劉友平， 李 娟， 代榮陽， 段春燕， 陳紹坤， 嚴(yán)冬梅， 陳川寧， 李 洪△

(瀘州醫(yī)學(xué)院 1 生物化學(xué)教研室,2人類疾病細(xì)胞信號與調(diào)控四川省高校重點實驗室，3 醫(yī)學(xué)生物學(xué)與遺傳學(xué)教研室, 四川 瀘州 646000)

·短篇論著·

miR-26a mimics轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞株HepG2的表達(dá)蛋白質(zhì)組分析*

劉友平1， 李 娟2， 代榮陽1， 段春燕1， 陳紹坤3， 嚴(yán)冬梅1， 陳川寧1， 李 洪1△

(瀘州醫(yī)學(xué)院1生物化學(xué)教研室,2人類疾病細(xì)胞信號與調(diào)控四川省高校重點實驗室，3醫(yī)學(xué)生物學(xué)與遺傳學(xué)教研室, 四川 瀘州 646000)

目的通過分析microRNA-26a(miR-26a)mimics轉(zhuǎn)染對人肝癌細(xì)胞株HepG2 表達(dá)蛋白質(zhì)組的影響，以確定miR-26a與肝癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性。方法常規(guī)培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞株HepG2，經(jīng)miR-26a mimics轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行細(xì)胞周期分析，并裂解轉(zhuǎn)染72 h的HepG2細(xì)胞提取蛋白，雙向電泳分離，匹配對比各蛋白斑點的表達(dá)量，篩選主要差異表達(dá)蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。結(jié)果HepG2細(xì)胞經(jīng)miR-26a mimics轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖受到抑制；其蛋白2-DE圖譜與對照組比較，差異表達(dá)超過2倍的蛋白斑點有11個。其中，有3個蛋白斑點為表達(dá)上調(diào)，有8個蛋白斑點為表達(dá)下調(diào)。質(zhì)譜鑒定為：膜聯(lián)蛋白A1、過氧化物酶4、增殖細(xì)胞核抗原、載脂蛋白A1、細(xì)胞色素C 氧化酶5a、細(xì)胞周期蛋白E2、磷酸核糖焦磷酸激酶3、周期素依賴性蛋白激酶1和磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白。結(jié)論miR-26a可能通過影響上述蛋白分子的表達(dá)，直接或間接地調(diào)控HepG2肝癌細(xì)胞的增殖、分化和死亡，以發(fā)揮其抗癌作用。

miR-26a mimics； 微小RNA； HepG2細(xì)胞； 蛋白質(zhì)組

微小RNA(mircoRNAs，miRNAs)是一類長度為21-23 核苷酸，進(jìn)化上比較保守的非編碼單鏈小RNA 分子，可識別特異的mRNA，影響靶mRNA 的穩(wěn)定性或抑制其翻譯，進(jìn)而調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、發(fā)育、死亡和代謝等生理過程[1，2]。目前預(yù)測人類基因組中約有1 000個miRNA，它們可能對約30%的人類基因轉(zhuǎn)錄本起調(diào)控作用。超過50%的miRNAs基因位于癌癥相關(guān)基因組區(qū)域或脆性位點上[3]。新近研究表明miRNAs異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，不同類型的腫瘤具有特異的miRNAs異常表達(dá)譜[4,5]，它們與腫瘤的發(fā)生、病理分級、臨床分期、耐藥性及預(yù)后等密切相關(guān)。

miR-26a在多種組織中廣泛表達(dá)，但對于其生物學(xué)功能還知之甚少[6]。目前多項研究證實，miR-26a在多種惡性腫瘤中表達(dá)失調(diào)[7，8]，并可能參與了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程。已有研究指出，miR-26a在正常肝臟中呈高豐度表達(dá)，但在肝細(xì)胞性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)中表達(dá)卻顯著下調(diào)[9]，其分子機制不詳。本實驗以人肝癌細(xì)胞株HepG2為研究對象，采用比較蛋白組學(xué)的研究技術(shù)并結(jié)合質(zhì)譜(MS)鑒定技術(shù)，篩選和鑒定經(jīng)miR-26a mimics轉(zhuǎn)染后肝癌細(xì)胞株HepG2的差異表達(dá)蛋白質(zhì)，以便為進(jìn)一步研究miR-26a參與肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機制提供線索。

材 料 和 方 法

1材料

1.1實驗對象 人肝癌細(xì)胞株HepG2，購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。

1.2主要試劑和儀器 miR-26a mimics及對照的mimic購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，miR-26a mimics序列為 5’-UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU-3’，陰性對照的mimic序列為 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’；DMEM培養(yǎng)基購自Sigma;丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷、超純尿素、二硫蘇糖醇、CHAPS、甘氨酸、TEMED、TBP、過硫酸銨、十二烷基磺酸鈉、固相pH梯度干膠條(pH 3-10，17cm)和礦物油購自Bio-Rad；蛋白分子量marker和苯甲基磺酰氟(PMSF)購自碧云天生物技術(shù)研究所；其它常規(guī)試劑均購自GE Healthcare。低溫臺式離心機(TDZ4-WS)購自長沙湘儀離心機儀器有限公司；雙向電泳系統(tǒng)、ChemiDoc XRS蛋白凝膠成像系統(tǒng)購自Bio-Rad；EPICS流式細(xì)胞儀。

2方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞周期分析 HepG2肝癌細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)至細(xì)胞對數(shù)生長期，隨機將細(xì)胞分為對照組和實驗組2組。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將miR-26a mimics和對照mimics分別轉(zhuǎn)染實驗組和對照組HepG2細(xì)胞24 h后，細(xì)胞置于無血清DMEM培養(yǎng)基中饑餓12 h，饑餓后換用DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。12 h后離心收集細(xì)胞，棄上清，用預(yù)冷PBS洗細(xì)胞2次，加入預(yù)冷70%乙醇，于4 ℃固定過夜。離心收集細(xì)胞，PBS洗細(xì)胞1次，加入PBS溴化乙啶染色液(含50 mg/L PI, 100 mg/L RNase A, 0.2% Triton X-100)37 ℃避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測。

2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染及細(xì)胞蛋白提取與定量 HepG2肝癌細(xì)胞培養(yǎng)條件同上，至細(xì)胞對數(shù)生長期，隨機將細(xì)胞分為對照組和實驗組2組。轉(zhuǎn)染試劑為Lipofectamine 2000，具體方法如下：以合適的密度將HepG2接種到6孔培養(yǎng)板上，12 h后細(xì)胞達(dá)到80%-90%的融合后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用無血清培養(yǎng)基245 μL分別稀釋Lipofectamine 2000(5 μL)和miR-26a mimics(5 μL)或?qū)φ誱imics(5 μL)。溫育5 min后，混合稀釋好的Lipofectamine 2000和mimics，指彈法混勻，溫育25 min后分別加入細(xì)胞培養(yǎng)液。細(xì)胞在37 ℃、5%CO2中孵育6 h后更換正常培養(yǎng)基，HepG2細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)66 h。對照組和實驗組HepG2細(xì)胞用0.25%的胰酶消化并離心。PBS液重懸細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至EP管內(nèi)(每組各收集1管)，10 000 ×g離心5 min。各EP管加細(xì)胞裂解液(8 mol/L 尿素，4% CHAPS，5 mL/L Bio-lyte 3/10，1‰TBP)300 μL，冰浴30 min(其間間斷振蕩2-3次)后13 000 ×g離心30 min。上清液采用Brandford法測定蛋白濃度。重復(fù)細(xì)胞轉(zhuǎn)染過程并分批收集細(xì)胞3批。

2.3蛋白質(zhì)組雙向電泳分離 各組蛋白樣品150 mg，加水化液(8 mol/L 尿素，4% CHAPS，DTT 10 g/L，Bio-lyte 3/10 5 mL/L，0.1%溴酚藍(lán) 痕量)至總量350 μL/膠條，混勻后加入水化槽，放上pH 3/10的IPG膠條，1 h后加入礦物油覆蓋膠條過夜。將水化后的膠條轉(zhuǎn)移至等電聚焦(IEF)電泳系統(tǒng)(Bio-Rad)，于17 ℃進(jìn)行聚焦，程序設(shè)置為250V，2 h → 500 V，1 h → 1 000 V，1 h → 5 000 V，2 h →10 000 V，總伏時數(shù)6萬伏時結(jié)束IEF電泳。平衡2次后用10%SDS聚丙烯酰胺凝膠按照Bio-Rad公司說明書進(jìn)行第二向電泳分離。最后采用銀染法進(jìn)行染色獲得2-DE圖譜。每批細(xì)胞蛋白重復(fù)雙向電泳3次。

2.4凝膠成像及雙向電泳圖譜分析 將染色后的凝膠置ChemiDoc XRS凝膠成像系統(tǒng)中照相成像。采用ImageMaster 2D Platinum 5.0(Amersham) 雙向電泳圖譜分析軟件進(jìn)行斑點自動識別、半定量檢測及配對分析。獲得各蛋白斑點的實驗等電點(isoelectric point,pI)和分子量(molecular weight,MW)，篩選每批比較標(biāo)準(zhǔn)化總灰度值(%Vol)均相差2倍及以上的蛋白斑點，采用基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF-MS)進(jìn)行質(zhì)譜檢測。質(zhì)譜檢測和蛋白斑點的匹配鑒定由北京華大中生科技發(fā)展有限公司完成。

3統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析在Excel及SPSS 11.0軟件上進(jìn)行。

結(jié) 果

1miR-26amimics轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的生長狀態(tài)

實驗組和對照組HepG2肝癌細(xì)胞在未處理之前生長狀態(tài)相當(dāng)，且均處于對數(shù)生長期。細(xì)胞分別經(jīng)miR-26a mimics和對照mimics處理48 h后，用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞周期情況，可見HepG2經(jīng)miR-26a mimics處理后細(xì)胞增殖明顯受到抑制(P<0.05,n=5),見圖1。

Figure 1. Phases of the cell cycle of HepG2 cells treated with or without miR-26a mimics for 48 h. Cell population of each phase was measured using flow cytometry.±s.n=3.*P<0.05 vs control value.

2雙向電泳及蛋白斑點匹配分析

HepG2肝癌細(xì)胞表達(dá)蛋白質(zhì)組經(jīng)雙向電泳分離和銀染后獲得的2-DE圖譜見圖2。各蛋白斑點分離較好，大多數(shù)分布在pI 4-8，分子量20-85 kD的范圍內(nèi)。經(jīng)ImageMaster 2D Platinum 5.0軟件分析，對照組共有可穩(wěn)定重復(fù)的蛋白斑點(1 345±65)個，實驗組共有可穩(wěn)定重復(fù)的蛋白斑點(1 220±48)個，對照組與實驗組自動匹配配對(883±31)對，匹配率約72%。

圖2和圖3中箭頭所示為每批3次雙向電泳結(jié)果均出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化總灰度值(%Vol)相差達(dá)2倍以上的蛋白斑點。圖3A、C、D為對照mimics轉(zhuǎn)染HepG2 72 h后的雙向電泳結(jié)果，圖3 B、D、F為miR-26a mimics 轉(zhuǎn)染HepG2 72 h后的雙向電泳結(jié)果。從圖3和表1可見：蛋白點1、2和4的表達(dá)明顯上調(diào)，而蛋白點3、5、6、7、8、9、10和11的表達(dá)則明顯下調(diào)。

Figure 2. The two-dimensional electrophoresis patterns of HepG2 cells with control mimics treatment(A) and HepG2 cells with miR-26a mimics treatment(B). The proteins over/under-expressed by more than 2 folds between the two groups were shown by the arrows.

Figure 3. The enlarged images of the 11 identified protein spots with differential expression levels between control group and miR-26a mimics treatment group(A，C and E were control group; B，D and F were miR-26a mimics treatment group; arrows showing the corresponding spots or location ).Spot 1,2 and 4 were obviously over-expressed while spot 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10 and 11 were under-expressed in miR-26a mimics treatment group compared with control group.

3蛋白斑點的質(zhì)譜鑒定

采用MALDI-TOF-MS分別對圖3中11個差異表達(dá)的蛋白斑點進(jìn)行肽指紋圖譜分析。使用NCBInr蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫在Mascot搜索引擎(http:∥www. matrixscience.com)上進(jìn)行數(shù)據(jù)解析，搜索物種(species search)為人，將所搜索到的結(jié)果， 結(jié)合雙向凝膠電泳相應(yīng)點的表現(xiàn)：等電點、分子量及質(zhì)譜匹配肽段的多少( 3個片段以上)和覆蓋率(>13%) 以及蛋白檢索得分進(jìn)行綜合分析，共鑒定出9種蛋白。其中，斑點9和10為同一種蛋白，斑點6未獲鑒定結(jié)果，具體相關(guān)信息見表1。

討 論

國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，肝癌中存在miRNAs的異常表達(dá)，因而推測miRNAs參與了肝細(xì)胞癌變的病理過程[4]。根據(jù)差異表達(dá)的miRNAs來區(qū)分肝癌組織與正常組織的精確度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于差異表達(dá)的編碼基因。由此可見，把關(guān)鍵miRNA作為肝癌生物診治的靶分子可能會比把編碼基因作為靶分子更加有效[10,11]。

表1 差異表達(dá)蛋白斑點的質(zhì)譜鑒定結(jié)果

本實驗通過雙向電泳和質(zhì)譜技術(shù)對HepG2肝癌細(xì)胞中miR-26a mimics轉(zhuǎn)染后表達(dá)蛋白組的變化進(jìn)行了分析，對標(biāo)準(zhǔn)化總灰度值相差達(dá)2倍以上的差異表達(dá)蛋白斑點進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，發(fā)現(xiàn)這些蛋白質(zhì)為：膜聯(lián)蛋白A1、過氧化物酶4、增殖細(xì)胞核抗原、載脂蛋白A1、細(xì)胞色素C氧化酶5a、磷酸核糖焦磷酸激酶3、周期素依賴蛋白激酶1、磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白和周期素E2。其中，膜聯(lián)蛋白A1、過氧化物酶4和載脂蛋白A1(蛋白斑點1、2、4)的表達(dá)明顯上調(diào)，而增殖細(xì)胞核抗原、細(xì)胞色素C氧化酶5a、磷酸核糖焦磷酸激酶3、周期素依賴蛋白激酶1、磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白和周期素E2(蛋白斑點3、5、7、8、9、10、11)的表達(dá)則明顯下調(diào),見圖3。

膜聯(lián)蛋白A1是鈣和磷脂結(jié)合蛋白，在很多方面發(fā)揮重要生物學(xué)功能，參與細(xì)胞增殖和死亡信號的調(diào)節(jié)、凋亡細(xì)胞的吞噬以及腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，具有抗細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用。已有研究表明，膜聯(lián)蛋白A1的抗增殖作用是通過激活MAPK/ERK信號途徑實現(xiàn)的。若通過基因轉(zhuǎn)染，使膜聯(lián)蛋白A1過度表達(dá)，可以減弱細(xì)胞的生長和克隆形成能力，并且增加細(xì)胞凋亡[12]。本實驗發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞HepG2經(jīng)miR-26a mimics轉(zhuǎn)染后表達(dá)量出現(xiàn)明顯上調(diào)，見圖3 C、D?？梢?，膜聯(lián)蛋白A1可能參與了miR-26a抵抗肝癌細(xì)胞HepG2的增殖和誘導(dǎo)HepG2發(fā)生凋亡的作用。

周期素是調(diào)控細(xì)胞周期和變構(gòu)激活周期素依賴性蛋白激酶(CDKs)所必需的調(diào)節(jié)亞基[13]。以周期素為核心的G1/S期細(xì)胞周期網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控系統(tǒng)，是腫瘤發(fā)生和發(fā)展中最常改變的共同通路。目前已發(fā)現(xiàn)在哺乳動物細(xì)胞中有大約20種周期素和10種CDKs。其中周期素E2的表達(dá)水平在非轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中幾乎難以檢測到，而在腫瘤源性細(xì)胞中周期素 E2 mRNA的表達(dá)則明顯高于正常對照[14]。本實驗中，肝癌細(xì)胞HepG2經(jīng)miR-26a mimics轉(zhuǎn)染后周期素 E2的表達(dá)出現(xiàn)明顯下調(diào)，見圖3 E、F，此結(jié)果不僅與相關(guān)的文獻(xiàn)報道相符，而且進(jìn)一步證實了miR-26a的高表達(dá)可能通過下調(diào)周期素D2 和周期素E2的水平來抑制肝癌細(xì)胞的細(xì)胞周期，從而發(fā)揮其抑癌作用[9]。

增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)是DNA復(fù)制所必需的一種聚合酶的附屬蛋白，對細(xì)胞由G1期向S期過渡起調(diào)節(jié)作用，其含量的變化與細(xì)胞增殖的進(jìn)程同步，可作為衡量細(xì)胞增殖狀態(tài)的客觀指標(biāo)之一[15]。一般認(rèn)為，腫瘤分化程度越低，其增殖能力越強，PCNA表達(dá)也越高。本實驗發(fā)現(xiàn)，肝癌細(xì)胞HepG2經(jīng)miR-26a mimics轉(zhuǎn)染后PCNA的表達(dá)量出現(xiàn)明顯下調(diào)，見圖3 A、B，說明miR-26a可通過調(diào)控PCNA的表達(dá)而參與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和周期調(diào)控。除此之外，經(jīng)miR-26a mimics轉(zhuǎn)染后CDK1和磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白的表達(dá)量也出現(xiàn)明顯下調(diào)，見圖3 C、D，相關(guān)報道證實它們也與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)[16，17]。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞增殖和凋亡的失調(diào)密切相關(guān)。本實驗通過表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞HepG2經(jīng)miR-26a mimics轉(zhuǎn)染后出現(xiàn)顯著差異表達(dá)的蛋白質(zhì)參與了細(xì)胞的增殖、分化、凋亡調(diào)節(jié)及細(xì)胞代謝等生理活動，見表1。表達(dá)上調(diào)的蛋白，如膜聯(lián)蛋白A1主要起促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。而表達(dá)下調(diào)的蛋白，如PCNA、cyclin E2、CDK1和PEBP1主要參與細(xì)胞周期的調(diào)控。因此，miR-26a可能通過調(diào)控這些蛋白的表達(dá)，參與肝癌細(xì)胞周期的調(diào)控以抑制肝癌細(xì)胞的增殖，從而達(dá)到抑制肝癌的發(fā)生發(fā)展，這與結(jié)果圖-1較吻合。通過對這些差異表達(dá)蛋白質(zhì)分子機制的深入研究，將為闡明miR-26a的抗癌作用提供進(jìn)一步的線索和依據(jù)。

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AnalysisofexpressiveproteomeinhumanhepatocarcinomacellHepG2transfectedwithmiR-26amimics

LIU You-ping1, LI Juan2, DAI Rong-yang1, DUAN Chun-yan1, CHEN Shao-kun3, YAN Dong-mei1, CHEN Chuan-ning1, LI Hong1

(1DepartmentofBiochemistry,2KeyLaboratoryofSichuanCollegesandUniversitiesforCellSignalandRegulationinHumanDiseases,3DepartmentofMedicalBiologyandGenetics,LuzhouMedicalCollege,Luzhou646000,China.E-mail:lihong7188@163.com)

AIM: To determine whether microRNA-26a(miR-26a) is involved in development of liver cancer by analysis of proteomic expression profile of human hepatocarcinoma cell HepG2 transfected with miR-26a mimics.METHODSHepG2 cells were cultured by a routine method and transfected with miR-26a mimics for 48 h for cell cycle analysis. The expressive proteome profiles of HepG2 cells with or without miR-26a mimics treatment were established by the methods of two-dimensional electrophoresis separation following lysis of the cells and extraction of the proteins. The proteomic expression profiles were analyzed by comparative proteomics technique to discover the important protein spots with differential expression. The identification of the proteins was conducted by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry(MALDI-TOF-MS).RESULTSmiR-26a brought down the proliferation of HepG2 cells. Total 11 protein spots with alteration of expressive amounts more than 2 times were successfully identified in the proteomic expression profile of HepG2 cells treated with miR-26a mimics, including annexin A1, peroxiredoxin 4, proliferating cell nuclear antigen, apolipoprotein A1, cytochrome C oxidase subunit 5A, cyclin E2, ribose-phosphate pyrophosphokinase 3, cyclin-dependent kinase 1 and phosphatidylethanolamine-binding protein 1. Among these, the expression of 3 protein spots was up-regulated and 8 of them was down-regulated.CONCLUSIONmiR-26a contributes to the anti-cancer effect by expressive regulation of the proteins mentioned above, or directly or indirectly controls the proliferation, differentiation and death of hepatocarcinoma cells.

miR-26a mimics; microRNA; HepG2 cells; Proteome

Q291

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.02-029

1000-4718(2011)02-0367-05

2010-08-02

2010-10-23

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81000886)；四川省教育廳科技基金資助項目(No.09ZA050)；四川省衛(wèi)生廳科技基金資助項目(No.2007-431)

△通訊作者 Tel:0830-3160283； E-mail: lihong7188@163.com