精，加入20μL Rnase/Dnase水，吹打數(shù)次，溶解后取出10 μL，加入590 μL滅菌水中，以UV4000測定RNA純度及濃度。根據(jù)所測定RNA濃度使用TAKARA公司PrimescriptTM RT reagent依據(jù)使用說明反轉(zhuǎn)錄得到 cDNA，加入總RNA量為1 μg，反應(yīng)體系為20 μL，并使用TAKARA公司SYBP Premix Ex TaqTMⅡ進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)使用儀器為ABI 7500 Real Time PCR System，擴(kuò)增條件為95℃ 5 s，60℃34 s，40個(gè)循環(huán)。

引物:

Gstpi sense，AATGCCATCTTGAGGCACCTG;antisense，ATGAGGGTACCATATTTGCATCGAA;

NQO1 sense，TGGAAGCTGCAGACCTGGTG;an-tisense，TTGTCATACATGGTGGCATACGTG;

引物設(shè)計(jì)由GeneBank得到序列后設(shè)計(jì)，Gstpi，NM_012577.2，NQO1，NM_017000.3;產(chǎn)物擴(kuò)增長度為:Gstpi-125 bp，NQO1-130 bp，β-actin-150 bp。

3.3 統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以means±S.D.表示，以Dunnett's t test方法評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)性差異，P＜0.05為有顯著統(tǒng)計(jì)性差異。

4 結(jié)果

4.1 豬苓及豬苓多糖對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠肝臟CYP450、GST及NQO1酶活性測定

與正常組比較，豬苓多糖及豬苓50、250和500 mg/kg給藥組肝臟微粒體中CYP450和GST酶活性明顯降低，差異非常顯著(P＜0.01);豬苓多糖及豬苓50和250 mg/kg給藥組肝臟微粒體中NQO1酶活性明顯升高，差異顯著(P＜0.05或P＜0.01)。

表1 大鼠肝臟CYP450、GST及NQO1酶活性Table 1 Quantification of Liver CYP450，GST，NQO1 by ELISA assay in each group.

4.2 豬苓及豬苓多糖對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠肝臟 GSTPi，NQO1 mRNA相對(duì)表達(dá)含量

與正常組比較，豬苓多糖組及豬苓500 mg/kg組實(shí)驗(yàn)大鼠肝臟GSTPi mRNA相對(duì)表達(dá)含量上調(diào)，差異顯著(P＜0.05);其它各組GSTPi及NQO1 mRNA表達(dá)均無顯著性差異。

表2 大鼠肝臟GSTPi，NQO1相對(duì)表達(dá)含量Table 2 Quantification of Liver GSTPi，NQO1 expression by RT-PCR assay in each group

5 討論

接觸和攝入環(huán)境中的各種化學(xué)致癌物，如苯并芘、黃曲霉素、有機(jī)氯磷農(nóng)藥以及亞硝胺化合物等，是引發(fā)各種癌癥的主要原因。化學(xué)致癌物多為脂溶性，從細(xì)胞和機(jī)體中清除的前提是必須提高其親水性，該過程可分為Ⅰ期和Ⅱ期。首先經(jīng)Ⅰ相代謝酶如細(xì)胞色素P450作用后，在疏水的化學(xué)致癌物中引入羥基;接著在肝臟Ⅱ相代謝酶如GST、NQO1、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UGT)等的作用下，在已產(chǎn)生的羥基上再糖基化，進(jìn)一步提高化合物的水溶性而促進(jìn)其排出體外［2］。與Ⅰ相酶不同，Ⅱ相代謝酶的誘導(dǎo)不會(huì)增加致癌風(fēng)險(xiǎn)，因此誘導(dǎo)Ⅱ相代謝酶的活性是化學(xué)防癌的關(guān)鍵步驟［3，4］。

對(duì)細(xì)胞色素P450系的調(diào)控作用，在藥物相互作用上扮演著至關(guān)重要的角色。從對(duì)細(xì)胞色素P450酶活性的影響看，豬苓多糖及豬苓均可使P450酶活性顯著降低，其中豬苓對(duì)P450酶活性的抑制呈劑量依賴性。豬苓多糖為豬苓中降低P450酶活性的主要成分，其它成分有無降低P450酶活性作用及豬苓及其主要成分抑制P450酶活性具體亞型還有待深入研究。

Ⅱ相代謝酶主要有GST、NQO1等。流行病學(xué)研究證實(shí)Ⅱ相酶GST和NQO1的缺失或下降與人類膀胱癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)［5-8］，敲除小鼠GSTPi和NQO1可誘導(dǎo)腫瘤［9-11］，二者在預(yù)防膀胱癌形成的過程中起到重要作用［7，12］。

誘導(dǎo)Ⅱ相代謝酶的活性是化學(xué)防癌的關(guān)鍵步驟。實(shí)驗(yàn)中，豬苓對(duì)可使NQO1酶活性顯著降低，但高劑量豬苓卻未對(duì)肝臟NQO1酶活性產(chǎn)生明顯影響，說明此劑量下豬苓對(duì)肝臟NQO1酶活性無明顯作用;豬苓多糖對(duì)肝臟NQO1酶活性也無明顯作用。從模型組GST酶活性可以推測，BBN及糖精誘導(dǎo)性Fisher-344大鼠肝臟GST酶活性顯著下降，實(shí)驗(yàn)中豬苓多糖及豬苓各劑量組均不能明顯增加GST酶活性，與模型組比較，肝臟GST酶活性無顯著差異，可推測豬苓多糖及豬苓對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠肝臟GST酶活性影響不大。

豬苓多糖及豬苓500 mg/kg有明顯上升實(shí)驗(yàn)大鼠肝臟GSTPi mRNA相對(duì)表達(dá)含量作用，其它各組GSTPi mRNA相對(duì)表達(dá)含量與正常組比較未見明顯作用。豬苓多糖組及豬苓各劑量組對(duì)大鼠肝臟NQO1 mRNA相對(duì)表達(dá)含量未見有明顯作用。

GSTPi為GST酶系統(tǒng)中與膀胱癌發(fā)生密切相關(guān)的亞型酶，實(shí)驗(yàn)中豬苓多糖及豬苓500 mg/kg可明顯上調(diào) GSTPi mRNA表達(dá)，此結(jié)果與 GST總酶ELISA結(jié)果不同，顯示豬苓多糖及豬苓高劑量可上調(diào)GSTPi mRNA表達(dá)，但對(duì)GST酶整體活性無明顯作用。同樣，與ELISA方法測定豬苓多糖及豬苓對(duì)實(shí)驗(yàn)鼠肝臟NQO1結(jié)果不同，豬苓多糖及豬苓對(duì)NQO1 mRNA表達(dá)無明顯作用，結(jié)果暗示二者還有可能通過其它途徑影響NQO1酶活性。

豬苓可顯著降低大鼠肝臟CYP450酶活性，豬苓對(duì)CYP450酶活性呈劑量性依賴作用，豬苓中豬苓多糖為抑制CYP450酶活性成分之一;豬苓高劑量及豬苓多糖能升高GST亞型GSTPi活性，對(duì)總的GST酶活性影響并不明顯;豬苓中低劑量可上升大鼠肝臟NQO1酶活性，豬苓多糖并無此作用，全部劑量豬苓對(duì)NQO1 mRNA無明顯影響，豬苓對(duì)NQO1的升高作用可能還通過其它途徑。

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Effects of Aqueous Extract of Sclerotia of Polyporus umbellatus and Polyporus Polysaccharide on Liver Metabolic Enzyme of Fisher-344 Rats Induced by BBN Combined Saccharin

ZHANG Guo-wei1，LI Cai-xia2，WANG Yan-feng3，HUANG Yu2，SU Zhi-jun4，ZHENG Fang2，ZENG Xing2*1College of Chinese Medicine，Hebei University，Baoding 071002，China;2Guangdong Provincial Academy of Chinese Medical Sciences，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006，China;3Sinopharm ChuanKong pharmaceutical CO.，LTD，Chengdu 610051，China;4Fugu Peoples Hospital of Shanxi，F(xiàn)ugu 719400，China

The present aimed to evaluate effects of sclerotia of P.umbellatus FRIES aqueous extract(SPUE)and Polyporus polysaccharide(PPS)on liver metabolic enzyme of Fisher-344 rat induced by N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine(BBN)combined saccharin.The rat liver enzyme activities of CYP450，glutathione S-transferase(GST)，and NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1(NQO1)were determined by ELISA.The relative expressions of liver glutathione S-transferase π(GSTPi)and NQO1 mRNA were measured with RT-PCR.The present report showed the SPUE and PPS decreased the activity of rat liver CYP450 enzyme，the effect had dose-effect relationship;they had no significant effect on the activity of rat liver GST enzyme，and they could increase the activity of rat liver NQO1 enzyme;the high dose SPUE could up-regulate the GSTPi mRNA relative expression in rat liver，they had no effect on the NQO1 mRNA relative expression in rat liver.In conclusion，the inhibition of bladder carcinogenesis by SPUE and PPS associate with the decreasing of rat liver CYP450 enzyme activity and increasing of NQO1 enzyme activity，but the mechanism needs further research.

sclerotia of Polyporus umbellatus;Polyporus polysaccharide;CYP450;Ⅱphase enzyme

1001-6880(2011)05-0923-04

2010-08-23 接受日期:2010-12-13

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2010B030700059);河北大學(xué)科研基金資助項(xiàng)目(2101Q46);河北省衛(wèi)生廳科研基金項(xiàng)目(20110514)

*通訊作者 Tel:86-20-39318678;E-mail:zengxing-china@163.com

R285.5

A