孔 霞， 顧帝水， 陳 錦， 黃培春

(廣東醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室, 廣東 東莞 523808)

口蝦蛄提取物對人鼻咽癌細(xì)胞P53、COX-2和VEGF表達(dá)的影響*

孔 霞， 顧帝水， 陳 錦， 黃培春△

(廣東醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室, 廣東 東莞 523808)

目的研究口蝦蛄提取物(EOS)對人低分化鼻咽癌細(xì)胞系(CNE-2Z)中P53、環(huán)氧化酶2(COX-2)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)的影響及意義。方法不同濃度EOS(0 mg/L、125 mg/L、250 mg/L和500 mg/L)作用CNE-2Z細(xì)胞24 h后，Western blotting檢測P53蛋白表達(dá)，免疫細(xì)胞化學(xué)法及RT-PCR法分別檢測COX-2 、VEGF蛋白和mRNA的表達(dá)。結(jié)果CNE-2Z細(xì)胞中P53蛋白、COX-2和VEGF蛋白和mRNA表達(dá)均隨EOS作用濃度增高而逐漸降低，呈量效關(guān)系(P<0.01)；且COX-2 和VEGF表達(dá)量呈正相關(guān)(P<0.05)，COX-2 和P53表達(dá)量亦呈正相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論EOS可能通過抑制CNE-2Z細(xì)胞中P53蛋白的表達(dá),干擾COX-2和VEGF的表達(dá)而發(fā)揮其抗腫瘤作用的。

口蝦蛄； 鼻咽癌； 蛋白質(zhì)P53； 環(huán)氧化酶2； 血管內(nèi)皮生長因子

口蝦蛄提取物(extract ofOratosquilla, EOS)是本課題組從海洋生物口蝦蛄中提取和分離的抗鼻咽癌活性成分[1-3]，其主要化學(xué)成分可能是生物堿類[3]。但其具體抗癌機(jī)制還不清楚，需要進(jìn)一步深入研究。本研究旨在進(jìn)一步探討EOS對人低分化鼻咽癌細(xì)胞系(CNE-2Z)中P53、環(huán)氧化酶2(cyclooxygenase-2，COX-2) 和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表達(dá)的影響，以揭示EOS抗癌的可能機(jī)制。

材 料 和 方 法

1材料

EOS及CNE-2Z均由廣東醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所提供；RT-PCR試劑盒(Qiagen)；RNA提取試劑盒(Trizol，Invitrogen)；PCR引物(由上海生工合成)；鼠抗人P53、COX-2和VEGF單克隆抗體為Santa Cruz。

2方法

2.1CNE-2Z細(xì)胞培養(yǎng) 采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

2.2EOS的提取、配制及實驗分組 采用系統(tǒng)溶劑法提取分離獲得口蝦蛄乙酸乙酯提取物即EOS，具體方法參見文獻(xiàn)[1]。EOS不溶于水，以二甲基亞砜(DMSO)溶解配制成1 kg/L，分裝于4 ℃保存。臨用前將EOS稀釋成所需的濃度。實驗分4組：實驗前將溶解后的EOS加入各組細(xì)胞培養(yǎng)液中，使其終濃度分別為EOS 0 mg/L(對照組)、EOS 125 mg/L(低濃度組)、EOS 250 mg/L(中濃度組)、EOS 500 mg/L(高濃度組)，并使各組DMSO終濃度≤0.1%。

2.3免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測COX-2和VEGF蛋白表達(dá) 將CNE-2Z細(xì)胞制成1×108cells/L 的細(xì)胞懸液，接種于預(yù)先置有無菌蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的EOS，并使各組培養(yǎng)液DMSO濃度均為0.1%，同時設(shè)陰性對照組；EOS作用24 h后棄上清，用PBS洗3遍，再用冰丙酮固定15 min，自然干燥后采用SP法檢測。

COX-2和VEGF皆為胞質(zhì)著色。胞漿或胞膜出現(xiàn)棕色或棕褐色顆粒判斷為陽性細(xì)胞，并采用LEICA-Q500IW圖像分析儀定量檢測陽性細(xì)胞平均吸光度A值代表其表達(dá)量。

2.4RT-PCR法檢測COX-2 mRNA和VEGF mRNA表達(dá) 加入EOS后各組CNE-2Z細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，用Trizol等試劑提取細(xì)胞總RNA。紫外分光光度計測定RNA的含量和純度，取A260/A280>1.8的樣品用于RT-PCR實驗。應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件和Web Primer 3軟件進(jìn)行引物設(shè)計。GADPH上游引物序列 5’-ACGGATTTGGTCGTATTGGG-3’，下游引物序列 5’-TCATTTTGGAGGGATCTCGC -3’，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為231 bp；COX-2上游引物序列 5’-TTCAAATGAGATTGTGGGAAAAT-3’，下游引物序列 5’-AGATCATCTCTGCCTGAGTATCTT-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為305 bp；VEGF上游引物序列 5’-CGAAACCATGAACTTTCTGCTGTC-3’，下游引物序列 5’-TCACCGCCTCGGCTTGTCACAT-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為452 bp和583 bp。對應(yīng)為VEGF121和VEGF165。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃ 1 min，50 ℃ (COX-2) 或 52 ℃ (VEGF)1 min，72 ℃ 1 min，共 30 (COX-2) 或 32(VEGF) 個循環(huán)；最后 72 ℃延伸5 min。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL用 20 g/L瓊脂糖凝膠 (內(nèi)含嗅化乙啶) 電泳。紫外燈下觀察并用Grab2It成像系統(tǒng)照相，然后用 Gelworks 1D interdiate軟件分析各條帶的積分吸光度(IA)，以IA(COX-2 或 VEGF)/IA(GADPH) 比值表示目的基因的相對表達(dá)量。

2.5Western blotting檢測P53的表達(dá) 細(xì)胞處理同RT-PCR，取 1×106個細(xì)胞以細(xì)胞裂解液裂解，沸水變性3-5 min，超聲波粉碎30 s，13 000 r/min 4 ℃離心10 min，取上清，考馬斯亮藍(lán)G-250標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定蛋白濃度。取等量蛋白樣品進(jìn)行10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕法電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜，膜與鼠抗人P53單克隆抗體4 ℃孵育過夜，再與羊抗鼠IgG 37 ℃孵育2 h，ECL檢測，β-actin作為內(nèi)參照。圖像經(jīng)Scion Image軟件進(jìn)行吸光度值分析，并與內(nèi)參照β-actin比較，以相對吸光度值代表蛋白表達(dá)量。

3統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果

COX-2和VEGF蛋白在CNE-2Z 細(xì)胞中呈陽性表達(dá)，陽性細(xì)胞為細(xì)胞漿著棕褐色，染色強(qiáng)度與其表達(dá)量有相關(guān)性。經(jīng)不同濃度的EOS處理后的CNE-2Z 細(xì)胞中COX-2和VEGF蛋白的陽性表達(dá)率隨EOS的增高而降低,見圖1，呈量效關(guān)系(P<0.01)。

Figure 1. Effects of EOS on the expression of COX-2 and VEGF in CNE-2Z cells(×200).

2RT-PCR法結(jié)果

如圖2所示，CNE-2Z細(xì)胞COX-2 mRNA和VEGF mRNA表達(dá)擴(kuò)增條帶隨EOS作用濃度的增加而漸減弱(n=3,P<0.01)，且COX-2 mRNA與VEGF mRNA相對表達(dá)量的變化趨勢存在正相關(guān)(r=0.9720,P<0.05)。

Figure 2. Effects of EOS on the expression of COX-2 mRNA and VEGF mRNA in CNE-2Z cells.s. n=3.M: DNA marker；Lane 1: control group；Lane 2: EOS 125 mg/L group；Lane 3:EOS 250 mg/L group；Lane 4：EOS 500 mg/L group. **P<0.01 vs control group; ▲▲P<0.01 vs other groups.

3P53蛋白表達(dá)情況

如圖3所示，EOS作用于CNE-2Z細(xì)胞24 h后，隨著EOS濃度的增加， P53蛋白的表達(dá)逐漸下降(n=3,P<0.05)，且P53表達(dá)量與COX-2表達(dá)量的變化趨勢呈正相關(guān)(r=0.9607,P<0.05)。

Figure 3. Effects of EOS on the expression of P53 in CNE-2Z cells.s. n=3. Lane 1: control group；Lane 2:EOS 125 mg/L group；Lane 3:EOS 250 mg/L group；Lane 4:EOS 500 mg/L group. **P<0.01 vs control group; ▲▲P<0.01 vs other groups.

討 論

從海洋生物中篩選抗腫瘤活性物質(zhì)是目前抗癌藥物研究的熱點之一。然而，利用海洋生物抗鼻咽癌的研究國內(nèi)外報道極少。近年來，本研究室利用系統(tǒng)溶劑法從海洋生物口蝦蛄中提取了抗鼻咽癌活性成分，發(fā)現(xiàn)其主要的化學(xué)成分可能是生物堿類，并申請了中國發(fā)明專利(專利號為ZL99102633.0)[3]。前期研究發(fā)現(xiàn)，口蝦蛄提取物能抑制鼻咽癌低分化細(xì)胞系CNE-2Z細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長，并能降低 CNE-2Z細(xì)胞體外侵襲能力[2]。這證明口蝦蛄提取物確實具有抗鼻咽癌的作用。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)口蝦蛄提取物不僅能夠抑制鼻咽癌低分化和高分化細(xì)胞系CNE-2Z和CNE1的增殖，而且還能促進(jìn)癌細(xì)胞的分化，并對其中的相關(guān)機(jī)制進(jìn)行了初步的研究。但其具體抑癌機(jī)制還不清楚，需要進(jìn)一步深入研究。據(jù)此，本研究選擇了P53、COX-2和VEGF作為研究對象探討EOS抗腫瘤的可能機(jī)制。

COX-2是催化花生四烯酸產(chǎn)生多種PGE2的限速酶，它在正常組織中一般不表達(dá)，但在包括鼻咽癌在內(nèi)的多種腫瘤組織中表達(dá)增加[4-6]。研究資料表明[7，8]，COX-2與腫瘤細(xì)胞的增殖與凋亡紊亂、腫瘤新生血管的生成以及細(xì)胞間的黏附、侵襲等多個環(huán)節(jié)有關(guān)。COX-2抑制劑能抑制腫瘤細(xì)胞的生長[9]，誘導(dǎo)其凋亡，并能對抗腫瘤血管的生成，抑制腫瘤的侵襲性[10]。因此COX-2可作為鼻咽癌防治研究中的新靶點。本研究采用免疫細(xì)胞化學(xué)法和RT-PCR法分別檢測了EOS對CNE-2Z細(xì)胞中COX-2在蛋白和基因水平的影響，結(jié)果表明隨著EOS作用濃度的增加， COX-2在蛋白和基因水平的表達(dá)逐漸減弱，說明EOS的抗腫瘤作用可能與抑制COX-2的表達(dá)有關(guān)。

有研究表明COX-2的抗凋亡能力與P53有關(guān)。p53基因是研究最為廣泛深入的抑癌基因之一，它是細(xì)胞生長周期中負(fù)調(diào)控因子，與細(xì)胞周期的調(diào)控、DNA修復(fù)、細(xì)胞分化和細(xì)胞凋亡等重要生物學(xué)功能有關(guān)。p53基因分為野生型和突變型2種，野生型p53基因在某些致癌因素的作用下可發(fā)生突變，成為突變型p53基因，突變型p53基因在細(xì)胞內(nèi)積聚，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。由于野生型P53蛋白在體內(nèi)的半衰期極短，不易測出。鼻咽癌組織中p53基因突變率低，但是在細(xì)胞株和移植瘤中p53基因突變率增高[11，12]。因此，我們所檢測到的為突變型p53。目前研究表明，野生型p53競爭性地結(jié)合COX-2上游啟動子序列的TATA盒而抑制其表達(dá)。當(dāng)野生型p53發(fā)生突變后，失去了對COX-2表達(dá)的抑制而促使COX-2表達(dá)上調(diào)[13]。COX-2的過表達(dá)導(dǎo)致Bcl-2/Bax比率增大，改變了Bcl-2與Bax之間的平衡從而抑制凋亡。本實驗中Weatern blotting法實驗結(jié)果顯示CNE-2Z細(xì)胞中有較高的突變型P53蛋白的表達(dá)，且隨著EOS濃度的增加突變型P53蛋白的表達(dá)逐漸降低，并且這種變化趨勢和COX-2的變化有顯著相關(guān)性(P<0.05)。實驗結(jié)果提示了EOS也可能通過下調(diào)突變型P53蛋白的表達(dá)而干擾了COX-2的表達(dá)，從而抑制了CNE-2Z細(xì)胞的生長。

COX-2促進(jìn)腫瘤形成還與其促進(jìn)了腫瘤新生血管的生成有關(guān)。研究表明COX-2及其產(chǎn)物PGE2還可以促進(jìn)腫瘤VEGF的表達(dá)而導(dǎo)致血管生成[14]，并且這種作用可被COX-2抑制劑所抑制[15]。本研究采用免疫細(xì)胞化學(xué)法和RT-PCR法分別檢測了EOS對CNE-2Z細(xì)胞中VEGF在蛋白和基因水平的影響，結(jié)果表明EOS作用濃度的增加，VEGF在蛋白和基因水平的表達(dá)逐漸減弱，并且這種變化趨勢和COX-2的變化有顯著相關(guān)性(P<0.05)。說明EOS的抗腫瘤作用可能與下調(diào)COX-2的表達(dá)從而抑制了VEGF的表達(dá)有關(guān)。

以上實驗結(jié)果提示EOS可能通過下調(diào)CNE-2Z細(xì)胞中突變型P53蛋白的表達(dá)而干擾了COX-2和VEGF的表達(dá)來發(fā)揮抗腫瘤作用的，這為EOS的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了新的思路。

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EffectsofextractofOratosquillaonexpressionofP53,COX-2andVEGFinhumannasopharyngealcarcinomacellline

KONG Xia, GU Di-shui, CHEN Jin, HUANG Pei-chun

(DepartmentofPathophysiology,GuangdongMedicalCollege,Dongguan523808,China.E-mail: 13828283890@139.com)

AIM: To study the inhibitory effect of the extract ofOratosquilla(EOS) on the expression of P53, cyclooxygenase-2(COX-2) and vascular endothelial growth factor(VEGF) in nasopharyngeal carcinoma cell line CNE-2Z.METHODSCNE-2Z cells were treated with different concentrations of EOS for 24 h. The methods of RT-PCR and immunocytochemistry were used to detect the expression of COX-2 and VEGF at mRNA and protein levels, respectively. The protein expression of P53 was determined by Western blotting.RESULTSAfter treated with EOS, the protein expression of P53 in CNE-2Z cells was decreased(P<0.01), and the expression of COX-2 and VEGF at mRNA and protein levels was also significantly decreased in a dose-dependent manner(P<0.01). The expression of COX-2 was positively correlated with that of VEGF(P<0.05), and a positive correlation between the expression of COX-2 and P53 protein(P<0.05) was also observed.CONCLUSIONEOS may play its antitumor effect by inhibiting the expression of P53, COX-2 and VEGF in nasopharyngeal carcinoma cell line CNE-2Z.

Oratosquillaoratoria; Nasopharyngeal neoplasms; Protein P53; Cyclooxygenase 2; Vascular endothelial growth factors

R739.6

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.02-035

1000-4718(2011)02-0390-04

2010-07-08

2010-10-12

湛江市科技攻關(guān)資助項目(No.2009C3101011)；廣東醫(yī)學(xué)院青年基金資助項目(No.XQ0502)

△通訊作者 Tel：0759-22896311; E-mail: 13828283890@139.com