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        TCR Vα23-Vβ13基因修飾T細(xì)胞及其特異性細(xì)胞毒活性研究*

        2011-11-22 07:02:51尹青松楊力建陳少華查顯豐葉靜梅李揚(yáng)秋
        中國(guó)病理生理雜志 2011年2期
        關(guān)鍵詞:基因修飾正常人細(xì)胞株

        尹青松, 譚 獲, 楊力建, 陳少華, 查顯豐, 葉靜梅, 李揚(yáng)秋,4△

        (1河南省腫瘤醫(yī)院,河南 鄭州 450008; 暨南大學(xué) 2醫(yī)學(xué)院血液病研究所,4 再生醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510632; 3 廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤血液中心,廣東 廣州 510260)

        TCR Vα23-Vβ13基因修飾T細(xì)胞及其特異性細(xì)胞毒活性研究*

        尹青松1,2, 譚 獲3, 楊力建2, 陳少華2, 查顯豐2, 葉靜梅3, 李揚(yáng)秋2,4△

        (1河南省腫瘤醫(yī)院,河南 鄭州 450008; 暨南大學(xué)2醫(yī)學(xué)院血液病研究所,4再生醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510632;3廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤血液中心,廣東 廣州 510260)

        目的分析彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)抗原特異T細(xì)胞受體(TCR)Vα23-Vβ13基因修飾T細(xì)胞后的體外特異性殺傷活性。方法擴(kuò)增并克隆已鑒定的DLBCL患者外周血中單克隆增殖T細(xì)胞的TCRVβ13和TCRVα23基因全長(zhǎng)序列,構(gòu)建TCRVβ13-IRES-TCR-Vα23雙基因重組質(zhì)粒,經(jīng)核轉(zhuǎn)染的方法將其轉(zhuǎn)染正常人T細(xì)胞,通過real-time PCR和Western blotting檢測(cè)TCRVβ13和TCRVα23這2個(gè)外源基因在mRNA和蛋白水平的體外表達(dá)情況,并對(duì)TCR轉(zhuǎn)基因T細(xì)胞進(jìn)行體外細(xì)胞毒性檢測(cè)。結(jié)果經(jīng)酶切分析和核酸序列測(cè)定證實(shí)重組質(zhì)粒構(gòu)建正確,轉(zhuǎn)染正常人T細(xì)胞后,TCRVβ13和TCRVα23在mRNA及蛋白水平實(shí)現(xiàn)了共表達(dá)。轉(zhuǎn)染后3 d,TCR轉(zhuǎn)基因T細(xì)胞對(duì)DLBCL細(xì)胞株Toledo細(xì)胞的殺傷活性明顯高于非特異細(xì)胞株Raji細(xì)胞和Molt-4細(xì)胞,顯示出特異性細(xì)胞毒活性。結(jié)論成功構(gòu)建DLBCL相關(guān)抗原特異的TCRVβ13-IRES-TCRVα23雙基因真核表達(dá)質(zhì)粒;TCR基因修飾T細(xì)胞可獲得特異性細(xì)胞毒活性。

        彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤; TCR轉(zhuǎn)基因; 細(xì)胞毒活性

        彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)是最常見的非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma,NHL),約占新診斷病例的30-40%,占侵襲性淋巴瘤的80-90%。多年來(lái)主要采用以CHOP方案(環(huán)磷酰胺、多柔比星、長(zhǎng)春新堿、潑尼松)為主的聯(lián)合化療,但長(zhǎng)期生存率低。靶向免疫治療如利妥昔單抗(CD20單抗)的出現(xiàn)雖然取得了新的療效,但微小殘留病變的存在導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)仍然是目前臨床治療的棘手問題。近年來(lái),臨床腫瘤學(xué)家對(duì)特異性的細(xì)胞免疫治療寄予厚望。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的逐漸成熟,抗原特異的T細(xì)胞受體(T cell receptor, TCR)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)成為惡性腫瘤或病毒感染患者一種有希望的治療措施。為探索尋找抗DLBCL特異性細(xì)胞免疫治療方法,我們前期研究發(fā)現(xiàn)了一些DLBCL病人外周血中存在腫瘤抗原相關(guān)的TCR Vα和Vβ亞家族T細(xì)胞,并已向基因庫(kù)提交和登記了所發(fā)現(xiàn)的抗原特異性TCR基因序列[1]。本文將在此基礎(chǔ)上,利用所發(fā)現(xiàn)的TCR基因序列構(gòu)建DLBCL特異性的TCRVβ-IRES-TCRVα雙基因真核表達(dá)質(zhì)粒,并在體外實(shí)現(xiàn)了共表達(dá),為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究奠定了基礎(chǔ)。

        材 料 和 方 法

        1研究對(duì)象及主要實(shí)驗(yàn)材料

        收集經(jīng)病理活檢確診的1例DLBCL患者(男,51歲)外周血標(biāo)本,以及正常人外周血標(biāo)本,F(xiàn)icoll分層法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)按常規(guī)方法操作。真核雙表達(dá)載體pIRES為德國(guó)ERNST-MORITZ-ARNDT大學(xué)Schmidt教授惠贈(zèng);Toledo細(xì)胞株(人彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系)購(gòu)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(American Type Culture Collection,ATCC),Raji細(xì)胞株和Molt-4細(xì)胞株(急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系)為本室保存;感受態(tài)大腸桿菌DH5α購(gòu)自北京Tiangen;T4 DNA連接酶和各種限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自MBI。

        2抗原特異TCRVα23和TCRVβ13基因全長(zhǎng)擴(kuò)增和克隆

        本課題組的前期研究工作通過利用RT-PCR-基因掃描和序列分析所鑒定的DLBCL患者中克隆性增殖的Vα23和Vβ13亞家族基因序列(基因庫(kù)登記號(hào)碼:EU862326、EU885174),在TCRVα23和Vβ13亞家族起始密碼子的上游各設(shè)一上游引物,分別是Vα23為5’-AGAAGGAATGGAGACCCTCTTGGGC-3’和Vβ13為5’- GCACAGATACAGAAGACCCCTCCGTC-3’;在Cα區(qū)和Cβ2區(qū)終止密碼子的下游各設(shè)一下游引物,分別是Vα23為5’-GCAGAGGAAGGAGCGAGGGAGCAC -3’和Vβ13為5’-GGGTGAGGATGAAGAATGACCTGGGATG-3’。PCR擴(kuò)增出完整的V區(qū)、CDR3區(qū)、J區(qū)、C區(qū),從而獲得TCRVα23和TCRVβ13亞家族的全長(zhǎng)基因序列,并將其連接入pGEM-T Easy載體,測(cè)序鑒定證實(shí)其序列正確無(wú)誤。實(shí)驗(yàn)方法按照本課題組既往的研究方法進(jìn)行[1-4]。

        3構(gòu)建真核表達(dá)載體的引物設(shè)計(jì)與目的基因的擴(kuò)增

        根據(jù)連接入pGEM-T Easy載體的TCRVα23和TCRVβ13亞家族的全長(zhǎng)基因序列,在其上下游設(shè)計(jì)帶有限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)的引物。擴(kuò)增TCRVβ13基因的上游引物帶有EcoR Ⅰ酶切位點(diǎn),下游引物帶有MluⅠ酶切位點(diǎn),上游引物5’-CGGAATTCGCACAGATACAGAAGACCCCTCC GTC-3’(下劃線為EcoRⅠ識(shí)別序列) ,下游引物5’ -TCCACGCGTTCAGTGAGGATGAAGAATGACCTGGGATG-3’(下劃線為MluⅠ識(shí)別序列,斜體部分為終止密碼子);TCRVα23基因的上游引物帶有SalⅠ酶切位點(diǎn),下游引物帶有NotⅠ酶切位點(diǎn),上游引物5’-TTGGTCGACAGAAGGAATGGAGACCCTCTTGGGC-3’(下劃線為SalⅠ識(shí)別序列),下游引物5’-TAATGCGGCCGCTCAGAGGAAGGAGCGAGGGAGCAC-3’(下劃線為NotⅠ識(shí)別序列,斜體部分為終止密碼子)。PCR總反應(yīng)體積為20 μL,包括0.1 mmol/L dNTP、0.5 μmol/L引物、1.5 U Taq DNA聚合酶(Promega)、10×PCR 緩沖液、1.5 mmol/L MgCl2和超純水,以TCRVα23或TCRVβ13-pGEM-T Easy載體質(zhì)粒1 μL作為模板。反應(yīng)在PCR擴(kuò)增儀(BioMetra)中進(jìn)行。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件:94℃ 3 min預(yù)變性后,40個(gè)循環(huán)(94 ℃ 1 min,60 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min),72 ℃ 6 min,擴(kuò)增產(chǎn)物保存于4 ℃中備用,用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。

        4真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

        4.1TCRVβ13-pIRES重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 將pIRES質(zhì)粒與TCRVβ13的PCR產(chǎn)物分別用EcoRⅠ和MluⅠ限制性內(nèi)切酶序貫酶切,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳純化回收產(chǎn)物后,用T4 DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌DH5α。氨芐青霉素抗性挑選陽(yáng)性菌落培養(yǎng)擴(kuò)增,提取質(zhì)粒DNA后用EcoRⅠ和MluⅠ雙酶切鑒定,同時(shí)在pIRES真核表達(dá)載體的IRES區(qū)設(shè)計(jì)一下游引物IRES-R(5’-TATAGACAAACGCACACCGG-3’),結(jié)合pIRES載體上游的T7公共引物(5’-TACGACTCACTATAGGCTAG-3’)進(jìn)行PCR鑒定,PCR反應(yīng)體系及條件同前。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定,篩選出陽(yáng)性克隆,再對(duì)其進(jìn)行雙向測(cè)序鑒定,選擇序列正確的陽(yáng)性克隆,超純質(zhì)粒提取試劑盒(OMEGA, USA)提取TCRVβ13-pIRES重組質(zhì)粒。

        4.2TCRVβ13-IRES-TCRVα23雙基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 將TCRVβ13-pIRES質(zhì)粒與純化后的TCRVα23 PCR產(chǎn)物分別用SalⅠ和NotⅠ限制性內(nèi)切酶序貫酶切,經(jīng)電泳回收目的條帶后,用T4 DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌DH5α。氨芐青霉素抗性挑選陽(yáng)性菌落培養(yǎng)擴(kuò)增,提取質(zhì)粒DNA后用SalⅠ和NotⅠ雙酶切鑒定,同時(shí)IRES區(qū)設(shè)計(jì)一上游引物IRES-F(5’-TAAAAAAACGTCTAGGCCCC-3’),結(jié)合pIRES載體下游的T3公共引物(5’-TAACCCTCACTAAAGGGAAG-3’)進(jìn)行PCR鑒定;酶切產(chǎn)物及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行電泳鑒定,篩選出陽(yáng)性克隆,再對(duì)其進(jìn)行雙向測(cè)序鑒定,選擇序列正確的陽(yáng)性克隆,提取質(zhì)粒,從而獲得TCRVβ13-IRES-TCRVα23雙基因重組質(zhì)粒,紫外分光光度計(jì)測(cè)定重組質(zhì)粒DNA的濃度,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        5核轉(zhuǎn)染

        5.1細(xì)胞培養(yǎng) 分離HLA-A2限制的正常人PBMCs(方法同1.1),應(yīng)用MACS技術(shù)分選CD3+T細(xì)胞。按2×106個(gè)CD3+T細(xì)胞/孔接種于12孔板,培養(yǎng)總液量2 mL,含10%(V/V)胎牛血清、2 mg/L PHA 、50 μmol/L 2-巰基乙醇、2 mmol/L L-谷氨酰胺、1×105U/L青-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基,37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)刺激培養(yǎng)24 h后,300×g離心10 min,更換培養(yǎng)基,培養(yǎng)體系為:10%胎牛血清、3×105U/L重組人IL-2、50 μmol/L 2-巰基乙醇、2 mmol/L L-谷氨酰胺、1×105U/L青-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基,37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)維持培養(yǎng),2-3 d更換培養(yǎng)基,直至培養(yǎng)5-6 d,計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5×106個(gè)/每份,200×g離心10 min,棄上清備用。

        5.2實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)根據(jù)轉(zhuǎn)染TCRVβ13-IRES-TCRVα23重組質(zhì)粒組(A組);轉(zhuǎn)染空載體組(B組);空轉(zhuǎn)染組(C組),共分為3組。

        5.3轉(zhuǎn)染 (1)轉(zhuǎn)染前將2.25 mL NucleofectorTMsolution和0.5 mL supplement(human T-cell NucleofectorTMkit)配制成混懸液,4 ℃保存?zhèn)溆茫?2)將配制的Nucleofector混懸液預(yù)熱至室溫,用100 μL混懸液懸浮沉淀細(xì)胞,加入Nucleofector混懸液的細(xì)胞至Nucleofector核轉(zhuǎn)儀的時(shí)間不應(yīng)超過15 min,否則影響轉(zhuǎn)染效率;(3)準(zhǔn)備2 μg/份質(zhì)粒DNA標(biāo)本,調(diào)整質(zhì)粒DNA的濃度使加入混懸液的體積不超過5 μL;(4)將2 μg質(zhì)粒DNA加入至100 μL核轉(zhuǎn)細(xì)胞懸液中,用微型tip輕輕混勻后,加入核轉(zhuǎn)杯底部,避免產(chǎn)生氣泡,蓋藍(lán)色核轉(zhuǎn)杯蓋子;(5)選擇T-020程序轉(zhuǎn)染人類T淋巴細(xì)胞,將核轉(zhuǎn)杯放入杯槽,按“x”鍵開始轉(zhuǎn)染程序;(6)核轉(zhuǎn)染結(jié)束后立刻將核轉(zhuǎn)杯從杯槽中取出,向核轉(zhuǎn)杯中加入500 μL預(yù)熱至室溫的RPMI-1640培養(yǎng)基,吸出杯中的液體至含3 mL的完全培養(yǎng)基中于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)孵育培養(yǎng)8 h后更換培養(yǎng)基,加入含3×105U/L重組人IL-2的完全培養(yǎng)基,于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育培養(yǎng)。

        6抗原特異TCRαβ雙基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞株后外源TCR基因表達(dá)的鑒定

        6.1間接免疫熒光法檢測(cè)外源基因的表達(dá) 轉(zhuǎn)染48 h后,收集1×106個(gè)細(xì)胞,用0.1 mol/L PBS洗滌細(xì)胞2次后,直接用小鼠抗人FITC-Vβ13單抗(Beckman Coulter)標(biāo)記,37 ℃孵育1 h后,PBS洗滌細(xì)胞2次,應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞綠色熒光產(chǎn)生情況。

        6.2RT-PCR和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的正常人T細(xì)胞中TCRVα23和TCRVβ13基因mRNA水平的表達(dá) 轉(zhuǎn)染3 d后,收集2×106個(gè)細(xì)胞提取總RNA,合成cDNA,用相應(yīng)的TCRVα23和TCRVβ13亞家族的帶有酶切位點(diǎn)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,轉(zhuǎn)染空載體組作為陰性對(duì)照,PCR擴(kuò)增體系、擴(kuò)增條件以及電泳條件同前所述。應(yīng)用Real Master Mix試劑盒(北京Tiangen),利用SYBR green I染料檢測(cè)相應(yīng)的TCRVα23和TCRVβ13基因的表達(dá)情況,并用同比例稀釋的RNA作為內(nèi)對(duì)照。總反應(yīng)體積為25 μL,包括2.5×real master mix 11.25 μL、0.25 mmol/L TCRVα/Vβ亞家族引物以及1 μL模板;PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件:95 ℃ 2 min預(yù)變性后,45個(gè)循環(huán)(95 ℃ 15 s,62 ℃ 1 min),并在83 ℃和87 ℃ 2次讀板。反應(yīng)在MJ Research熒光定量PCR儀(Bio-Rad)中進(jìn)行。

        6.3Western blotting檢測(cè)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的正常人T細(xì)胞中TCRVβ13蛋白的表達(dá) 轉(zhuǎn)染3 d后,收集2×106個(gè)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細(xì)胞,用RIPA蛋白提取試劑盒提取總蛋白,同樣提取臍血細(xì)胞(TCRVβ13亞家族表達(dá)陽(yáng)性)的蛋白作為陽(yáng)性對(duì)照,轉(zhuǎn)染pIRES空載體細(xì)胞的蛋白作為陰性對(duì)照檢測(cè)TCRVβ13蛋白的表達(dá)。將轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的濃縮蛋白樣品、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照分別加樣于10%SDS-PAGE膠進(jìn)行凝膠電泳。轉(zhuǎn)NC膜(Invitrogen)后,用小鼠抗人β-actin單抗和HRP-羊抗小鼠IgG抗體(均為武漢博士德產(chǎn)品)進(jìn)行雜交孵育,DAB底物顯色(北京Tiangen)檢測(cè)人β-actin蛋白(內(nèi)參照)的表達(dá),以了解所提取蛋白質(zhì)量;同時(shí)將另1個(gè)平行反應(yīng)的NC膜依次加入1∶500的小鼠抗人TCRVβ13單抗(Beckman Coulter)和1∶500的羊抗小鼠IgG抗體(武漢博士德)進(jìn)行雜交孵育,DAB顯色檢測(cè)目的蛋白TCRVβ13蛋白的表達(dá)情況。

        7細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

        7.1Toledo細(xì)胞株、Raji細(xì)胞株、Molt-4細(xì)胞株的體外培養(yǎng) Toledo細(xì)胞株作為殺傷性實(shí)驗(yàn)的靶細(xì)胞,培養(yǎng)體系含10%胎牛血清、1×105U/L青-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基,于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng);Raji和Molt-4細(xì)胞株和正常人PBMCs作為殺傷性實(shí)驗(yàn)的非特異對(duì)照,以檢測(cè)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的T細(xì)胞的細(xì)胞毒活性及其特異性。

        7.2LDH釋放實(shí)驗(yàn) 以乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)檢測(cè)試劑盒(Roche)在轉(zhuǎn)染3 d后檢測(cè)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的正常人T細(xì)胞的特異性細(xì)胞毒活性,操作按說明進(jìn)行。分別以轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的正常人CD3+T細(xì)胞、轉(zhuǎn)染空載體的正常人CD3+T細(xì)胞及無(wú)DNA轉(zhuǎn)染的空轉(zhuǎn)染組為效應(yīng)細(xì)胞,以Toledo細(xì)胞、Raji細(xì)胞、Molt-4細(xì)胞和正常人PBMCs為靶細(xì)胞,后3種細(xì)胞均為陰性對(duì)照。效/靶比為10∶1,靶細(xì)胞濃度5×103cells/well,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔;置U型96孔培養(yǎng)板內(nèi),2 500 r/min 離心30 s,以促進(jìn)效/靶細(xì)胞之間接觸,于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育10 h;1 000 r/min離心5 min,吸取上清100 μL加入平底酶標(biāo)板中,加入100 μL LDH底物反應(yīng)液,室溫下避光作用30 min,每孔加50 μL終止液終止酶促反應(yīng),輕輕振蕩10 s;Elx-800酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度(absorbance,A)值,測(cè)定波長(zhǎng)490 nm,參考波長(zhǎng)670 nm。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

        7.3CTL細(xì)胞毒活性計(jì)算公式 CTL活性(%)=(實(shí)驗(yàn)組A值-效應(yīng)細(xì)胞自然釋放組A值-靶細(xì)胞自然釋放組A值)/(最大釋放組A值-靶細(xì)胞自然釋放組A值)。

        8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

        采用兩樣本比較的秩和檢驗(yàn)(Mann-Whitney Test)。

        結(jié) 果

        1DLBCL相關(guān)抗原特異性TCR基因全長(zhǎng)克隆和雙基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建

        對(duì)DLBCL患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行TCRVβ和Vα亞家族譜系分析和基因掃描分析結(jié)果顯示TCRVβ13和TCRVα23亞家族出現(xiàn)寡克隆增殖,PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果通過NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的Blast比對(duì)無(wú)誤后,擴(kuò)增出TCRVβ13和TCRVα23亞家族全長(zhǎng)的基因片段,然后連接入pGEM-T Easy克隆載體,測(cè)序鑒定為正確的序列后,將其相應(yīng)的基因序列分別轉(zhuǎn)入真核表達(dá)載體pIRES的MCS A和MCS B位點(diǎn),宿主菌中擴(kuò)增后提取質(zhì)粒,得到TCRVβ13-IRES-TCRVα23雙基因真核表達(dá)質(zhì)粒,見圖1。

        Figure 1. The structural pattern of the recombinant plasmid TCR Vβ13-IRES-TCR Vα23.

        2TCRVβ13-IRES-TCRVα23雙基因真核表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

        應(yīng)用EcoRⅠ和MluⅠ雙酶切TCRVβ13-IRES-TCRVα23真核雙表達(dá)質(zhì)粒,得到長(zhǎng)約1 022 bp和6 960 bp的2條片段;而應(yīng)用SalⅠ和NotⅠ雙酶切,則得到長(zhǎng)約879 bp和約7 108 bp的2條片段。用pIRES載體上的T7/IRES-R引物、IRES-F/T3引物分別對(duì)重組質(zhì)粒的插入位點(diǎn)A片段和插入位點(diǎn)B片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增,結(jié)果亦顯示了相應(yīng)大小的片段(含Vα片段:997 bp;含Vβ片段:1 152 bp),見圖 2。

        對(duì)TCRVβ13-IRES-TCRVα23雙基因真核表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序分析,結(jié)果證實(shí)轉(zhuǎn)入的TCRVα和TCRVβ基因序列與DLBCL患者外周血中存在的克隆性增殖T細(xì)胞的TCRVα和TCRVβ基因的全長(zhǎng)基因序列相一致,部分測(cè)序結(jié)果見圖3。并且能翻譯出相應(yīng)的氨基酸TCRVβ13和TCRVα23基因的CDR3區(qū)分別為“SRGISSTDTQY”和“VRVTGSRLT”。

        Figure 2. Identification of recombinant plasmid TCR Vβ13-IRES-TCR Vα23 by electrophoreisis. 1: 15 kb DNA Marker; Lane 2, 3: TCR Vβ13(1 016 bp) and TCR Vα23(872 bp) PCR products amplified by regular primers; Lane 4, 5: TCR Vβ13(1 152 bp) and TCR Vα23(997 bp) PCR products amplified by primers in vector; Lane 6: TCR Vβ13-IRES-TCR Vα23 recombinant plasmid digested by EcoR Ⅰand MluⅠ; Lane 7: TCR Vβ13-IRES-TCR Vα23 recombinant plasmid digested by Sal Ⅰand Not Ⅰ; Lane 8: TCR Vβ13-IRES-TCR Vα23 recombinant plasmid; Lane 9: negative control of PCR products.

        Figure 3. CDR3 sequences of both TCR Vβ13 and TCR Vα23 genes from TCR Vβ13-IRES-TCR Vα23. 1: the A site of TCR Vβ13-IRES-TCR Vα23 recombinant plasmid(TCR Vβ13); 2: the B site of TCR Vβ13-IRES-TCR Vα23 recombinant plasmid(TCR Vα23).

        3間接免疫熒光法檢測(cè)重組質(zhì)粒的表達(dá)

        通過Nucleofactor核轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染3 d后,用熒光顯微鏡檢測(cè)特異性TCRVβ13單抗標(biāo)記轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的正常人CD3+T細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的正常人CD3+T細(xì)胞出現(xiàn)綠色熒光,陽(yáng)性率可達(dá)30%,而轉(zhuǎn)染空載體的陰性對(duì)照組細(xì)胞未見明顯熒光或熒光弱且很快淬滅,見圖4。

        Figure 4. Antigen-specific TCR gene-transduced CD3+T cells were stained with a TCR Vβ13 monoclonal antibody(McAb)(LSM, ×630). A: CD3+T cells were transduced with TCR Vβ13-IRES-TCR Vα23 recombinant plasmid and were stained by FITC-TCR Vβ13 monoclonal antibody(McAb); B: CD3+T cells were transferred with empty vector served as a negative control for exogenous TCR Vβ13 expression.

        4TCRαβ雙基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的正常人CD3+T細(xì)胞中mRNA水平的表達(dá)

        轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒3 d后,通過real-time PCR對(duì)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的正常人CD3+T細(xì)胞進(jìn)行外源TCRVα和TCRVβ基因mRNA水平表達(dá)的檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)以cDNA為模板的轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的正常人CD3+T細(xì)胞中外源的TCRVα和TCRVβ基因擴(kuò)增的Ct值較同比稀釋的RNA為模板擴(kuò)增的Ct值提前2-3個(gè),表明轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細(xì)胞中外源TCR基因在mRNA水平得到了穩(wěn)定的表達(dá);并且同一個(gè)重組質(zhì)粒的2個(gè)外源基因mRNA的表達(dá)水平基本上相一致(Ct值大約為14左右),見圖5。

        Figure 5. Detection of mRNA expression of TCR Vβ13 and TCR Vα23 genes of healthy individual CD3+T cells which transfected with recombinant plasmids by real-time PCR. A: using cDNA template of healthy individual CD3+T cells transfected with recombinant plasmid;B: using RNA template of healthy individual CD3+T cells transfected with recombinant plasmid;C: using cDNA template of healthy individual CD3+T cells transfected with empty vector.

        5Westernblotting檢測(cè)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的正常人CD3+T細(xì)胞中TCRVβ13蛋白的表達(dá)

        將轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒3 d后的正常人CD3+T細(xì)胞、陽(yáng)性對(duì)照(表達(dá)Vβ13的臍血細(xì)胞)和陰性對(duì)照(轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞)的蛋白樣品分2組進(jìn)行SDS-PAGE電泳:第1組用小鼠抗人β-actin單抗和HRP-羊抗小鼠IgG抗體分別雜交;第2組用小鼠抗人TCRVβ13單抗和HRP-羊抗小鼠IgG抗體分別雜交,然后再與特異底物反應(yīng)產(chǎn)生熒光產(chǎn)物,經(jīng)DAB顯色后均得到特異的雜交帶。第1組雜交帶的蛋白質(zhì)分子量與人β-actin蛋白的分子量大小相一致,表明所提取的蛋白質(zhì)質(zhì)量良好;第2組雜交帶的蛋白質(zhì)分子量與轉(zhuǎn)入的TCRVβ13蛋白的理論分子量(約34 kD)一致,見圖6,說明轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的正常人CD3+T細(xì)胞可以穩(wěn)定表達(dá)TCRVβ13蛋白。

        6轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒T細(xì)胞的特異性殺傷實(shí)驗(yàn)

        轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒3 d后,TCRVβ13-Vα23雙基因修飾的CD3+T細(xì)胞對(duì)Toledo細(xì)胞株的細(xì)胞毒殺傷活性明顯高于TCR未轉(zhuǎn)染組T細(xì)胞(P<0.05),殺傷效力為(13.75±0.69)%。同時(shí),以Raji細(xì)胞、Molt-4細(xì)胞和正常人PBMCs作為靶細(xì)胞的非特異

        Figure 6. TCR Vβ13 protein expression was detected in TCR gene-transfected CD3+T cells by Western blotting.1: CD3+T cells transfected with TCR Vβ13-IRES-TCR Vα23 recombinant plasmid; 2: mononuclear cells from the cord blood expressing TCR Vβ13 protein served as positive control; 3: CD3+T cells transfected with empty vector served as negative control.

        對(duì)照,用于檢測(cè)TCR基因轉(zhuǎn)染的正常人CD3+T細(xì)胞對(duì)Toledo細(xì)胞株的特異性細(xì)胞毒活性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其對(duì)Toledo細(xì)胞株的殺傷活性均明顯高于Raji細(xì)胞和Molt-4細(xì)胞(均P<0.05),見圖7,而對(duì)正常人PBMCs的細(xì)胞毒活性按公式計(jì)算為零或負(fù)值,故認(rèn)為其對(duì)正常人PBMCs無(wú)明顯殺傷性。

        Figure 7. Specific cytotoxicity of TCR gene-transduced CD3+T cells directed against Toledo cells were detected using the LDH release assay.

        討 論

        T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答在機(jī)體抗腫瘤免疫過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[5],尤其在清除腫瘤微小殘留病變方面。眾多研究均提示腫瘤患者體內(nèi)存在殺傷腫瘤細(xì)胞的特異性效應(yīng)T細(xì)胞。在B-NHL患者體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)腫瘤侵潤(rùn)T淋巴細(xì)胞(TILs)以及克隆性增殖的T細(xì)胞[6,7]。然而,分離純化及擴(kuò)增腫瘤患者體內(nèi)的這些特異性效應(yīng)T細(xì)胞非常困難從而限制其臨床的廣泛應(yīng)用。由于CTL的特異性是由其TCR基因決定的,抗原特異的TCR基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)就是CTL特異性的轉(zhuǎn)移。因此,通過TCR轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量的抗原特異性效應(yīng)細(xì)胞而用于腫瘤患者進(jìn)行過繼性免疫治療,被認(rèn)為是一種新的有希望的過繼性細(xì)胞免疫治療策略。盡管該研究技術(shù)已經(jīng)在多個(gè)中心廣泛開展[8,9],而關(guān)于DLBCL相關(guān)抗原特異TCR基因的研究目前還沒有相關(guān)的報(bào)導(dǎo)。本研究所探討的是通過TCR轉(zhuǎn)基因技術(shù)而產(chǎn)生的一種可能有效治療DLBCL患者的T細(xì)胞克隆,期望為DLBCL患者探索性尋找一種新的治療手段。

        進(jìn)行TCR基因轉(zhuǎn)導(dǎo)從而獲得大量用于治療的抗原特異TCR基因修飾T細(xì)胞的關(guān)鍵是獲得抗原特異的TCR基因,這也是眾多研究者關(guān)注的焦點(diǎn)。我們前期的研究工作發(fā)現(xiàn)DLBCL患者的外周血中存在克隆性增殖T細(xì)胞,并擴(kuò)增出呈單克隆增殖趨勢(shì)的TCRVα23和TCRVβ13亞家族T細(xì)胞的全長(zhǎng)TCR基因序列(TCRVα23的GenBank accession:EU862326;TCRVβ13的GenBank accession:EU EU885174),從而用于構(gòu)建TCR基因真核表達(dá)載體。為了解TCR α和TCR β鏈基因在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中的充分表達(dá)情況,我們前期的研究將TCRVα或TCRVβ基因分別連接入帶有增強(qiáng)綠色熒光蛋白基因的真核表達(dá)載體,構(gòu)建TCR α或β的單鏈基因重組質(zhì)粒,并在體外實(shí)現(xiàn)了共表達(dá)[1]。然而,臨床研究表明,對(duì)于TCR α β基因修飾T細(xì)胞的臨床應(yīng)用需要采用1個(gè)載體編碼TCR α和β兩條鏈而不是采用2個(gè)載體。在共表達(dá)載體的構(gòu)建中,利用IRES構(gòu)建多或雙順反子表達(dá)載體是較為被肯定的一種方法[10]。然而,文獻(xiàn)報(bào)道克隆到IRES下游位點(diǎn)基因的表達(dá)水平要明顯低于上游位點(diǎn)基因的表達(dá)水平[11]。還有研究發(fā)現(xiàn)TCR α β異源二聚體與特異性抗原肽特異性識(shí)別和結(jié)合的過程中,TCR β鏈可能發(fā)揮更為關(guān)鍵性的作用[12]。為此,本研究將TCR α和β鏈基因分別連接入IRES的3’端和5’端位點(diǎn),從而構(gòu)建了攜帶TCR α和β鏈的TCRVβ13-IRES-TCRVα23雙基因重組質(zhì)粒。進(jìn)一步分別經(jīng)過PCR擴(kuò)增、雙酶切和序列分析進(jìn)行鑒定證實(shí)其構(gòu)建正確無(wú)誤。

        通過TCR基因轉(zhuǎn)導(dǎo)賦予T細(xì)胞具有新的特異性的前提條件是一個(gè)能達(dá)到穩(wěn)定高水平的轉(zhuǎn)基因表達(dá)和高效的轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)。雖然目前TCR基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的載體主要還是病毒載體,但一直以來(lái)都在嘗試尋找更理想的理化轉(zhuǎn)導(dǎo)方式。本研究采用一種新的非病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)方式-NucleofactorTM技術(shù),將TCR α β雙基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染正常人T細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48 h的轉(zhuǎn)染效率大約為30%左右。并在mRNA和蛋白質(zhì)水平分別檢測(cè)到外源TCRVα23和TCRVβ13基因的穩(wěn)定表達(dá)。進(jìn)一步我們又通過LDH釋放法檢測(cè)TCR基因修飾T細(xì)胞的體外特異性細(xì)胞毒活性,發(fā)現(xiàn)其對(duì)DLBCL細(xì)胞株具有特異性殺傷活性,但是表現(xiàn)出較弱的殺傷效力,究其原因可能與以下幾點(diǎn)有關(guān),首先,有研究者發(fā)現(xiàn)通過2A多肽連接子連接TCR α和β鏈基因可以提高2個(gè)外源基因的表達(dá)及轉(zhuǎn)基因修飾T細(xì)胞的功能活性[13]。而本研究采用IRES連接2個(gè)TCR鏈基因,如果通過一個(gè)P2A連接子連接或許可以使外源基因的表達(dá)水平進(jìn)一步提高;其次,最理想的特異性細(xì)胞毒效應(yīng)應(yīng)該是所制作的TCR基因修飾T細(xì)胞對(duì)自身腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷效應(yīng),而本研究所進(jìn)行的是DLBCL相關(guān)抗原特異TCR基因修飾正常T細(xì)胞后細(xì)胞毒活性的檢測(cè),可能存在MHC的限制性問題;而最主要的一個(gè)原因可能是因?yàn)槟[瘤細(xì)胞表達(dá)多種腫瘤特異或相關(guān)抗原,可以誘導(dǎo)多個(gè)T細(xì)胞克隆的增殖,而本實(shí)驗(yàn)過程僅僅選擇其中的一種特異TCR進(jìn)行基因修飾,可能其發(fā)揮作用不能達(dá)到最佳效果。因此,在后續(xù)研究中,我們還要繼續(xù)優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件以提高轉(zhuǎn)染效率,盡可能消除MHC的限制性以提高轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的功能活性,同時(shí)還有可能增加多個(gè)特異TCR基因修飾T細(xì)胞的聯(lián)合作用,期望可以提高殺傷腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng)。

        總之,本研究成功構(gòu)建了DLBCL相關(guān)抗原特異性TCRVβ13-IRES-TCRVα23雙基因重組質(zhì)粒;進(jìn)一步將其轉(zhuǎn)基因修飾正常人T細(xì)胞,初步證實(shí)其對(duì)DLBCL細(xì)胞株具有特異性殺傷活性。為進(jìn)一步TCR基因修飾T細(xì)胞用于腫瘤患者進(jìn)行過繼性免疫治療提供基礎(chǔ)資料。

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        SpecificcytotoxicityofTCRVα23-Vβ13gene-modifiedT-cells

        YIN Qing-song1,2, TAN Huo3, YANG Li-jian2, CHEN Shao-hua2, ZHA Xian-feng2, YE Jing-mei3, LI Yang-qiu2,4

        (1HenanCancerHospital,Zhengzhou450008,China;2InstituteofHematology,SchoolofMedicine,4KeyLaboratoryforRegenerativeMedicineofMinistryofEducation,JinanUniversity,Guangzhou510632,China;3CentreofOncologyandHematology,FirstAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalCollege,Guangzhou510260,China.E-mail:jnyangqiuli@163.com)

        AIM: To analyze the cytotoxicity of TCRVα23-Vβ13 gene-modified T-cells specific to diffuse large B-cell lymphoma(DLBCL) associated antigensinvitro.METHODSThe identified full-length TCRVβ13 andVα23 genes of monoclonally expanded T-cells in the peripheral blood from a DLBCL patient were amplified and cloned. The bicistronic recombinant plasmid TCRVβ13-IRES-TCRVα23 was constructed and transfected into T-cells isolated from a healthy individual by NucleofectorTMtechnology. The mRNA expression of antigen-specific TCRVα23 andVβ13 genes and the corresponding proteins were determined by real-time PCR and Western blotting, respectively. The specific cytotoxicity of TCR gene-transferred T-cellsinvitrowas detected.RESULTSThe recombinant plasmid was constructed successfully and verified by restriction enzyme digestion and nucleotide sequencing. The co-expression of antigen-specific TCRVα23 andVβ13 genes at mRNA and protein levels in the transfected healthy T-cells were observedinvitro. Three days after transfection, the cytotoxicity of TCR gene-transduced CD3+T-cells against Toledo cells was significantly higher than that against Raji cells or Molt-4 cells. The DLBCL-specific cytotoxic T-lymphocytes(CTL) were inducted.CONCLUSIONThe bicistronic eukaryotic expression plasmid TCRVβ13-IRES-TCRVα23 specific to DLBCL-associated antigens is constructed successfully. The TCR gene-transferred T-cells display the ability of DLBCL-specific cytotoxicity.

        Diffuse large B-cell lymphoma; TCR gene transfer; Cytotoxicity

        R392.11; R733.4

        A

        10.3969/j.issn.1000-4718.2011.02-010

        1000-4718(2011)02-0260-08

        2010-07-14

        2010-11-10

        國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目(No.2006AA02Z114);廣東自然科學(xué)基金重點(diǎn)資助項(xiàng)目(No.05103293;No.9251063201000001)

        △通訊作者 Tel: 020-85226877; E-mail: jnyangqiuli@163.com

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