程嬌影，卞美璐，馬 莉，陳 穎，劉 軍

衛(wèi)生部中日友好醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京 100029

·短篇論著·

實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)宮頸人乳頭瘤病毒在宮頸癌篩查中的應(yīng)用

程嬌影，卞美璐，馬 莉，陳 穎，劉 軍

衛(wèi)生部中日友好醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京 100029

人乳頭瘤病毒；宮頸腫瘤；聚合酶鏈反應(yīng)

人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染已被證明是宮頸癌的直接病因[1]，Woodman等[2]研究發(fā)現(xiàn)其歸因危險(xiǎn)性達(dá)到90%以上。有研究證明，高危型HPV檢測(cè)篩查宮頸病變的敏感性為90%～95%[3-9]，因此，宮頸HPV檢測(cè)已成為宮頸癌篩查及治療后隨訪(fǎng)的重要內(nèi)容。本研究評(píng)估了實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)方法用于篩查宮頸病變的臨床應(yīng)用價(jià)值，以期為今后的臨床應(yīng)用提供參考。

對(duì)象和方法

對(duì)象2008年7月至2010年2月在中日友好醫(yī)院婦科門(mén)診行宮頸液基細(xì)胞學(xué)檢查(liquid-based cytological test，LCT)的婦女10 452名，排除急性生殖道炎癥和曾接受過(guò)宮頸錐切及子宮切除手術(shù)者后，將自愿要求同時(shí)接受LCT檢查和實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)HPV篩查宮頸癌者(2286例)按照出生日期進(jìn)行排序，以5歲為1個(gè)年齡段進(jìn)行分層，計(jì)算各層人數(shù)分布比例，并按照相同比例在各層內(nèi)以隨機(jī)數(shù)字表方法隨機(jī)選取1500例入組，其中248例拒絕入組研究，實(shí)際納入研究對(duì)象為1252名，平均年齡為(38.15±11.0)歲。

LCT診斷標(biāo)準(zhǔn)采用2001年TBS分類(lèi)。

實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)檢測(cè)HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68。靈敏度為5000copies/ml。結(jié)果分析：基線(xiàn)和閾值設(shè)定原則是剛好超過(guò)陰性對(duì)照品擴(kuò)增曲線(xiàn)的最高點(diǎn)，且循環(huán)閾值(cycle threshold，CT)不出現(xiàn)任何數(shù)值。陰性對(duì)照CT值應(yīng)顯示為空白，同時(shí)陽(yáng)性對(duì)照CT值應(yīng)≤36。樣品CT值顯示空白判斷為陰性，CT值≤40判斷為陽(yáng)性。

組織病理學(xué)檢查對(duì)LCT提示≥不能明確意義的不典型鱗狀上皮細(xì)胞(atypical squamous cells - undetermined significance，ASC-US)和/或?qū)崟r(shí)熒光PCR結(jié)果高危型HPV陽(yáng)性者在陰道鏡下進(jìn)行活檢。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，以組織病理學(xué)檢查結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果、宮頸高度病變與年齡的關(guān)系1252名婦女的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，高危型HPV感染率在65歲之前的各年齡段無(wú)明顯變化，65歲后明顯升高。在45～54歲高危型HPV陽(yáng)性者中宮頸高度病變患者的比例明顯升高。以45和55歲為分界點(diǎn)統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示，<45歲組(213/768)、45～54歲組(102/326)和≥55歲(44/158)組的高危型HPV感染率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。比較不同組高危型HPV陽(yáng)性者中≥CINⅡ患者的比例差異，結(jié)果顯示<45歲組(94/213)和45～54歲組(67/102)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.82，P<0.05)，45～54歲組(67/102)與>55歲組(7/44)差異亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=30.47，P<0.05)，<45歲組(94/213)和≥55歲組(7/44) 差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.17，P<0.05)，即實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)高危型HPV陽(yáng)性者中，45～54歲婦女患宮頸高度病變比例最高，在≥55歲婦女中最低。

實(shí)時(shí)熒光PCR篩查宮頸高度病變及宮頸癌的臨床價(jià)值實(shí)時(shí)熒光PCR篩查宮頸高度病變和宮頸癌的敏感性為92.82%，特異性為82.17%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為46.80%，陰性預(yù)測(cè)值為98.54%(表1)。

討 論

實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)是從普通PCR發(fā)展出的新型核酸檢測(cè)技術(shù)，將基因擴(kuò)增的靈敏性、分子雜交的特異性及熒光化學(xué)反應(yīng)的精確性合為一體，因而具有DNA雜交的高特異性和光譜技術(shù)的高精確性；數(shù)據(jù)采集分析全部由儀器自動(dòng)完成，使檢測(cè)操作步驟更簡(jiǎn)單，結(jié)果觀(guān)測(cè)更方便；每批檢測(cè)時(shí)間短；單批次可檢測(cè)32～96份臨床樣本，更適合中小規(guī)模的臨床檢測(cè)；實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的花費(fèi)低；采用熒光PCR儀可克服傳統(tǒng)PCR需電泳分析和樣本間污染[10-13]等缺點(diǎn)。缺點(diǎn)是儀器操作較復(fù)雜，需專(zhuān)人操作；對(duì)于檢測(cè)結(jié)果接近閾值的需要觀(guān)察PCR曲線(xiàn)才能判斷結(jié)果。本研究中實(shí)時(shí)熒光PCR方法篩查高度宮頸病變和宮頸癌的敏感性達(dá)92.82%，陰性預(yù)測(cè)值達(dá)98.54%，用于宮頸癌篩查的臨床價(jià)值理想。在893名實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)高危型HPV結(jié)果為陰性者中，僅有13名患者經(jīng)過(guò)活檢證實(shí)為≥CINⅡ病變， 考慮原因可能為:(1)導(dǎo)致宮頸癌變的HPV型別不在本檢測(cè)方法可以檢測(cè)到的13種HPV之列；(2)宮頸細(xì)胞中的HPV含量低于試劑盒檢測(cè)閾值；(3)采集到的宮頸脫落細(xì)胞過(guò)少，HPV拷貝數(shù)過(guò)少?gòu)亩鴮?dǎo)致檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陰性；(4)標(biāo)本中含有較多的PCR抑制物，如血液中含有的可以嚴(yán)重抑制PCR的復(fù)合物、來(lái)自亞鐵血紅素族的卟啉和抗凝血?jiǎng)幟仕猁}及肝素等。因此，為了提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性，應(yīng)該在保證取材充分的同時(shí)盡量避免出血。

本研究中1252名婦女的高危型HPV檢測(cè)總體陽(yáng)性率為28.67%，明顯高于武明輝等[14]報(bào)道的北京地區(qū)感染率9.89%，推測(cè)其原因可能與選取的研究對(duì)象為門(mén)診就診婦女，即機(jī)會(huì)性篩查所致。本研究中，45～54歲年齡段婦女高危型HPV陽(yáng)性者中患宮頸高度病變的比例明顯升高，提示對(duì)此年齡段高危型HPV陽(yáng)性者需提高警惕，密切隨訪(fǎng)。

根據(jù)說(shuō)明書(shū)：CT值空白判斷為陰性，CT值≤40判斷為陽(yáng)性。而在檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)一些樣本的CT值顯示在40上下很小的范圍內(nèi)，對(duì)閾值的輕微調(diào)整就可能產(chǎn)生完全不同的結(jié)果。此時(shí)則需要對(duì)熒光擴(kuò)增曲線(xiàn)進(jìn)行分析。根據(jù)實(shí)時(shí)熒光PCR的原理，陽(yáng)性標(biāo)本反應(yīng)管中熒光團(tuán)的增長(zhǎng)應(yīng)為平滑的S型曲線(xiàn)，即反應(yīng)產(chǎn)物在經(jīng)過(guò)短時(shí)間緩慢增長(zhǎng)后迅速進(jìn)入呈對(duì)數(shù)曲線(xiàn)生長(zhǎng)的快速反應(yīng)期，繼而又出現(xiàn)緩慢增長(zhǎng)的平臺(tái)期。而一些CT值在40左右的標(biāo)本增長(zhǎng)曲線(xiàn)并未呈光滑的S型甚至出現(xiàn)上下抖動(dòng)，不符合標(biāo)準(zhǔn)的PCR增長(zhǎng)曲線(xiàn)，考慮原因可能是檢測(cè)樣本中含有拷貝數(shù)極低的HPV DNA，因此將此類(lèi)標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果定義為陰性時(shí)并不代表被檢測(cè)婦女完全除外13種高危型HPV感染。HC-Ⅱ檢測(cè)在對(duì)≥CINⅡ病變的敏感度與HPV病毒載量關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)：將閾值設(shè)定在4700個(gè)HPV拷貝數(shù)時(shí)最理想，即病毒含量在此水平下的婦女，8～10年內(nèi)發(fā)生≥CINⅡ可能性極低，與更低的閾值相比既沒(méi)有明顯降低檢測(cè)宮頸高度病變的敏感性，又避免了HPV病毒載量較低者的過(guò)度恐慌。與用于實(shí)驗(yàn)室研究的檢測(cè)希望將所有感染者全部篩查出來(lái)目的不同，用于篩查宮頸癌及其癌前病變臨床檢測(cè)的目的并非是把所有HPV感染者無(wú)論其病毒載量高低全部篩查出來(lái)，而是盡可能只將潛在的宮頸病變患者篩查出來(lái)。因此，檢測(cè)閾值并非設(shè)定的越低越好，而是要保證臨床檢測(cè)的應(yīng)用價(jià)值。本組34例CT值顯示在37.06～43.57范圍內(nèi)的樣本，將符合平滑S型曲線(xiàn)者判定為陽(yáng)性的9例中有2例為宮頸高度病變患者；將擴(kuò)增曲線(xiàn)上下抖動(dòng)，不符合平滑S型曲線(xiàn)者判定為陰性的25例無(wú)一例為宮頸高度病變患者。

表 1 LCT、實(shí)時(shí)熒光PCR的篩查宮頸高度病變及宮頸癌的價(jià)值

LCT：宮頸液基細(xì)胞學(xué)檢查；ASC-H：不除外高度病變的不典型鱗狀上皮細(xì)胞；ASC-US：不能明確意義的不典型鱗狀上皮細(xì)胞

綜上，本研究結(jié)果顯示，實(shí)時(shí)熒光PCR無(wú)論在篩查宮頸高度病變的靈敏度還是其檢測(cè)的陰性預(yù)測(cè)值都很理想，可用于宮頸癌篩查。因此建議增長(zhǎng)曲線(xiàn)呈現(xiàn)平滑的S型或許應(yīng)列為陽(yáng)性結(jié)果的判讀依據(jù)之一。由于45～54歲年齡段婦女高危型 HPV陽(yáng)性者中患宮頸高度病變的比例明顯升高，對(duì)此年齡段高危型HPV陽(yáng)性者需提高警惕，密切隨訪(fǎng)。

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卞美璐 電話(huà)：010-84206109, 傳真：010-64217749，電子郵件：cjy19781031@163.com

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2010-08-24)