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        HPLC測定葛花中6″-O-木糖鳶尾苷的含量

        2011-11-23 16:24:04姚美村廖祎婷袁月梅
        關(guān)鍵詞:葛花鳶尾木糖

        姚美村,廖祎婷,袁月梅,高 越,湯 毅

        中山大學(xué)藥學(xué)院藥,廣州510006

        HPLC測定葛花中6″-O-木糖鳶尾苷的含量

        姚美村,廖祎婷,袁月梅,高 越,湯 毅*

        中山大學(xué)藥學(xué)院藥,廣州510006

        本文建立了葛花中6″-O-木糖鳶尾苷含量測定的HPLC方法。采用GRACE C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱,流動相為乙腈-水梯度洗脫,流速為0.8 mL/min,紫外檢測波長為265 nm,柱溫為室溫。6″-O-木糖鳶尾苷的峰面積(Y)與濃度(X)在10.33~185.99 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,Y=30731X–216635,r= 0.9992(n=7);平均回收率為100.2%,RSD<2%(n=9);測得8批葛花藥材中6″-O-木糖鳶尾苷含量為11.08~48.23 mg/g。方法學(xué)驗證結(jié)果表明該法準(zhǔn)確、可靠,可用于葛花中主要成分6″-O-木糖鳶尾苷的含量測定。

        葛花;6″-O-木糖鳶尾苷;高效液相色譜法;解酒;不同產(chǎn)地

        葛花又名葛條花,是豆科(Leguminasae)植物野葛(Pueraria Lobata(Willd.)Ohwi)或干葛藤(P.thomsonii Benth.)的干燥花,中醫(yī)主要用于解酒醒脾,是很具代表性的解酒藥物[1],著名解酒方劑“葛花解醒湯”已流傳使用數(shù)百年?,F(xiàn)代研究已證實葛花確有解酒和護肝作用[2],近年來的相關(guān)研究多集中于異黃酮成分方面,認(rèn)為該類成分是解酒的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)[3,4]。目前,葛花質(zhì)量控制常采用葛根素為對照品,以紫外分光光度法測定總黃酮含量[5];也有報道以葛花苷等為對照品,采用高效液相色譜法測定了其中的部分黃酮類成分[6]。本研究在對不同來源葛花藥材分析中發(fā)現(xiàn)葛花苷和葛根素的含量非常低,而另外兩種異黃酮成分——鳶尾苷和6″-O-木糖鳶尾苷的含量則相對較高。本文建立了葛花中6″-O-木糖鳶尾苷含量測定的HPLC方法,并對8批不同產(chǎn)地葛花中的該成分進行了分析。

        1 材料與方法

        1.1 儀器與材料

        Waters高效液相色譜系統(tǒng)(含Waters 1525泵,Waters 2487雙通道紫外檢測器,Waters 717plus自動進樣器,Breeze色譜工作站,美國Waters公司);電子恒溫水浴鍋(廣東省汕頭市醫(yī)用設(shè)備廠);DZF-6051型真空干燥箱(上海一恒科技有限公司); SB25-12D超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

        甲醇(分析純,江蘇漢邦科技有限公司),乙腈(色譜純,江蘇漢邦科技有限公司),超純水;6″-O-木糖鳶尾苷(自制,經(jīng)HPLC歸一化法測定純度為99.1%);8批葛花藥材(廣州市藥材公司),經(jīng)中山大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)王軍副教授鑒定為野葛(Pueraria Lobata(Willd.)Ohwi)的干燥花,標(biāo)本存于中山大學(xué)藥學(xué)院(No.20071019)。

        1.2 實驗方法

        1.2.1 色譜條件

        GRACE C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)(美國格雷斯公司)色譜柱,流動相:乙腈(A)-水(B),線性梯度洗脫,(A∶B∶0 min 15∶85;35 min 50∶50;36 min 15∶85;40 min 15∶85;v/v);流速:0.8 mL/min;紫外檢測波長:265 nm;室溫。

        1.2.2 供試品溶液的制備

        取葛花藥材約50 g,精密稱定,以70%乙醇500 mL浸泡1 h后,在水浴中回流提取1 h。藥渣用70%乙醇400 mL,在同樣條件下提取兩次,每次1 h,合并提取液。將提取液減壓回收乙醇后,殘余物置真空干燥箱中干燥,稱重。精密稱取干燥提取物約20 mg,用80%甲醇少量超聲溶解后,以80%甲醇定容于50 mL量瓶中,搖勻,過0.45 μm微孔濾膜,取續(xù)濾液,即得供試品溶液。

        1.2.3 對照品溶液的制備

        精密稱取6″-O-木糖鳶尾苷對照品9.3 mg,以少量80%甲醇超聲溶解,置于50 mL量瓶中,以80%甲醇稀釋至刻度,搖勻,制成含量為185.99 μg/mL的對照品溶液。

        1.2.4 系統(tǒng)適用性試驗

        取按“1.2.2”和“1.2.3”項下制備的供試品溶液和對照品溶液,按“1.2.1”項下色譜條件進行測定。

        1.2.5 線性關(guān)系考察

        精密吸取上述185.99 mg/mL的對照品溶液0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL和10.0 mL,分別置于10 mL量瓶中,加80%甲醇至刻度,得到質(zhì)量濃度分別為10.33、30.99、61.99、92.99、124.00、155.00 μg/mL和185.99 μg/mL的對照品溶液;分別精密吸取上述7個不同濃度的對照品溶液10 μL,按2.1項下色譜條件進行測定,以峰面積(Y)對6″-O-木糖鳶尾苷的濃度(X)進行線性回歸。

        1.2.6 精密度試驗

        準(zhǔn)確吸取對照品溶液10 μL,在同一條件下重復(fù)進樣5次,測定6″-O-木糖鳶尾苷的吸收峰面積。

        1.2.7 重復(fù)性試驗

        取同一批號的葛花樣品,平行稱定6份,分別按“1.2.2”項下方法制備供試品溶液6份,每份精密吸取10 μL,測定峰面積并計算6″-O-木糖鳶尾苷的含量,RSD為0.88%,表明本法重復(fù)性較好。

        1.2.8 加樣回收試驗

        取已測定6″-O-木糖鳶尾苷含量的葛花樣品適量,精密稱定9份,每3份加入相同量的6″-O-木糖鳶尾苷對照品,分別按“1.2.2”項下方法制備供試品溶液,取續(xù)濾液10 μL進行測定。

        1.2.9 樣品測定

        取8批不同來源的葛花樣品,按“1.2.2”項下方法制備供試品溶液,精密吸取供試品溶液10 μL,測定6″-O-木糖鳶尾苷的峰面積,并計算各樣品中6″-O-木糖鳶尾苷的含量。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 6″-O-木糖鳶尾苷理論塔板數(shù)為11732,6″-O-木糖鳶尾苷峰與各相臨峰的分離度均大于1.5,對應(yīng)圖譜見圖1。

        圖1 6″-O-木糖鳶尾苷對照品(A)及葛花藥材(B)的HPLC色譜圖Fig.1 The representative HPLC chromatograms of(A)6″-O-xylosyl-tectoridin standard and(B)a 70%ethanol extract of Flos Pueraria from Jiangsu province a.6″-O-木糖鳶尾苷;a.6″-O-xylosyl-tectoridin

        2.2 6″-O-木糖鳶尾苷回歸方程為Y=30731X–216635,r=0.9992(n=7),表明其濃度在10.33~185.99 μg/mL與峰面積呈良好線性關(guān)系。精密度試驗結(jié)果RSD為0.78%,表明精密度良好。重復(fù)性試驗結(jié)果RSD為0.88%,表明本法重復(fù)性較好。加樣回收試驗結(jié)果見表1,平均回收率為100.2%,RSD為2.4%。

        2.3 樣品測定結(jié)果表明,不同產(chǎn)地葛花藥材中均檢測到6″-O-木糖鳶尾苷,其含量隨產(chǎn)地不同而有變化。8批葛花樣品中6″-O-木糖鳶尾苷的含量見表2

        表1 加樣回收試驗結(jié)果(n=9)Table 1 Recoveries of 6″-O-xylosyl-tectoridin in Flos Pueraria samples(n=9)

        表2 不同產(chǎn)地樣品測定結(jié)果(n=3)Table 2 The contents of 6″-O-xylosyl-tectoridin in Flos Pueraria samples from 8 origins of production in China(n=3)

        2.4 討論

        2.4.1 在對不同來源葛花樣品進行HPLC分析的過程中,發(fā)現(xiàn)鳶尾苷和6″-O-木糖鳶尾苷的含量非常高,遠遠超出了葛花苷的含量,為了更好的測定葛花中異黃酮成分的含量,本研究建立了葛花藥材中主要異黃酮類成分6″-O-木糖鳶尾苷的HPLC測定方法,并對不同產(chǎn)地的葛花中的6″-O-木糖鳶尾苷進行了含量測定。結(jié)果表明,該方法中6″-O-木糖鳶尾苷的色譜峰面積與其濃度具有良好的線性關(guān)系,精密度和重復(fù)性都較好,平均加樣回收率為100.2%;8批不同來源的葛花藥材中均明顯檢測到有較高含量的6″-O-木糖鳶尾苷存在,其含量在11.08~48.23 mg/g范圍內(nèi)。

        2.4.2 現(xiàn)代藥理學(xué)研究已證實,葛花發(fā)揮解酒作用的主要有效成分是異黃酮化合物[1],其中的主要成分為葛花苷。然而本研究在對不同來源葛花樣品的HPLC分析中,即使采用文獻[6]報道的分析方法,也沒有檢測到有明顯的葛花苷存在。Kim CS等[7]的研究結(jié)果表明,在儲放5年以內(nèi)的葛花中幾乎檢測不到葛花苷,而主要為鳶尾苷和6″-O-木糖鳶尾苷等成分[7],本研究結(jié)果也表明,放置時間較短的葛花藥材中的鳶尾苷和6″-O-木糖鳶尾苷確實含量比較高,而葛花苷和葛根素幾乎檢測不到。因此,本研究在建立了鳶尾苷含量測定方法之外,又建立了葛花中另外一種主要成分6″-O-木糖鳶尾苷的含量測定方法,為更全面評價葛花的質(zhì)量提供了方法學(xué)基礎(chǔ)。

        2.4.3 本研究建立了葛花中6″-O-木糖鳶尾苷的含量測定方法,可用于葛花藥材中此類成分的定量分析。然而,與已有文獻中認(rèn)為葛花苷為葛花特異性成分相比,6″-O-木糖鳶尾苷是否可以單獨作為葛花的定量分析指標(biāo),或者是否可以與另外一種主要成分鳶尾苷共同作為質(zhì)量評價指標(biāo),仍有待通過對更多不同產(chǎn)地的葛花樣品,結(jié)合相應(yīng)的藥理藥效實驗進行全面綜合考察和評價。

        1 Yin JT(尹俊亭),Zhong Y(仲英),Sun JY(孫敬勇).Review of researches progress on Pueraria lobata.Chin Tradit Herb Drugs(中草藥),2005,36:1905-1906.

        2 Chinese Materia Medica Editorial Board in State Administration of Traditional Chinese Medicine(國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會).Chinese Materia Medica 4(中華本草4).Shanghai:Shanghai Science and Technology Press,1999.619.

        3 Lee HW,Choo MK,Bea EA.β-Glucuronidase inhibitor tectorigenin isolated from the flower of Pueraria thunbergiana protects carbon tetrachloride induced liver injury.Liver Int,2003,23:221.

        4 Han YO,Han MJ,Park SH,et al.Protective effects of kakkalide from Flos Puerariae on ethanol-induced lethality and hepatic injury are dependent on its biotransformation by human intestinal microflora.J Pharmacol Sci,2003,93:331-336.

        5 Li W(李文),He D(賀殿),Wang X(王曉),et al.Determination of total flavonoids in Flos Puerariae.Northwest Pharm J(西北藥學(xué)雜志),2005,20:14-15.

        6 Zhang SP(張淑萍),He Y(賀云),Liu BT(劉柏濤).Determination of kakkalide,kakkalidone and irisolidone in the flowers of Pueraria lobata by RP-HPLC.Chin J Anal Lab(分析試驗室),2006,25:74-76.

        7 Kim CS,Shin SM,Ha HK,et al.Study of substance changes in flowers of Pueraria thunbergiana Benth.during storage.Arch Pharm Res,2003,26:210-213.

        Determination of 6″-O-xylosyl-tectoridin in Flos Puerariae by HPLC

        YAO Mei-cun,LIAO Yi-ting,YUAN Yue-mei,GAO Yue,TANG Yi*
        School of Pharmaceutical Sciences,Sun Yat-sen University,Guangzhou 510006,China

        An HPLC method for determination of 6″-O-xylosyl-tectoridin in Flos Puerariae was developed.The samples were separated on a C18(250 mm ×4.6 mm,5 μm)column with the mobile phase of acetonitrile-water(gradient elution).Flow rate was 0.8 mL/min.The detection wavelength was set at 265 nm.Column temperature was ambient temperature.The linear range of 6″-O-xylosyl-tectoridin was 10.33-185.99 μg/mL,and the linear function was Y=30731X–216635(r=0.9992).The average recovery was 100.2%,and RSD was less than 2%(n=9).The contents of 6″-O-xylosyl-tectoridin in Flos Puerariae was 11.08-48.23 mg/g.The method was accurate and reliable,which can be used to evaluate the qualities of Flos Puerariae.

        Flos Puerariae;6″-O-xylosyl-tectoridin;HPLC;hangover alleviating;different origins of production

        1001-6880(2011)05-0898-04

        2009-12-14 接受日期:2010-04-08

        中山大學(xué)2008年實驗室開放基金項目″葛花異黃酮類成分的藥動/藥效學(xué)研究″資助

        *通訊作者 E-mail:Tigertang@21cn.com

        R284.1

        A

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