張增方， 呂芳麗， 陳 瑩， 楊曉燕， 黃綺凌， 李東健， 黃世光△

(1 暨南大學醫(yī)學院口腔醫(yī)學系, 廣東 廣州 510632；2 中山大學中山醫(yī)學院寄生蟲學教研室， 中山大學熱帶病防治研究教育部重點實驗室， 廣東 廣州 510080；3 廣州市婦女兒童醫(yī)療中心口腔科， 廣東 廣州 510120；4 廣州市荔灣區(qū)口腔醫(yī)院, 廣東 廣州 510170)

心理應激對大鼠實驗性牙周炎及牙周組織中低氧誘導因子1α表達的影響*

張增方1,3， 呂芳麗2， 陳 瑩2， 楊曉燕2， 黃綺凌1， 李東健4， 黃世光1△

(1暨南大學醫(yī)學院口腔醫(yī)學系, 廣東 廣州 510632；2中山大學中山醫(yī)學院寄生蟲學教研室， 中山大學熱帶病防治研究教育部重點實驗室， 廣東 廣州 510080；3廣州市婦女兒童醫(yī)療中心口腔科， 廣東 廣州 510120；4廣州市荔灣區(qū)口腔醫(yī)院, 廣東 廣州 510170)

目的探討心理應激對牙周炎及其氧代謝的影響。方法建立大鼠實驗性牙周炎模型并予以應激刺激，SPF級4 周齡雄性Wistar大鼠48只，隨機分為4組：(1)正常對照組；(2)實驗性牙周炎組：用浸有牙周致病菌的絲線結扎左側上頜第二磨牙牙頸部復制牙周炎模型；(3)單純應激組：牙周不作特殊處理，給予應激刺激；(4)牙周炎+應激組：按上法復制牙周炎模型，并予以應激刺激。各組動物分別于實驗后第1、4、6、8 周末分批處死，各時點每組處死的動物數(shù)為3只。大鼠處死前測量牙周附著喪失, 制作牙體牙周聯(lián)合切片觀察牙周的組織學改變；采用免疫組化法檢測各實驗組大鼠牙周組織低氧誘導因子 1α(HIF-1α)的表達水平，通過計算HIF-1α平均陽性細胞率來評估組織的缺氧程度。結果(1)與正常對照組比較，單純應激組牙周附著喪失程度在各時點均無顯著差異(P>0.05)；(2)牙周炎+應激組牙周附著喪失程度在4、6和8周時明顯高于牙周炎組(P<0.01)；(3)與正常對照組比較，單純應激組HIF-1α平均陽性細胞率在各時點均無顯著差異(P>0.05)；(4)牙周炎+應激組HIF-1α平均陽性細胞率在4、6和8周時顯著高于牙周炎組(P<0.01)。結論應激刺激可能通過降低牙周組織氧代謝水平加重大鼠牙周炎癥程度。

牙周炎； 動物模型； 心理應激； 低氧誘導因子1α

心理應激與牙周健康狀況密切相關，可能是牙周炎的重要危險因素之一[1,2]。 目前關于心理應激影響牙周炎機制的研究多集中在免疫及內分泌等方面，其確切機制至今仍未闡明。有關心理應激影響牙周組織氧代謝的機制，國內外的研究較少涉及。氧代謝對牙周組織生理機能的維持起著非常重要的作用，牙周組織氧代謝變化對牙周炎癥發(fā)展可能起重要影響。低氧誘導因子 1α(hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α)是細胞低氧適應與應答調節(jié)的關鍵因子[3,4]，HIF-1α在缺氧誘導下表達增強，通過檢測HIF-1α蛋白在組織局部的表達情況可判斷組織的氧代謝情況。本文利用大鼠實驗性牙周炎的模型，觀察心理應激對牙周炎及牙周組織中HIF-1α表達的影響，以了解應激對牙周炎及其氧代謝的影響情況。

材 料 和 方 法

1材料

SPF級Wistar大鼠購自中山大學醫(yī)學院實驗動物中心；大鼠HIF-1α的Ⅰ抗及Ⅱ抗免疫組織化學試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

2方法

2.1實驗動物分組 SPF級4周齡雄性Wistar大鼠48只，體重約170-200 g，經適應性飼養(yǎng)1周后實驗。大鼠按隨機數(shù)字表法分成4組，每組12只：(1) 正常對照組(control group)：動物正常喂養(yǎng)，牙周不作特殊處理；(2)實驗性牙周炎組(experimental periodontitis group)：用浸有牙周致病菌的3-0絲線結扎左側上頜第二磨牙牙頸部復制牙周炎模型；(3)單純應激組(stress group)：牙周不作特殊處理，給予應激刺激；(4)牙周炎+應激組(periodontitis with stress group)：按上法復制牙周炎模型，并予以應激刺激。各組動物分別于實驗后第1、4、6、8 周末分批處死，各時點每組處死動物數(shù)為3只。

2.2牙周致病菌絲線的制備 收集臨床確診為慢性牙周炎患者的牙周病變區(qū)域齦下菌斑，置于盛有1.0 mL硫乙醇酸鹽溶液的小瓶中，充分混勻，以生理鹽水進行10倍系列稀釋，選擇稀釋度為10-3的濃度接種于CDC厭氧血瓊脂平板上，將3-0無菌絲線置于該瓊脂平板上，在厭養(yǎng)菌培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)5 d。

2.3牙周炎動物模型的建立 采用0.3%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉大鼠，大鼠按每10 g體重注射麻藥0.1 mL。待動物麻醉失去知覺后，使之仰臥位，固定四肢及頭部，1%碘酊消毒口腔及口周，用70%乙醇脫碘，并以棉線牽拉固定上、下頜，使之呈大張口狀，絲線穿舌全層拉向一側。用尖探針分離左側上頜第2磨牙牙齦組織，用浸有牙周致病菌的3-0絲線纏繞牙頸部1圈，結扎絲線置于齦溝內，于近中頰處打結。實驗后1周內每天檢查結扎絲線，若結扎絲線出現(xiàn)松脫則及時重新結扎。

2.4應激方案 采取3種應激方案：(1)限制性應激：將大鼠置于空間局限的小鐵籠中，限制其活動及飲食5 h；(2)冷水浸泡應激：將大鼠置于空間局限的小鐵籠中，并用冷水浸至大鼠鎖骨以上位置，浸泡2 h；(3)貓驚嚇應激：選擇發(fā)情期雌貓，叫聲刺耳，躁急，好動；將鼠籠置入貓籠中12 h，期間大鼠處于恐懼應激狀態(tài)。實驗開始后，每天隨機選擇此3種應激方案中的1種加于應激組大鼠。

2.5觀察指標及檢測方法 (1)牙周附著喪失的測量：采用0.3%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉大鼠，待其進入麻醉狀態(tài)后，取仰臥位，固定頭部及四肢，選用自制牙周探針探測牙周附著喪失數(shù)值，牙周探針的刻度單位與工作端直徑均為0.2 mm。牙周附著喪失為釉牙骨質界到牙周袋底的距離，測量部位為實驗牙頰、腭側近中、中央、遠中共6個點，取平均值。(2)大體標本及組織學觀察：采用頸椎脫臼法處死大鼠，取上頜骨標本于10%中性甲醛液中固定48 h以上，修整標本，僅保留磨牙區(qū)段牙齒及牙周組織。采用混合脫鈣液脫鈣，制成頰舌向5 μm厚度的牙體牙周組織聯(lián)合切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察牙周組織的組織學改變。(3) HIF-1α免疫組織化學SABC法染色及結果處理：Ⅰ抗HIF-1α稀釋濃度為1∶50，DAB顯色液顯色。陰性對照采用PBS緩沖液代替Ⅰ抗，蘇木素輕度復染。免疫組化陽性信號為棕黃色細小顆粒，定位于細胞核或細胞漿。對每個標本切片中陽性細胞進行記數(shù)。每個切片記數(shù)5個200倍視野下總細胞數(shù)及陽性細胞數(shù)，計算陽性細胞率(%)，即陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)的比例，取其平均值，為該標本切片的平均陽性細胞率。

3統(tǒng)計學處理

結 果

1牙周附著喪失(attachmentloss，AL)

各實驗組和正常對照組大鼠牙周AL見表1。(1)牙周炎組和牙周炎+應激組AL在各個時點明顯高于正常對照組和單純應激組(P<0.01)；(2)單純應激組AL在各時點與正常對照組比較均無顯著差異(P>0.05)；(3)牙周炎+應激組AL在4、6和8周時明顯高于牙周炎組(P<0.01)。

表1 各實驗組和對照組大鼠牙周附著喪失的變化

2大體標本及組織學改變

正常對照組及單純應激組牙齦完整，牙周附著位置正常,見圖1A、C。實驗性牙周炎組第4 周時可見輕度牙齦萎縮，探及淺牙周袋，尚無明顯附著喪失；第6周時出現(xiàn)牙齦萎縮，附著喪失明顯，見圖1B；第8周時牙齦萎縮，附著喪失明顯加重。牙周炎+應激組第4 周時大體標本出現(xiàn)輕度牙齦萎縮，探及牙周袋，有附著喪失；第6周時牙齦萎縮，附著喪失嚴重，見圖1D；第8周時牙齦萎縮，附著喪失明顯加重，根分叉暴露，累及兩側鄰牙。

Figure 1. Samples 6 weeks after ligature.A: normal control group; B: experimental periodontitis group，moderate periodontal pocket was shown; C: stress group, normal sign of periodontium was shown; D: periodontitis with stress group, severe periodontal pocket was shown.

3HIF-1α免疫組化染色結果

HIF-1α免疫組化陽性信號為棕黃色細小顆粒，位于細胞核或細胞漿內。正常對照組牙周組織未見陽性細胞，見圖2A；牙周炎組，牙周組織見較多的HIF-1α陽性細胞，見圖2B；單純應激組，牙周結締組織中見少量弱陽性細胞，上皮細胞未見陽性細胞，見圖2C；牙周炎+應激組牙周組織見大量HIF-1α陽性細胞，見圖2D，且牙周炎+應激組HIF-1α陽性表達明顯多于牙周炎組。

各實驗組平均陽性細胞率見表2，結果表明：(1)正常對照組平均陽性細胞率在各時點與單純應激組比較均無顯著差異(P>0.05)；(2)牙周炎組和牙周炎+應激組平均陽性細胞率在各個時點明顯高于正常對照組和單純應激組(P<0.01)；(3)與牙周炎組比較，除了在1周時牙周炎+應激組平均陽性細胞率與牙周炎組間無明顯差異(P>0.05)，其余各個時點牙周炎+應激組平均陽性細胞率明顯高于牙周炎組(P<0.01)；(5)牙周炎組和牙周炎+應激組在6和8周時平均陽性細胞率明顯高于1和4周(P<0.01)。

討 論

1心理應激是牙周炎的重要危險因子

牙周炎發(fā)病機制復雜，牙周微生物是牙周病必需的始動因素，但單純的細菌因素不足以解釋疾病的復雜性和嚴重性。研究表明宿主反應在牙周病發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。心理應激是機體對精神壓力或刺激的心理和生理的反應。研究顯示心理應激和急性壞死潰瘍性牙齦炎有關。大量的人群調查顯示牙周炎與心理應激有明顯的相關性[5]。近期的研究認為心理應激與牙周健康狀況密切相關，是牙周炎的重要危險因子之一[6，7]。

表2 各實驗組和對照組HIF-1α表達的平均陽性細胞率

心理應激影響牙周病的機制至今仍未闡明，多數(shù)學者認為各種社會、心理因素以應激為中介，通過神經-內分泌-免疫系統(tǒng)之間的相互作用、相互影響，導致免疫功能低下和內分泌失衡，誘發(fā)疾病，如心理應激可增加糖皮質激素的釋放，抑制炎癥及免疫反應，從而降低宿主防御系統(tǒng)的功能。

在本實驗中，我們對大鼠采用限制性應激刺激、冷水浸泡應激刺激和貓驚嚇應激刺激3種應激刺激方案，每天隨機選擇其中1種方案對實驗動物進行刺激，以模擬現(xiàn)實社會中應激源的多樣性、不確定性，防止了實驗動物對應激源的適應。在我們的動物實驗中觀察到牙周炎+應激組牙周附著喪失明顯高于牙周炎組，組織學也觀察到牙周炎+應激組牙周組織的炎癥程度較牙周炎組更嚴重。我們的實驗結果表明單純的應激刺激對大鼠正常牙周組織沒有明顯影響，但心理應激可以加重牙周炎模型的炎癥程度。Takada等[8]的實驗結果表明限制性應激可加重大鼠牙周炎模型的炎癥進程。Peruzzo等[9]的研究結果表明慢性心理應激通過使局部前炎癥因子和前骨吸收因子的增加，明顯加重了結扎誘導牙周炎的骨吸收。李博等[10]的研究結果顯示應激可加重牙周組織炎癥的破壞程度，是牙周炎的重要危險因素。

2心理應激可能通過降低牙周組織氧代謝加重牙周炎

心理應激是牙周炎的重要危險因子之一，有關心理應激影響牙周組織氧代謝的機制國內外的研究較少涉及。氧對于細胞代謝活動及生存是必需的，在缺氧狀態(tài)下，細胞許多基因的轉錄、表達發(fā)生變化，對缺氧作出應激反應，導致代謝紊亂、功能失調和出現(xiàn)各種各樣的病理生理變化。組織的氧代謝情況可以通過檢測HIF-1α蛋白表達情況來反映。HIF-1是由α、β 2個亞基組成的堿性螺旋環(huán)螺旋超家族成員，其中HIF-1β能較容易地在所有細胞中發(fā)現(xiàn)，而HIF-1α在正常氧態(tài)下不易檢測到，是細胞低氧適應與應答調節(jié)的關鍵因子，低氧可通過抑制酶對HIF-1α的快速泛素化和降解來提高HIF-1α蛋白的水平。炎癥組織局部的缺氧環(huán)境可誘導HIF-1α蛋白含量迅速上升，使其表達增強。通過檢測HIF-1α蛋白在組織局部的表達情況可反映組織的氧代謝情況。

在我們的實驗中，通過檢測各實驗組在各時點牙周組織內HIF-1α蛋白陽性表達情況來判斷組織內的氧代謝情況，并通過計算HIF-1α平均陽性細胞率來評估組織的缺氧程度。結果表明牙周組織在炎癥狀態(tài)下，氧代謝降低，單純的應激刺激本身不會明顯影響正常牙周組織氧代謝，但應激刺激可以明顯降低已經存在炎癥的牙周組織的氧代謝，使牙周組織低氧狀況加重，從而加重牙周炎。Manhold等[11]的研究結果也表明長期或持續(xù)的情緒化狀態(tài)，可以刺激植物神經系統(tǒng)，使牙周組織毛細血管長時間處于收縮狀態(tài)，影響牙齦微循環(huán)，導致氧和營養(yǎng)物質的供應量減少；他們還發(fā)現(xiàn)應激狀態(tài)下的大鼠牙周組織利用氧的能力也會降低。

另外，作為檢測組織是否缺氧的指標，HIF-1α不僅與缺氧有關，其本身也是重要的炎癥因子，低氧狀態(tài)下HIF-1α釋放增多也可能對炎癥產生作用。Cramer等[12]證實在髓樣細胞HIF-1基因缺陷的炎癥模型中，與HIF-1基因無缺陷的炎癥模型相比，炎癥滲出基本消失，提示HIF-1α具有調節(jié)炎癥區(qū)微環(huán)境的的作用。Hellwig-Bürgel等[13]的研究表明HIF-1α可能參與調節(jié)調節(jié)炎癥反應過程中涉及的基因表達。Albina等[14]證實HIF-1α等能以非低氧誘導的形式誘導傷口愈合初期炎癥細胞HIF-1α產生。夏紅利等[15]的研究顯示HIF-1α在急性胰腺炎的發(fā)病機制中起促進炎癥發(fā)展的作用。劉金波等[16]的研究表明在牙髓炎發(fā)生時，缺血、缺氧環(huán)境誘導HIF-1α的產生，炎癥因子如IL-1和TNF-α等可激活 HIF-1α，從而使得 HIF-1α在上游水平調控iNOS、VEGF啟動修復機制成為可能，據(jù)此推測 HIF-1α作為一個調控因素，對炎癥的進程起調節(jié)作用。An等[17]的研究還表明HIF-1α與缺氧環(huán)境中細胞凋亡有關。因此，HIF-1α表達增強除了表明組織氧代謝降低外，HIF-1α還可能參與炎癥進程的調節(jié)，與炎癥發(fā)展有著多方面的聯(lián)系。

我們的結果表明心理應激可能通過降低牙周組織局部的氧代謝水平，使局部組織處于缺氧狀態(tài)，起到加重牙周炎癥的作用。低氧狀態(tài)下，HIF-1α的釋放增多可能還直接參與調節(jié)牙周病的炎癥進程。在牙周炎的治療方案中，可以考慮通過糾正牙周局部低氧狀態(tài)，提高牙周局部供氧量，緩解組織缺氧，減少牙周組織的破壞，為處于應激狀態(tài)下的牙周炎患者提供更加合理有效的治療方案。在制定牙周炎治療計劃時應對患者的心理狀態(tài)予以評估和重視，以期制定更個體化、更高效的治療方案。

[1] 葛姝云, 李德懿. 精神壓力與牙周炎關系的臨床調查[J]. 上?？谇会t(yī)學, 2005, 14(6):582-585.

[2] Merchant AT, Pitiphat W, Ahmed B, et al. A prospective study of social support, anger expression and risk of periodontits in men[J]. J Am Dent Assoc, 2003, 134(12):1591-1596.

[3] 高文祥，羅勇軍，蔣春華，等.低氧及HIF-1α基因轉染對HepG2細胞基因表達譜的影響[J].中國病理生理雜志，2009，25(1)：13-17.

[4] 李 梅，揭 偉，吳秋良，等.HIF-1α/SDF-1信號軸在低氧誘導祖細胞遷移和黏附中的作用[J].中國病理生理雜志，2009，26(11)：2165-2170.

[5] da Silva AM, Newman HN, Oaklay DA. Psychosocial factors in inflammatory periodontal diseases.A Review[J]. J Clin Periodontol, 1995, 22(7):516-526.

[6] Cassella EA. Psychological stress as a risk factor for periodontitis[J].Hawaii Dental J, 2005, 36(6):10, 14.

[7] Vettore MV, Le?o AT, da Silva AM, et al. The relationship of stress and anxiety with chronic periodontitis[J]. J Clin Periodontol, 2003, 30(5):394-402.

[8] Takada T, Yoshinari N, Sugiishi S, et al. Effect of restraint stress on the progression of experimental periodontitis in rats[J]. J Periodontol, 2004, 75(2):306-315.

[9] Peruzzo DC, Benatti BB, Antunes IB, et al. Chronic stress may modulate periodontal disease: a study in rats[J]. J Periodontol, 2008, 79(4):697-704.

[10]李 博, 林崇韜, 周春華. 應激對Wistar大鼠牙周炎動物模型的影響[J]. 吉林大學學報(醫(yī)學版), 2007, 33(5):856-859.

[11]Manhold JH, Doyle JL, Weidinger EH. Effects of social stress on oral and other bodily tissues.Ⅱ.Results offering substance to a hypothesis for the mechanism of formation of periodontal pathology[J]. J Periodontol, 1971, 42(2):109-111.

[12]Cramer T, Yamanishi Y, Clausen BE, et al. HIF-1α is essential for myeloid cell- mediated inflammation[J]. Cell, 2003, 112(5):645-657.

[13]Hellwig-Bürgel T, Rutkowski K, Metzen E, et al. Interleukin-1β and tumor necrosis factor-α stimulate DNA binding of hypoxia-inducible factor-1[J]. Blood, 1999, 94(5):1561-1567.

[14]Albina JE, Mastrofrancesco B, Vessella JA, et al. HIF-1 expression in healing wounds:HIF-1α induction in primary inflammatory cells by TNF-α[J]. Am J Physiol Cell Physiol, 2001, 281(6):C1971-C1977.

[15]夏紅利, 喬建國, 譚 最. HIF-1α在急性胰腺炎發(fā)病機制中的作用[J]. 陜西醫(yī)學雜志, 2005, 34(2):158-160.

[16]劉金波, 丁俊清, 王 莉. 炎癥牙髓中缺氧誘導因子-1α的免疫組化研究[J]. 臨床口腔醫(yī)學雜志, 2003, 19(2):77-78.

[17]An WG, Kanekal M, Simon MC, et al. Stabilization of wild-type p53 by hypoxiα-inducible factor 1α[J]. Nature, 1998, 392(6674):405-408.

Effectofpsychologicalstressondevelopmentofperiodontitisandexpressionofperiodontalhypoxia-induciblefactor1αinrats

ZHANG Zeng-fang1,3, Lü Fang-li2, CHEN Ying2, YANG Xiao-yan2, HUANG Qi-ling1, LI Dong-jian4, HUANG Shi-guang1

(1FacultyofDentistry,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.2DepartmentofParasitology,ZhongshanSchoolofMedicine,SunYat-senUniversity,KeyLaboratoryofTropicalDiseaseControl(SunYat-senUniversity),MinistryofEducation,Guangzhou510080,China;3DepartmentofStomatology,GuangzhouWomenandChildren’sMedicalCenter,Guangzhou510120,China;4StomatologicalHospitalofLiwanDistrict,Guangzhou510170,China.E-mail:thshg@126.com)

AIM: To investigate the effect of psychological stress on the development of periodontitis and the expression of periodontal hypoxia-inducible factor 1α(HIF-1α) in rats.METHODSForty-eight male Wistar rats(SPF grade) were randomly divided into 4 groups:(1) normal control group, i.e. naive rats;(2) experimental periodontitis group: the periodontitis model was induced by wrapping 3-0 silk ligature inoculated with putative periodontopathic bacteria around the left maxillary second molar of the rats;(3) stress group: the rats were treated with stress alone;(4) periodontits with stress group, the periodontitis model was induced as above,and the rats were treated with stress. The rats were sacrificed at week 1, 4, 6 and 8 after the ligature. The attachment losses(AL) were measured by home-made probe. The histological changes of periodontal tissues stained with hematoxylin and eosin(HE) were observed under microscope. The HIF-1α expression level in the periodontal epithelium was determined by immunohistochemistry that was used to evaluate the severity of hypoxia by measuring the average rate of HIF-1α-positive cells.RESULTSNo significant difference of AL between stress group and normal control group was observed(P>0.05).The AL and the average rate of HIF-1α-positive cells in periodontitis with stress group were significantly higher than those in experimental periodontitis group at time points of week 4,6 and 8 after ligature(bothP<0.01).CONCLUSIONPsychological stress is one of the periodontitis inducing factors in the animal model. Psychological stress may aggravate periodontitis by decreasing tissue oxygenation in rats.

Periodontitis; Models,animal; Psychological stress; Hypoxia-inducible factor 1α

R78

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.02-020

1000-4718(2011)02-0315-05

2010-09-26

2010-10-28

國家自然科學基金資助項目(No.81071387);廣東省自然科學基金資助項目(No.10151008901000006)△通訊作者 Tel:020-85221165; E-mail: thshg@126.com