吳玉東，馮敏英，陸 慧，徐漢虹

華南農(nóng)業(yè)大學(xué)天然農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510642

非洲山毛豆幼莖愈傷組織培養(yǎng)及其魚藤酮含量檢測(cè)

吳玉東，馮敏英，陸 慧，徐漢虹*

華南農(nóng)業(yè)大學(xué)天然農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510642

以MS為基本培養(yǎng)基，以非洲山毛豆幼莖為外植體進(jìn)行培養(yǎng)，探索2，4-D質(zhì)量濃度與不同濃度的激素組合對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響，對(duì)最佳組合培養(yǎng)基不同培養(yǎng)時(shí)間的愈傷組織中魚藤酮含量進(jìn)行HPLC測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明以1.00 mg/L 2，4-D和0.70 mg/L 6-BA組合的MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)效果最佳，其誘導(dǎo)的愈傷組織分別培養(yǎng)30、60 d和90 d后魚藤酮的含量分別為干愈傷組織的0.0013%、0.016%和0.06%，非洲山毛豆幼莖愈傷組織中的魚藤酮含量隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而提高，統(tǒng)計(jì)分析顯示差異顯著。

非洲山毛豆;愈傷組織;激素;魚藤酮;HPLC;生物農(nóng)藥

非洲山毛豆(Tephrosia vogelii)屬于豆科，蝶形花亞科，灰葉屬，多年生灌木或小喬木，原產(chǎn)于熱帶非洲的一種殺蟲植物，主要分布于北緯15°至南緯20°之間的廣大地區(qū)，整株均含有魚藤酮，尤以葉片中的含量最高［1］。魚藤酮(rotenone)具有觸殺、胃毒、拒食和熏蒸作用，殺蟲譜廣，對(duì)15個(gè)目137科的800多種害蟲具有一定的防治效果，對(duì)蚜螨類害蟲效果尤其突出，是無(wú)公害農(nóng)產(chǎn)品和綠色食品的理想生物農(nóng)藥［2］。

20世紀(jì)40年代后期，Bonner首次報(bào)道銀膠菊植物組織培養(yǎng)物可以產(chǎn)生橡膠;50年代末期，West和Mike發(fā)現(xiàn)阿托品顛茄堿在根部合成聚集可由根部愈傷組織衍生誘導(dǎo);其后，在用組織培養(yǎng)技術(shù)產(chǎn)生有用的次生代謝物方面取得了很大成就［3］。目前藥用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展迅速，已從被研究的400多種植物細(xì)胞中分離出600多種次生代謝產(chǎn)物，其中有60多種在含量上超過(guò)或等于原植物［4］，因此，利用細(xì)胞工程技術(shù)生產(chǎn)有用的次生代謝物質(zhì)具有廣闊的應(yīng)用前景。利用組織培養(yǎng)技術(shù)，誘導(dǎo)愈傷組織，提取藥用活性成分的方法在許多藥用植物研究方面被采用。由于魚藤酮分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，難以人工合成，目前主要從植物中提取獲得，但魚藤酮類化合物的生產(chǎn)受到植物資源、生長(zhǎng)季節(jié)、提取工藝等方面的限制。用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)包括魚藤酮類化合物在內(nèi)的次生物質(zhì)是當(dāng)前生物工程中最活躍的研究領(lǐng)域之一。研究非洲山毛豆植株內(nèi)魚藤酮類化合物的相關(guān)報(bào)道較多，但未見(jiàn)有關(guān)利用非洲山毛豆愈傷組織提取魚藤酮的研究報(bào)道。國(guó)內(nèi)外對(duì)非洲山毛豆愈傷組織的誘導(dǎo)研究沒(méi)有相關(guān)報(bào)道，但對(duì)魚藤酮含量的定量測(cè)定的報(bào)道很多［5］。

本研究以非洲山毛豆的嫩莖為原始誘導(dǎo)材料，以MS附加不同水平組合的2，4-D、NAA、6-BA為愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基［6］，結(jié)合廣泛采用的HPLC法檢測(cè)愈傷組織內(nèi)的魚藤酮，以探索植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)植物次生代謝的調(diào)控作用，為組織或細(xì)胞大量培養(yǎng)工業(yè)化生產(chǎn)魚藤酮提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 非洲山毛豆愈傷組織誘導(dǎo)、培養(yǎng)

1.1.1 外植體

外植體:非洲山毛豆幼莖組織采自本實(shí)驗(yàn)室植物標(biāo)本園內(nèi)。

1.1.2 外植體消毒

將幼莖先用自來(lái)水沖洗5 min，再將材料用洗潔精洗凈，無(wú)菌操作臺(tái)上吸水紙吸干后分別使用0.1%HgCl消毒8 min、75%酒精浸泡30 s、無(wú)菌水清洗5次進(jìn)行表面消毒處理，備用。

1.1.3 愈傷組織的誘導(dǎo)

以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加2，4-D、6-BA、NAA濃度(表1)，121℃滅菌30 min，倒入15 cm培養(yǎng)皿，每皿30 mL，冷卻待用。

表1 誘導(dǎo)培養(yǎng)基的成分Table 1 Callus induction cultivation

1.1.4 無(wú)菌接種

莖段:將已經(jīng)消好毒的幼莖用手術(shù)刀切去其上葉片并刮傷莖部，再切成0.5 cm長(zhǎng)的小段接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。

接種量:每一個(gè)處理接3個(gè)培養(yǎng)皿(3個(gè)重復(fù))，每皿接8塊外植體，共計(jì)有40組實(shí)驗(yàn)、200個(gè)重復(fù)、約1000塊外植體。

1.1.5 培養(yǎng)

暗誘導(dǎo)培養(yǎng):溫度25±1℃、濕度85% ±5%條件下各暗培養(yǎng)20 d。

1.1.6 觀測(cè)記錄與數(shù)據(jù)處理

誘導(dǎo)時(shí)間:外植體接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基后每天觀察一次，每個(gè)處理三個(gè)重復(fù)中第一塊外植體長(zhǎng)出愈傷組織所需時(shí)間即為該處理的愈傷組織誘導(dǎo)時(shí)間。

計(jì)算愈傷組織誘導(dǎo)率的公式:

愈傷組織誘導(dǎo)率(%)=產(chǎn)生愈傷組織外植體個(gè)數(shù)/接入外植體個(gè)數(shù)×100%

在繼代培養(yǎng)前觀察記錄愈傷組織的顏色、形狀和生長(zhǎng)狀態(tài)。

1.2 非洲山毛豆愈傷組織增殖繼代培養(yǎng)及魚藤酮檢測(cè)

選取8種誘導(dǎo)培養(yǎng)基(表1)中誘導(dǎo)培養(yǎng)的黃綠色、生長(zhǎng)旺盛、結(jié)構(gòu)疏松、大小一致愈傷組織，在無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)接到8種繼代培養(yǎng)基上(表1)進(jìn)行增殖繼代培養(yǎng)，每組處理接5個(gè)重復(fù)，每瓶接3塊愈傷組織。其后每天觀察記錄愈傷組織的顏色、形狀和生長(zhǎng)狀態(tài)。

1.2.1 培養(yǎng)物中魚藤酮的提取及檢測(cè)

愈傷組織內(nèi)魚藤酮的提取:取出繼代培養(yǎng)的愈傷組織，在干燥箱中50±5℃下烘干，稱取干愈傷組織1.00 g，研磨成粉。加入丙酮20.0 mL超聲波提取30 min，黑暗靜置48 h，4000 r/min離心取上清液，0.45 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后放入4℃冰箱中待測(cè)。

1.2.2 魚藤酮含量的HPLC測(cè)定

1.2.2.1 儀器

美國(guó)惠普高效液相色譜儀配置四元梯度泵、紫外可見(jiàn)光波長(zhǎng)檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器、惠普化學(xué)工作站。色譜柱:Hypersil ODS柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);檢測(cè)器:紫外檢測(cè)器;

1.2.2.2 條件

柱溫:25℃;檢測(cè)波長(zhǎng):299 nm;流速:1.00 mL/ min;進(jìn)樣量:5 μL;定量方法:外標(biāo)法。

魚藤酮標(biāo)樣由Sigma公司提供(含量＞95%，批號(hào):14511DH)。提取所用有機(jī)溶劑均為分析純，HPLC分析所用有機(jī)溶劑均為色譜純，水均為Milli-Q純水。所用混合溶劑各組分的比例或濃度均為體積比或體積分?jǐn)?shù)。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備:精密稱取魚藤酮對(duì)照品適量，用丙酮配成800 mg/L溶液，做為標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用丙酮溶解魚藤酮標(biāo)準(zhǔn)品，配成25、50、100、200、400 mg/L和800 mg/L的溶液，按照1.2.1的分析方法測(cè)定魚藤酮的含量。以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制魚藤酮標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)非洲山毛豆愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響

非洲山毛豆幼莖在MS培養(yǎng)基上分別接種，培養(yǎng)基中附加2，4-D、6-BA或NAA。在暗培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)愈傷組織。接種7 d后，組織塊開(kāi)始有不同程度的膨大。14 d以后膨大組織周圍生長(zhǎng)出大量愈傷組織(表2)。誘導(dǎo)效果最佳的培養(yǎng)基編號(hào)是Ⅳ，產(chǎn)生的愈傷組織生長(zhǎng)旺盛，松軟，癭瘤愈傷多(圖1)。

表2 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)誘導(dǎo)率的影響Table 2 Influence of plant growth regulators on percentage of callus induced

圖1 非洲山毛豆愈傷組織Fig.1 The callus of Tephrosia vogelii

采用培養(yǎng)基0.70 mg/L 6-BA+1.00 mg/L 2，4-D誘導(dǎo)的非洲山毛豆幼莖愈傷組織，其生長(zhǎng)迅速，質(zhì)地松軟，色澤均勻，是各組合激素中生長(zhǎng)最好的愈傷組織(圖1)。幼莖培養(yǎng)4 d后開(kāi)始膨大，6 d后部分外植體開(kāi)始從刮傷處或端口長(zhǎng)出愈傷組織。培養(yǎng)20 d后，10種不同激素濃度處理的外植體出愈率、愈傷組織的生長(zhǎng)情況和顏色差異顯著。以6-BA 0.70 mg/L與1.00 mg/L 2，4-D激素組合處理的誘導(dǎo)率最高，達(dá)100%，所誘導(dǎo)的愈傷組織為乳白色，有光澤，質(zhì)地松軟，生長(zhǎng)速度快。6-BA 0.02 mg/L與1.00 mg/L 2，4-D組合時(shí)，愈傷組織的誘導(dǎo)率僅為65%，誘導(dǎo)出來(lái)的愈傷組織淡黃色，無(wú)光澤，愈傷組織質(zhì)地致密，生長(zhǎng)旺盛，而6-BA 1.00 mg/L與1.00 mg/L 2，4-D組合時(shí)誘導(dǎo)出來(lái)的愈傷組織白色，無(wú)光澤，水漬狀，生長(zhǎng)旺盛?？梢?jiàn)過(guò)高或過(guò)低的濃度激素均不利于愈傷組織的誘導(dǎo)和生長(zhǎng)。以不同濃度的NAA與1.00 mg/L 2，4-D組合誘導(dǎo)的幼莖效果不及6-BA，其中濃度為1.25 mg/L的誘導(dǎo)率最高僅25%且愈傷組織干滑，生長(zhǎng)緩慢，有褐化傾向。使用6-BA誘導(dǎo)幼莖，誘導(dǎo)率比較高，所誘導(dǎo)的愈傷組織生長(zhǎng)也比較好。結(jié)果顯示，不同的激素組合對(duì)非洲山毛豆愈傷組織誘導(dǎo)及生長(zhǎng)有不同的影響，其中以2，4-D1.00 mg/L+6-BA 0.70 mg/L的長(zhǎng)勢(shì)最好，與其他組合對(duì)非洲山毛豆幼莖的影響差異顯著，2，4-D與6-BA適當(dāng)?shù)慕M合較有利于愈傷組織的快速誘導(dǎo)可能與2，4-D/6-BA的比值有關(guān)，組合為1.00 mg/L 2，4-D+0.05 mg/L NAA(比值為20)時(shí)明顯不如組合為0.20、0.40、0.70與1.00 mg/L 2，4-D (比值為1∶1～1∶5)，較低的該比值(1∶1～1∶1.5)較為有利與產(chǎn)生愈傷組織。NAA對(duì)幼莖愈傷組織的快速誘導(dǎo)不太適合。較低水平的2，4-D或NAA對(duì)幼莖啟動(dòng)更有利，這可能與其本身的內(nèi)源生長(zhǎng)素水平有關(guān)?？傊?，2，4-D/NAA高于1∶2.5時(shí)(Ⅸ)，不利于非洲山毛豆愈傷組織的誘導(dǎo)。

2.2 線性關(guān)系試驗(yàn)

量取1000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液使用丙酮稀釋到100、50、25、12.5 μg/mL和6.25 μg/mL，進(jìn)樣量為5 μL，以標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積Y為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣濃度(μg/mL)X為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為: Y=12.832X－110.97(r=0.9998)。表明魚藤酮在6.25～100 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一標(biāo)準(zhǔn)溶液(25 μg/mL)5 μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定魚藤酮的峰面積值，RSD=0.71%，表明儀器精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

標(biāo)準(zhǔn)溶液(25 μg/mL)，在相同的色譜條件下，每隔2 h進(jìn)樣1次，共5次(n=5)，測(cè)定魚藤酮的峰面積值，RSD=0.91%，表明該樣品溶液在10 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4.1 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一供試樣品5份(n=5)，每份精確稱取1.00 g，按“1.3.1”項(xiàng)中的方法處理，殘?jiān)帽礈?，測(cè)定魚藤酮的峰面積值，結(jié)果魚藤酮峰面積值的RSD=1.37%，表明重現(xiàn)性良好。

2.4.2 加樣回收率試驗(yàn)

采用加樣回收法:精確稱取已知含量(4.165 μg/mL)的樣品，分別加入一定量的魚藤酮(5.000 μg/mL)對(duì)照品，按“1.3.1”項(xiàng)的色譜條件依法測(cè)定峰面積，計(jì)算回收率。結(jié)果平均回收率為101.19%，RSD=1.20%。

2.4.3 含量測(cè)定

精確稱取干愈傷組織粉碎品，按“1.3.1”所述方法制備樣品溶液，吸取5 μL樣品溶液，測(cè)定含量。結(jié)果表明:同一培養(yǎng)基培養(yǎng)的愈傷組織內(nèi)魚藤酮的含量隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。培養(yǎng)30 d的愈傷組織內(nèi)魚藤酮含量為0.0013%，60 d的含量提高了12倍，90 d后魚藤酮含量是30 d時(shí)的46倍(表3)。愈傷組織內(nèi)魚藤酮含量方差分析表明，分別培養(yǎng)30、60、90 d的愈傷組織內(nèi)魚藤酮含量在1%水平上差異極顯著(表4)。

表3 樣品中魚藤酮含量測(cè)定結(jié)果Table 3 The determination results of rotenone content in the sample

表4 愈傷組織內(nèi)魚藤酮含量方差分析表Table 4 Variance analys of the rotenone content in the callus

3 討論

對(duì)于藥用植物，利用愈傷組織培養(yǎng)提取藥用活性成分是獲得有效成分的一種行之有效的方法。郭志剛［7］等對(duì)鹽生肉蓯蓉愈傷組織培養(yǎng)方法與苯乙醇苷化合物合成進(jìn)行了研究，認(rèn)為愈傷組織中的主要成分與天然肉蓯蓉基本相同。于榮敏等［8］對(duì)銀杏愈傷組織培養(yǎng)和其代謝產(chǎn)物銀杏內(nèi)酯進(jìn)行了研究，篩選出了銀杏內(nèi)酯高產(chǎn)細(xì)胞系，銀杏內(nèi)酯量達(dá)萬(wàn)分之一，與天然植物的量相當(dāng)。植物細(xì)胞培養(yǎng)的研究表明，次生代謝物的積累與培養(yǎng)細(xì)胞的分化程度之間存在正相關(guān)，愈傷組織的培養(yǎng)具有初步分化或部分分化的結(jié)構(gòu)，可以積累較多的產(chǎn)物，但只有在細(xì)胞生長(zhǎng)的相對(duì)靜止期才能積累較多產(chǎn)物，如甜菜產(chǎn)生的新疆圓柏毒素(Podophyllotoxin)，在培養(yǎng)的滯后期物質(zhì)發(fā)生積累。這說(shuō)明，慢速生長(zhǎng)、分化或部分分化的組織或組織團(tuán)塊，才能積累較多的次生產(chǎn)物。在苦茄(Solanum dulcamara)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)中，直徑為5 mm或更大的青色細(xì)胞團(tuán)，其類固甾堿含量為小細(xì)胞團(tuán)的4倍;而三尖杉目(Cepalotaxus)的次生代謝物只在固體培養(yǎng)的愈傷組織中存在，一旦轉(zhuǎn)入液體進(jìn)行單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，目的次生代謝產(chǎn)物就消失或含量極低。利用組織和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生物合成途徑生產(chǎn)魚藤酮具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和意義，Kodama對(duì)毛魚藤的研究結(jié)果表明［9］，離體培養(yǎng)魚藤酮的含量為2.9 μg/g。曾鑫年對(duì)西非灰毛豆愈傷組織內(nèi)魚藤酮含量進(jìn)行了測(cè)定，其含量為1.8 μg/g。前人對(duì)植物愈傷組織培養(yǎng)及細(xì)胞懸浮培養(yǎng)提取植物次生代謝物質(zhì)的成功經(jīng)驗(yàn)，為非洲山毛豆細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生魚藤酮提供了參考。非洲山毛豆整株含有魚藤酮，其莖的生活力及硬度是誘導(dǎo)愈傷組織最合適的外植體，在適宜的培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)產(chǎn)生的大量愈傷組織可用于提取魚藤酮類化合物，同時(shí)也為非洲山毛豆的植株再生奠定了良好的基礎(chǔ)。

筆者利用高效液相色譜技術(shù)對(duì)非洲山毛豆幼莖誘導(dǎo)出的愈傷組織中的魚藤酮進(jìn)行了定性定量檢測(cè)。魚藤酮在愈傷組織中的含量與培養(yǎng)時(shí)間成相關(guān)性，但是含量不高，而植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生次生代謝物質(zhì)與植物外植體、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)技術(shù)、前體物、誘導(dǎo)劑抑制劑等因素有相關(guān)性［10］。說(shuō)明利用非洲山毛豆愈傷組織培養(yǎng)技術(shù)來(lái)提取生物農(nóng)藥魚藤酮有待于進(jìn)一步的研究。

1 Zhang YG(張業(yè)光)，Xu HH(徐漢虹)，Huang JG(黃繼光).The antifeeding activity of Tephrosia vogelii(Hook)A-gainst Species of Lepidoptera.J South China Agric Univ(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào))，2000，21(4):26.

2 Xu HH(徐漢虹)，Huang JG(黃繼光).Advances in research of rotenone.J Southwest Agric Univ(西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào))，2001，23:140.

3 Yeoman MM.Manipulating secondary metabolism in cultured plant cell.New Phytol，1996，134:553-563.

4 Zhang YL(張永樂(lè))，F(xiàn)u GQ(付桂芹).Secondary metabolic engineering of medicinal plants and herbal medicine production.Forest By-Product and Speciality in China(中國(guó)林副特產(chǎn))，2005，6(12):69-70.

5 Zeng XN(曾鑫年)，Coll J，Zhang SX(張善學(xué))，et al.Plants rotenoids improvement of HPLC.Chin J Anal Chem(分析化學(xué))，2002，30:1019.

6 Wu YK(武永昆)，Lin J(林軍)，Ye M(葉敏).Determination of rotenone by high performance liquid chromatography.Yunnan Chem Technol(云南化工)，2006，33(2):59-60.

7 Guo ZG(郭志剛)，Yu JM(于金梅)，Liu RZ(劉瑞芝)，et al.Studies on culture of cistanche salsa callus and synthesis of phenylethanoid glycosides.Chin Tradit Herb Drugs(中草藥)，2004，35:204-207.

8 Yu RM(于榮敏)，Zhao HL(趙鴻蓮)，Zheng YG(鄭玉果)，et al.Studies on the callus culture of ginkgo biloba and its metabolites ginkgolides.Chin J Biotechnol(生物工程學(xué)報(bào))，1999，15(2):52-58.

9 Kodama T，et al.Rotenoid biosynthesis by tissue culture of Derris elliptica.Agric Bio Chem，1980，44:2387-2390.

10 Ren ZH(任志華)，Li L(李玲).A review of strategy to enhance the production of secondary metabolites by plant cell culture.Subtrop Plant Sci(亞熱帶植物科學(xué))，2003，32 (3):64-67.

Callus Culture of Tephrosia vogelii and Content Detection of Rotenone

WU Yu-dong，F(xiàn)ENG Min-ying，LU Hui，XU Han-hong*
Key Laboratory of Natural Pesticide and Chemical Biology，Ministry of Education，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China

The effects of different concentrations of 2，4-D and different hormones in combination on the callus induction explored by cultivating explants of the young stem Tephrosia vogelii using MS medium.The contents of rotenone in different culture time of the callus cultivating by optimum combined medium were determined by HPLC.The callus induction obtained optimum effects by 1.00 mg/L 2，4-D and 0.70 mg/L 6-BA combinations of MS medium，and the rotenone contents of the callus after induced cultivation for 30 d，60 d，and 90 d were 0.0013%，0.016%，and 0.06%，respectively.The experimental results showed that the contents of rotenone in the callus of the young stem of Tephrosia vogelii increased gradually as the increase of culture time and showed significant differences.

Tephrosia vogelii;callus;hormone;rotenone;HPLC;biopesticide

1001-6880(2011)05-0889-05

2010-01-18 接受日期:2010-05-20

教育部產(chǎn)學(xué)研結(jié)合項(xiàng)目(2006D90204003);廣東省產(chǎn)學(xué)研結(jié)合項(xiàng)目(cgzh2d0504)

*通訊作者 Tel:86-20-85285127;E-mail:hhxu@scau.edu.cn

R284.2

A