陳 夢, 金靜華, 羅建紅

(浙江大學醫(yī)學院神經(jīng)科學研究所，衛(wèi)生部醫(yī)學神經(jīng)生物學重點實驗室， 浙江 杭州 310058)

伴侶蛋白Mortalin與神經(jīng)退行性疾病的研究進展*

陳 夢, 金靜華△, 羅建紅

(浙江大學醫(yī)學院神經(jīng)科學研究所，衛(wèi)生部醫(yī)學神經(jīng)生物學重點實驗室， 浙江 杭州 310058)

Mortalin； 線粒體伴侶蛋白； 神經(jīng)退行性疾病

1993年，Wadhwa等[1]在小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryonic fibroblasts, MEF)中首次克隆出了Mortalin(mtHSP70/HSP75/Grp75/TRAP-1/PBP74)，它是熱休克蛋白70(heat-shock protein 70, HSP70)家族成員之一。研究表明，Mortalin參與了多種生理功能的調控，包括細胞存活、細胞增殖、壓力應激、線粒體合成、細胞內轉運等，并且可能在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮作用。在此，本文就Mortalin的基本結構、生理功能以及與神經(jīng)系統(tǒng)疾病尤其是神經(jīng)退行性疾病的相關性作一個綜述。

1 Mortalin的基本結構

Mortalin最先在CD1-ICR小鼠的成纖維細胞中得到克隆，被認為是HSP70家族成員之一[1]。Mortalin在鼠科中有2種異構體，分別是mot-1和 mot-2，它們僅僅相差2個氨基酸卻發(fā)揮截然不同的作用[2]：在NIH 3T3細胞中過表達mot-1，引起細胞衰老；而mot-2則引起惡性轉化[3]。人來源的Mortalin只由一種cDNA編碼，它與小鼠mot-2蛋白相似，具有轉化活性，也被稱為hmot-2[3]。染色體定位分析表明，小鼠Mortalin定位于18號染色體，人Mortalin則定位于5q31.1[4]。

Mortalin由679個氨基酸組成，它的結構與其它HSP70家族成員相似，包括2個結構域：ATP酶結構域(ATPase domain)和C末端的蛋白結合結構域(protein-binding domain, PBD)。它的結構像是一把茶壺，見圖1。茶壺的把手為ATP酶結構域，包括4個亞結構域，折疊成一對葉狀結構，調控壺蓋的開啟。當ATP結合到ATP酶結構域后，使其發(fā)生構象改變，開啟壺蓋使底物能進入壺中的PBD并與之結合[5]。ATP酶結構域序列較為保守，而PBD序列有變異，因此形成底物特異性。在PBD附近有1個由5個螺旋狀的結構域(A-E)構成的C末端螺旋(Helix)，HSP70家族蛋白的A螺旋(Helix A)表現(xiàn)出高度保守性，而末端的螺旋(Helix B-E)序列出現(xiàn)分化，2種鼠來源Mortalin之間的2個氨基酸差異就存在于C末端的螺旋結構中[5]。

Figure 1. Kettle pot model structrue of Mortalin[5].Kettle pot model structure includes N-terminal ATP binding domain(pot handle),middle substrate-binding domain(SBD)(pot) and C-terminal(lid).Chaperone function of Mortalin is shown as entry of unfolded peptides,chaperoning and release of folded peptides.

2 Mortalin的生理功能

與HSP70家族其它成員不同，Mortalin不能被熱誘導，但對葡萄糖缺乏、氧化損傷、低水平輻射和細胞毒性有反應[1,6]。Mortalin主要定位于線粒體，但也可分布在內質網(wǎng)、質膜、囊泡、胞質等部位[6]。

由于Mortalin主要分布于線粒體，所以又被稱為線粒體熱休克蛋白70(mtHSP70)，目前認為它的生理功能主要與協(xié)助核編碼的線粒體蛋白進入線粒體相關。Mortalin能與線粒體內膜(the inner membrane, TIM)上的蛋白結合，促進蛋白轉入線粒體基質，隨后，又通過與HSP60的相互作用，幫助蛋白重折疊，使其發(fā)揮特定功能[5]。線粒體伴侶蛋白功能的損傷，會影響線粒體組成蛋白的轉運、儲存及其完整性的維持。

Mortalin的另一定位場所是內質網(wǎng)，用酵母雙雜交的方法，發(fā)現(xiàn)線粒體外膜(The outer mitochondrial membrane, OMM)上的電壓依賴性陰離子通道(voltage-dependent anion channel 1, VDAC1)能通過Mortalin與內質網(wǎng)上的IP3受體發(fā)生相互作用[7]。這種通道間的相互作用，能夠影響其功能：IP3受體的配體結合結構域(ligand binding domain)在內質網(wǎng)表面或線粒體表面的重組表達，會引起Ca2+在線粒體的積累。但是下調Mortalin的表達，可以消除這種累積，提示Mortalin在IP3受體和線粒體Ca2+聚集之間起到調控作用，而鈣穩(wěn)態(tài)又能影響細胞功能和細胞死亡信號[8]。此外，Mortalin也能與內質網(wǎng)伴侶蛋白Grp94發(fā)生相互作用[7,8]。

Mortalin已被報道的另一個主要功能與抗壓、抗凋亡及延緩細胞衰老相關。P66Shc是一個參與氧化應激引起的細胞凋亡的關鍵分子。Orsini等[9]的研究發(fā)現(xiàn)， Mortalin能與P66Shc在線粒體形成復合物，在此狀態(tài)下，Mortalin能抑制P66Shc的毒性，當紫外輻射引起氧化應激時，P66Shc就會從復合物中游離出來，引起線粒體損傷，導致細胞凋亡。在葡萄糖剝奪的PC12細胞中，過表達Mortalin可以抑制氧化應激[10]。有研究報道，Mortalin能抑制氧化應激引起的細胞色素C的釋放[11]，提示Mortalin可能通過穩(wěn)定細胞色素C來抑制活性氧(reactive oxygen species, ROS)產物的積累。上調Mortalin水平，可以抑制不同損傷引起的凋亡[5]，包括亞砷酸鹽處理的肺上皮細胞、汞處理的腎細胞、葡萄糖剝奪及缺血再灌注的中國倉鼠肺成纖維細胞等。在線蟲中過表達HSP70F，即線蟲的同源Mortalin，它們的壽命跨度可延長40%[6]。

3 Mortalin與神經(jīng)退行性疾病

3.1Mortalin與阿爾茨海默病 Mortalin可能在阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)中發(fā)揮作用的證據(jù)，主要集中在它與apoE、Aβ蛋白、淀粉樣前體蛋白(the amyloid precursor protein, APP)等幾個AD發(fā)病中關鍵分子的聯(lián)系上。

Mortalin與apoE的相關性主要來源于對APOE模型小鼠的蛋白組學分析。apoE是一個已被發(fā)現(xiàn)的與進行性AD相關的基因多態(tài)性疾病風險因子，它主要有3個亞型：apoE2、apoE 3、apoE 4。雖然apoE4可能是AD進程中的風險因子[12]，但有研究指出apoE可通過其半胱氨酸殘基發(fā)揮神經(jīng)保護作用(抗氧化作用)[13]。檢測野生型(wild type, WT)和APOE敲除(knockout, KO)的小鼠腦區(qū)的氧化蛋白發(fā)現(xiàn)，幼年KO小鼠海馬總蛋白的氧化程度與老年WT以及老年KO小鼠相近，比幼年WT約高2倍[14]。通過二維電泳(two-dimensional electrophoresis, 2-DE)和蛋白羰基免疫染色發(fā)現(xiàn)了6種特異的氧化敏感蛋白，這些蛋白的氧化水平在幼年KO, 老年WT, 老年KO小鼠中比幼年WT中高[14]。這些蛋白經(jīng)質譜鑒定，發(fā)現(xiàn)Mortalin為其中之一[14]。這個研究表明Mortalin在apoE蛋白缺失或老齡化模型中有氧化修飾，但這種損傷對Mortalin的生物學功能有何影響還不清楚。另一個研究小組用人APOE定點替換的方法(targeted replacement, TR)構建純合子的APOE3(3/3)和APOE4(4/4)小鼠模型[15]。研究表明[15]，與APOE3 TR小鼠(對照)相比， Mortalin的4種異構體(a、b、c、d)在APOE4 TR小鼠的海馬中有差異表達及差異磷酸化。Mortalin異構體c在APOE4 TR小鼠海馬中的表達至少比APOE3 TR小鼠的高14倍，而異構體b表現(xiàn)出較高的磷酸化程度。用蛋白免疫印跡分析Mortalin的差異表達，結果顯示總蛋白的表達并沒有改變。而用雙向差異凝膠電泳(2D-DIGE)分析人腦樣本，Mortalin異構體d在AD病人的海馬中增高，而其在APOE3 AD病人海馬中又比APOE4的AD病人高。Mortalin異構體在人海馬中有不同表達，而且這些異構體受到翻譯后的修飾，可能的2種主要修飾方式是磷酸化[15]和氧化[14]。ApoE與Mortalin的聯(lián)系在AD中發(fā)揮怎樣的作用還不清楚，可能是APOE4基因型引起Mortalin氧化水平的增高并伴有磷酸化程度的改變，這種翻譯后修飾影響了Mortalin蛋白結合及轉運的功能，進而引起線粒體功能損傷[15]。Mortalin通過APOE基因型調控，可能起到細胞保護作用，但是它在AD中的作用還需要進一步的研究[15]。

有研究表明，Mortalin的功能還受到AD發(fā)病機制中另一關鍵分子Aβ蛋白的影響[16]。在PC12細胞模型中，亞致死劑量的Aβ蛋白能抑制核編碼蛋白轉運進入線粒體，同樣，內源性的核編碼線粒體蛋白Mortalin和Tom20的轉運也降低。Mortalin轉運水平的降低可能是由Tom20的減少所引起。Aβ的毒性影響Mortalin在線粒體中的轉運，但Mortalin在這個過程中扮演的角色、發(fā)揮的作用以及在AD中的病理意義仍待研究。

此外，有研究報道在過表達APP的細胞中，APP通過介導轉錄水平的改變，使Mortalin基因水平上調[17]。

3.2Mortalin與帕金森病 Mortalin與帕金森病(Parkinson’s disease, PD)的聯(lián)系，最早是在分析PD病人腦黑質與對照蛋白表達差異中篩選得到的。我們前期通過定量蛋白組學的方法發(fā)現(xiàn)Mortalin在PD病人的線粒體富集組分中顯著下降，但在整個腦黑質勻漿中卻沒有明顯改變[18]。另一研究小組將大鼠腦組織提取的蛋白暴露于多巴胺醌，該物質是一種多巴胺的氧化代謝產物，與多巴胺氧化引起的細胞毒性有關，然后再用雙向差異凝膠電泳分析線粒體蛋白組學的差異，發(fā)現(xiàn)有一些蛋白發(fā)生丟失，其中就包括了Mortalin[19]。

我們前期在多巴胺細胞系MES中進一步的研究也提示了Mortalin在PD發(fā)病中可能發(fā)揮的作用[18]。研究結果發(fā)現(xiàn)，在MES中過表達Mortalin后，用線粒體復合物Ⅰ抑制劑魚藤酮誘導的細胞毒性增強，同時線粒體復合物Ⅰ活性下降，碳?；牡鞍自黾?，也即氧化應激增加，蛋白酶體20S亞基的活性下降。相反的，用RNA干擾技術(RNAi)抑制Mortalin的表達后，魚藤酮誘導的細胞毒性反而降低。這些結果似乎提示Mortalin在PD病人中線粒體富集組分的降低是一種保護機制，我們猜測這種僅發(fā)生在線粒體組分的表達降低而整體水平?jīng)]有變化的現(xiàn)象可能與Mortalin的細胞轉位(Translocation)有關，即在各種因素導致了線粒體功能受損后，Mortalin從線粒體轉位到細胞漿中，導致細胞漿中Mortalin濃度上升，而細胞漿中Mortalin濃度增高對細胞是有害的而不是保護作用。我們用一些實驗驗證了以上的猜測。我們用魚藤酮作用于MES細胞后分離線粒體組分和胞漿組分，結果發(fā)現(xiàn)魚藤酮處理后Mortalin在線粒體中明顯下降而在細胞漿中顯著增多，總量并沒有明顯變化。同時用免疫細胞化學的方法檢測魚藤酮處理后MES細胞發(fā)現(xiàn)，與對照相比，Mortalin與線粒體的共定位明顯減少。

另一方面，我們用親和層析結合定量蛋白質組學的方法發(fā)現(xiàn)在α-synuclein與DJ-1這2個與PD相關的因子的蛋白復合物中同時檢測到了Mortalin，但卻沒有得到α-synuclein與DJ-1直接相互作用的證據(jù)，提示Mortalin可能是α-synuclein與DJ-1的共同相互作用蛋白[20]。此外， Li等[21]用免疫共沉淀的方法也也驗證了Mortalin與DJ-1的相互作用。他們發(fā)現(xiàn)，DJ-1以及其突變體L166P和M261與Mortalin之間有相互作用，而H2O2處理能增加野生型DJ-1與Mortalin之間的相互作用，促進野生型DJ-1進入線粒體，但這種現(xiàn)象沒有在突變體中觀察到。

Mortalin的另一個名稱是TRAP1(TNF receptor-associated protein 1，TRAP1)[22], 它被報道是PINK1激酶的底物。PINK1是已發(fā)現(xiàn)的與家族性PD有關的基因之一。在體內和體外系統(tǒng)中，PINK1與TRAP1結合及共定位，并引起TRAP1的磷酸化。PINK1可以通過抑制細胞色素C的釋放減少氧化應激引起的細胞死亡，而這種保護作用依賴于使TRAP1發(fā)生磷酸化的PINK1激酶活性。與PD相關的PINK1突變體G309D、L347P、W437X損傷了PINK1促進TRAP1磷酸化及細胞生存的能力。這個發(fā)現(xiàn)提示了一條新的通路，即PINK1通過磷酸化TRAP1，阻止了氧化應激引起的細胞凋亡[11]。

3.3Mortalin與其它神經(jīng)系統(tǒng)疾病 Mortalin可能還在其它神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮作用，包括缺血性腦損傷、癲癇、弗里德賴希共濟失調(Friedreich’s ataxia，F(xiàn)RDA)等。對腦缺血損傷的研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠腦中過表達Mortalin，可降低梗死面積，這與它能夠改善線粒體功能相關，它能保護線粒體復合體Ⅳ的活性，顯著減少自由基的產生，降低脂質過氧化反應，增加ATP水平的穩(wěn)定性[22，23]。跨膜蛋白Stargazer(STG)突變小鼠是一個癲癇失神性小發(fā)作的小鼠模型, 用蛋白組學方法分析對照小鼠和STG小鼠丘腦蛋白，鑒定出12個差異表達蛋白，其中Mortalin在STG小鼠中表達增高[24]。 Mortalin的增高表明氧化應激可能參與STG小鼠的病理過程，它的增高可能是對抗壓力的一種保護機制[24]。FRDA是一種引起神經(jīng)系統(tǒng)退行性損傷的遺傳疾病，由Frataxin蛋白突變引起。有研究用免疫共沉淀的方法證明了Frataxin與Mortalin具有相互作用[25]。

4 結語

目前，有越來越多的研究證實許多神經(jīng)退行性疾病與線粒體功能的損傷相關，而Mortlain又是主要定位于線粒體的伴侶蛋白，那么Mortalin是否通過影響線粒體功能，參與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生和發(fā)展？這其中的機制又是如何？而我們前期的研究也表明Mortalin能與帕金森疾病中的一些關鍵分子如α-synuclein、DJ-1等發(fā)生相互作用，那Mortalin又如何通過這些相互作用影響到線粒體功能進而在神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病中發(fā)揮作用的呢？這些都有待進一步的研究。

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Mortalin,amitochondrialchaperone,inneurodegenerativedisorder

CHEN Meng, JIN Jing-hua, LUO Jian-hong

(DepartmentofNeurobiology,InstituteforNeuroscience,KeyLaboratryofMedicalNeurobiologyofMinistryofHealth,ZhejiangUniversitySchoolofMedicine,Hangzhou310058,China.E-mail:jhjin@zju.edu.cn)

Mortalin(mtHSP70/HSP75/Grp75/TRAP-1/PBP74) is an essential mitochondrial chaperone and is believed to regulate multiple cellular functions ranging from cell survival, cell proliferation, stress response, mitochondrial biogenesis and intracellular trafficking. Recent studies have shown that mortalin is relevant to the pathogenesis of Alzheimer’s disease(AD) and Parkinson’s disease(PD). Proteomic studies demonstrate the differential expression of mortalin not only in the models of AD or PD but also in PD human brains as compared to the controls. Mortalin seems to modulates the development of diseases through association with the critical molecules such as apoE, amyloid β-protein, amyloid precursor protein(APP) in AD, and α-synuclein, DJ-1, PINK1 in PD. Mortalin may regulate PD development via the pathways involving mitochondrial and proteasomal functions as well as oxidative stress. Furthermore, it is reported that mortalin participates in the pathological processes of several other neurological disorders, such as ischemic brain injury, absence seizure and Friedreich’s ataxia(FRDA).

Mortalin; Mitochondrial chaperone; Neurodegenerative diseases

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.02-039

1000-4718(2011)02-0407-05

2010-05-11

2010-08-13

國家自然科學基金資助項目(No.30770760)；浙江省自然科學基金資助項目(No.Y207168)； 中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金資助項(No.2010KYJD018)

△通訊作者 Tel：0571-88208247; E-mail: jhjin@zju.edu.cn