尹青松, 譚 獲， 楊力建, 陳少華， 查顯豐， 葉靜梅， 李揚(yáng)秋,4△

(1河南省腫瘤醫(yī)院，河南 鄭州 450008； 暨南大學(xué) 2醫(yī)學(xué)院血液病研究所，4 再生醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510632； 3 廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤血液中心，廣東 廣州 510260)

TCR Vα23-Vβ13基因修飾T細(xì)胞及其特異性細(xì)胞毒活性研究*

尹青松1,2, 譚 獲3， 楊力建2, 陳少華2， 查顯豐2， 葉靜梅3， 李揚(yáng)秋2,4△

(1河南省腫瘤醫(yī)院，河南 鄭州 450008； 暨南大學(xué)2醫(yī)學(xué)院血液病研究所，4再生醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510632；3廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤血液中心，廣東 廣州 510260)

目的分析彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)抗原特異T細(xì)胞受體(TCR)Vα23-Vβ13基因修飾T細(xì)胞后的體外特異性殺傷活性。方法擴(kuò)增并克隆已鑒定的DLBCL患者外周血中單克隆增殖T細(xì)胞的TCRVβ13和TCRVα23基因全長序列，構(gòu)建TCRVβ13-IRES-TCR-Vα23雙基因重組質(zhì)粒，經(jīng)核轉(zhuǎn)染的方法將其轉(zhuǎn)染正常人T細(xì)胞，通過real-time PCR和Western blotting檢測TCRVβ13和TCRVα23這2個外源基因在mRNA和蛋白水平的體外表達(dá)情況，并對TCR轉(zhuǎn)基因T細(xì)胞進(jìn)行體外細(xì)胞毒性檢測。結(jié)果經(jīng)酶切分析和核酸序列測定證實(shí)重組質(zhì)粒構(gòu)建正確，轉(zhuǎn)染正常人T細(xì)胞后，TCRVβ13和TCRVα23在mRNA及蛋白水平實(shí)現(xiàn)了共表達(dá)。轉(zhuǎn)染后3 d，TCR轉(zhuǎn)基因T細(xì)胞對DLBCL細(xì)胞株Toledo細(xì)胞的殺傷活性明顯高于非特異細(xì)胞株Raji細(xì)胞和Molt-4細(xì)胞，顯示出特異性細(xì)胞毒活性。結(jié)論成功構(gòu)建DLBCL相關(guān)抗原特異的TCRVβ13-IRES-TCRVα23雙基因真核表達(dá)質(zhì)粒；TCR基因修飾T細(xì)胞可獲得特異性細(xì)胞毒活性。

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤； TCR轉(zhuǎn)基因； 細(xì)胞毒活性

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)是最常見的非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma，NHL)，約占新診斷病例的30-40%，占侵襲性淋巴瘤的80-90%。多年來主要采用以CHOP方案(環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿、潑尼松)為主的聯(lián)合化療，但長期生存率低。靶向免疫治療如利妥昔單抗(CD20單抗)的出現(xiàn)雖然取得了新的療效，但微小殘留病變的存在導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)仍然是目前臨床治療的棘手問題。近年來，臨床腫瘤學(xué)家對特異性的細(xì)胞免疫治療寄予厚望。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的逐漸成熟，抗原特異的T細(xì)胞受體(T cell receptor, TCR)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)成為惡性腫瘤或病毒感染患者一種有希望的治療措施。為探索尋找抗DLBCL特異性細(xì)胞免疫治療方法，我們前期研究發(fā)現(xiàn)了一些DLBCL病人外周血中存在腫瘤抗原相關(guān)的TCR Vα和Vβ亞家族T細(xì)胞，并已向基因庫提交和登記了所發(fā)現(xiàn)的抗原特異性TCR基因序列[1]。本文將在此基礎(chǔ)上，利用所發(fā)現(xiàn)的TCR基因序列構(gòu)建DLBCL特異性的TCRVβ-IRES-TCRVα雙基因真核表達(dá)質(zhì)粒，并在體外實(shí)現(xiàn)了共表達(dá)，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究奠定了基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1研究對象及主要實(shí)驗(yàn)材料

收集經(jīng)病理活檢確診的1例DLBCL患者(男，51歲)外周血標(biāo)本，以及正常人外周血標(biāo)本，F(xiàn)icoll分層法分離外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)按常規(guī)方法操作。真核雙表達(dá)載體pIRES為德國ERNST-MORITZ-ARNDT大學(xué)Schmidt教授惠贈；Toledo細(xì)胞株(人彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系)購自美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，Raji細(xì)胞株和Molt-4細(xì)胞株(急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系)為本室保存；感受態(tài)大腸桿菌DH5α購自北京Tiangen；T4 DNA連接酶和各種限制性內(nèi)切酶均購自MBI。

2抗原特異TCRVα23和TCRVβ13基因全長擴(kuò)增和克隆

本課題組的前期研究工作通過利用RT-PCR-基因掃描和序列分析所鑒定的DLBCL患者中克隆性增殖的Vα23和Vβ13亞家族基因序列(基因庫登記號碼：EU862326、EU885174)，在TCRVα23和Vβ13亞家族起始密碼子的上游各設(shè)一上游引物，分別是Vα23為5’-AGAAGGAATGGAGACCCTCTTGGGC-3’和Vβ13為5’- GCACAGATACAGAAGACCCCTCCGTC-3’；在Cα區(qū)和Cβ2區(qū)終止密碼子的下游各設(shè)一下游引物，分別是Vα23為5’-GCAGAGGAAGGAGCGAGGGAGCAC -3’和Vβ13為5’-GGGTGAGGATGAAGAATGACCTGGGATG-3’。PCR擴(kuò)增出完整的V區(qū)、CDR3區(qū)、J區(qū)、C區(qū)，從而獲得TCRVα23和TCRVβ13亞家族的全長基因序列，并將其連接入pGEM-T Easy載體，測序鑒定證實(shí)其序列正確無誤。實(shí)驗(yàn)方法按照本課題組既往的研究方法進(jìn)行[1-4]。

3構(gòu)建真核表達(dá)載體的引物設(shè)計(jì)與目的基因的擴(kuò)增

根據(jù)連接入pGEM-T Easy載體的TCRVα23和TCRVβ13亞家族的全長基因序列，在其上下游設(shè)計(jì)帶有限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)的引物。擴(kuò)增TCRVβ13基因的上游引物帶有EcoR Ⅰ酶切位點(diǎn)，下游引物帶有MluⅠ酶切位點(diǎn)，上游引物5’-CGGAATTCGCACAGATACAGAAGACCCCTCC GTC-3’(下劃線為EcoRⅠ識別序列) ，下游引物5’ -TCCACGCGTTCAGTGAGGATGAAGAATGACCTGGGATG-3’(下劃線為MluⅠ識別序列，斜體部分為終止密碼子)；TCRVα23基因的上游引物帶有SalⅠ酶切位點(diǎn)，下游引物帶有NotⅠ酶切位點(diǎn)，上游引物5’-TTGGTCGACAGAAGGAATGGAGACCCTCTTGGGC-3’(下劃線為SalⅠ識別序列)，下游引物5’-TAATGCGGCCGCTCAGAGGAAGGAGCGAGGGAGCAC-3’(下劃線為NotⅠ識別序列，斜體部分為終止密碼子)。PCR總反應(yīng)體積為20 μL，包括0.1 mmol/L dNTP、0.5 μmol/L引物、1.5 U Taq DNA聚合酶(Promega)、10×PCR 緩沖液、1.5 mmol/L MgCl2和超純水，以TCRVα23或TCRVβ13-pGEM-T Easy載體質(zhì)粒1 μL作為模板。反應(yīng)在PCR擴(kuò)增儀(BioMetra)中進(jìn)行。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：94℃ 3 min預(yù)變性后，40個循環(huán)(94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min)，72 ℃ 6 min，擴(kuò)增產(chǎn)物保存于4 ℃中備用，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。

4真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

4.1TCRVβ13-pIRES重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 將pIRES質(zhì)粒與TCRVβ13的PCR產(chǎn)物分別用EcoRⅠ和MluⅠ限制性內(nèi)切酶序貫酶切，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳純化回收產(chǎn)物后，用T4 DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌DH5α。氨芐青霉素抗性挑選陽性菌落培養(yǎng)擴(kuò)增，提取質(zhì)粒DNA后用EcoRⅠ和MluⅠ雙酶切鑒定，同時(shí)在pIRES真核表達(dá)載體的IRES區(qū)設(shè)計(jì)一下游引物IRES-R(5’-TATAGACAAACGCACACCGG-3’)，結(jié)合pIRES載體上游的T7公共引物(5’-TACGACTCACTATAGGCTAG-3’)進(jìn)行PCR鑒定，PCR反應(yīng)體系及條件同前。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，篩選出陽性克隆，再對其進(jìn)行雙向測序鑒定，選擇序列正確的陽性克隆，超純質(zhì)粒提取試劑盒(OMEGA, USA)提取TCRVβ13-pIRES重組質(zhì)粒。

4.2TCRVβ13-IRES-TCRVα23雙基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 將TCRVβ13-pIRES質(zhì)粒與純化后的TCRVα23 PCR產(chǎn)物分別用SalⅠ和NotⅠ限制性內(nèi)切酶序貫酶切，經(jīng)電泳回收目的條帶后，用T4 DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌DH5α。氨芐青霉素抗性挑選陽性菌落培養(yǎng)擴(kuò)增，提取質(zhì)粒DNA后用SalⅠ和NotⅠ雙酶切鑒定，同時(shí)IRES區(qū)設(shè)計(jì)一上游引物IRES-F(5’-TAAAAAAACGTCTAGGCCCC-3’)，結(jié)合pIRES載體下游的T3公共引物(5’-TAACCCTCACTAAAGGGAAG-3’)進(jìn)行PCR鑒定；酶切產(chǎn)物及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行電泳鑒定，篩選出陽性克隆，再對其進(jìn)行雙向測序鑒定，選擇序列正確的陽性克隆，提取質(zhì)粒，從而獲得TCRVβ13-IRES-TCRVα23雙基因重組質(zhì)粒，紫外分光光度計(jì)測定重組質(zhì)粒DNA的濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

5核轉(zhuǎn)染

5.1細(xì)胞培養(yǎng) 分離HLA-A2限制的正常人PBMCs(方法同1.1)，應(yīng)用MACS技術(shù)分選CD3+T細(xì)胞。按2×106個CD3+T細(xì)胞/孔接種于12孔板，培養(yǎng)總液量2 mL，含10%(V/V)胎牛血清、2 mg/L PHA 、50 μmol/L 2-巰基乙醇、2 mmol/L L-谷氨酰胺、1×105U/L青-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)刺激培養(yǎng)24 h后，300×g離心10 min，更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)體系為：10%胎牛血清、3×105U/L重組人IL-2、50 μmol/L 2-巰基乙醇、2 mmol/L L-谷氨酰胺、1×105U/L青-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)維持培養(yǎng)，2-3 d更換培養(yǎng)基，直至培養(yǎng)5-6 d，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5×106個/每份，200×g離心10 min，棄上清備用。

5.2實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)根據(jù)轉(zhuǎn)染TCRVβ13-IRES-TCRVα23重組質(zhì)粒組(A組)；轉(zhuǎn)染空載體組(B組)；空轉(zhuǎn)染組(C組)，共分為3組。

5.3轉(zhuǎn)染 (1)轉(zhuǎn)染前將2.25 mL NucleofectorTMsolution和0.5 mL supplement(human T-cell NucleofectorTMkit)配制成混懸液，4 ℃保存?zhèn)溆茫?2)將配制的Nucleofector混懸液預(yù)熱至室溫，用100 μL混懸液懸浮沉淀細(xì)胞，加入Nucleofector混懸液的細(xì)胞至Nucleofector核轉(zhuǎn)儀的時(shí)間不應(yīng)超過15 min，否則影響轉(zhuǎn)染效率；(3)準(zhǔn)備2 μg/份質(zhì)粒DNA標(biāo)本，調(diào)整質(zhì)粒DNA的濃度使加入混懸液的體積不超過5 μL；(4)將2 μg質(zhì)粒DNA加入至100 μL核轉(zhuǎn)細(xì)胞懸液中，用微型tip輕輕混勻后，加入核轉(zhuǎn)杯底部，避免產(chǎn)生氣泡，蓋藍(lán)色核轉(zhuǎn)杯蓋子；(5)選擇T-020程序轉(zhuǎn)染人類T淋巴細(xì)胞，將核轉(zhuǎn)杯放入杯槽，按“x”鍵開始轉(zhuǎn)染程序；(6)核轉(zhuǎn)染結(jié)束后立刻將核轉(zhuǎn)杯從杯槽中取出，向核轉(zhuǎn)杯中加入500 μL預(yù)熱至室溫的RPMI-1640培養(yǎng)基，吸出杯中的液體至含3 mL的完全培養(yǎng)基中于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)孵育培養(yǎng)8 h后更換培養(yǎng)基，加入含3×105U/L重組人IL-2的完全培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育培養(yǎng)。

6抗原特異TCRαβ雙基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞株后外源TCR基因表達(dá)的鑒定

6.1間接免疫熒光法檢測外源基因的表達(dá) 轉(zhuǎn)染48 h后，收集1×106個細(xì)胞，用0.1 mol/L PBS洗滌細(xì)胞2次后，直接用小鼠抗人FITC-Vβ13單抗(Beckman Coulter)標(biāo)記，37 ℃孵育1 h后，PBS洗滌細(xì)胞2次，應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞綠色熒光產(chǎn)生情況。

6.2RT-PCR和實(shí)時(shí)定量PCR檢測轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的正常人T細(xì)胞中TCRVα23和TCRVβ13基因mRNA水平的表達(dá) 轉(zhuǎn)染3 d后，收集2×106個細(xì)胞提取總RNA，合成cDNA，用相應(yīng)的TCRVα23和TCRVβ13亞家族的帶有酶切位點(diǎn)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，轉(zhuǎn)染空載體組作為陰性對照，PCR擴(kuò)增體系、擴(kuò)增條件以及電泳條件同前所述。應(yīng)用Real Master Mix試劑盒(北京Tiangen)，利用SYBR green I染料檢測相應(yīng)的TCRVα23和TCRVβ13基因的表達(dá)情況，并用同比例稀釋的RNA作為內(nèi)對照?？偡磻?yīng)體積為25 μL，包括2.5×real master mix 11.25 μL、0.25 mmol/L TCRVα/Vβ亞家族引物以及1 μL模板；PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min預(yù)變性后，45個循環(huán)(95 ℃ 15 s，62 ℃ 1 min)，并在83 ℃和87 ℃ 2次讀板。反應(yīng)在MJ Research熒光定量PCR儀(Bio-Rad)中進(jìn)行。

6.3Western blotting檢測轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的正常人T細(xì)胞中TCRVβ13蛋白的表達(dá) 轉(zhuǎn)染3 d后，收集2×106個轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細(xì)胞，用RIPA蛋白提取試劑盒提取總蛋白，同樣提取臍血細(xì)胞(TCRVβ13亞家族表達(dá)陽性)的蛋白作為陽性對照，轉(zhuǎn)染pIRES空載體細(xì)胞的蛋白作為陰性對照檢測TCRVβ13蛋白的表達(dá)。將轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的濃縮蛋白樣品、陽性對照和陰性對照分別加樣于10%SDS-PAGE膠進(jìn)行凝膠電泳。轉(zhuǎn)NC膜(Invitrogen)后，用小鼠抗人β-actin單抗和HRP-羊抗小鼠IgG抗體(均為武漢博士德產(chǎn)品)進(jìn)行雜交孵育，DAB底物顯色(北京Tiangen)檢測人β-actin蛋白(內(nèi)參照)的表達(dá)，以了解所提取蛋白質(zhì)量；同時(shí)將另1個平行反應(yīng)的NC膜依次加入1∶500的小鼠抗人TCRVβ13單抗(Beckman Coulter)和1∶500的羊抗小鼠IgG抗體(武漢博士德)進(jìn)行雜交孵育，DAB顯色檢測目的蛋白TCRVβ13蛋白的表達(dá)情況。

7細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

7.1Toledo細(xì)胞株、Raji細(xì)胞株、Molt-4細(xì)胞株的體外培養(yǎng) Toledo細(xì)胞株作為殺傷性實(shí)驗(yàn)的靶細(xì)胞，培養(yǎng)體系含10%胎牛血清、1×105U/L青-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)；Raji和Molt-4細(xì)胞株和正常人PBMCs作為殺傷性實(shí)驗(yàn)的非特異對照，以檢測重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的T細(xì)胞的細(xì)胞毒活性及其特異性。

7.2LDH釋放實(shí)驗(yàn) 以乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)檢測試劑盒(Roche)在轉(zhuǎn)染3 d后檢測轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的正常人T細(xì)胞的特異性細(xì)胞毒活性，操作按說明進(jìn)行。分別以轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的正常人CD3+T細(xì)胞、轉(zhuǎn)染空載體的正常人CD3+T細(xì)胞及無DNA轉(zhuǎn)染的空轉(zhuǎn)染組為效應(yīng)細(xì)胞，以Toledo細(xì)胞、Raji細(xì)胞、Molt-4細(xì)胞和正常人PBMCs為靶細(xì)胞，后3種細(xì)胞均為陰性對照。效/靶比為10∶1，靶細(xì)胞濃度5×103cells/well，每組設(shè)3個復(fù)孔；置U型96孔培養(yǎng)板內(nèi)，2 500 r/min 離心30 s，以促進(jìn)效/靶細(xì)胞之間接觸，于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育10 h；1 000 r/min離心5 min，吸取上清100 μL加入平底酶標(biāo)板中，加入100 μL LDH底物反應(yīng)液，室溫下避光作用30 min，每孔加50 μL終止液終止酶促反應(yīng)，輕輕振蕩10 s；Elx-800酶標(biāo)儀測定吸光度(absorbance，A)值，測定波長490 nm，參考波長670 nm。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

7.3CTL細(xì)胞毒活性計(jì)算公式 CTL活性(%)=(實(shí)驗(yàn)組A值-效應(yīng)細(xì)胞自然釋放組A值-靶細(xì)胞自然釋放組A值)/(最大釋放組A值-靶細(xì)胞自然釋放組A值)。

8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用兩樣本比較的秩和檢驗(yàn)(Mann-Whitney Test)。

結(jié) 果

1DLBCL相關(guān)抗原特異性TCR基因全長克隆和雙基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建

對DLBCL患者的外周血單個核細(xì)胞進(jìn)行TCRVβ和Vα亞家族譜系分析和基因掃描分析結(jié)果顯示TCRVβ13和TCRVα23亞家族出現(xiàn)寡克隆增殖，PCR產(chǎn)物測序結(jié)果通過NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的Blast比對無誤后，擴(kuò)增出TCRVβ13和TCRVα23亞家族全長的基因片段，然后連接入pGEM-T Easy克隆載體，測序鑒定為正確的序列后，將其相應(yīng)的基因序列分別轉(zhuǎn)入真核表達(dá)載體pIRES的MCS A和MCS B位點(diǎn)，宿主菌中擴(kuò)增后提取質(zhì)粒，得到TCRVβ13-IRES-TCRVα23雙基因真核表達(dá)質(zhì)粒，見圖1。

Figure 1. The structural pattern of the recombinant plasmid TCR Vβ13-IRES-TCR Vα23.

2TCRVβ13-IRES-TCRVα23雙基因真核表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

應(yīng)用EcoRⅠ和MluⅠ雙酶切TCRVβ13-IRES-TCRVα23真核雙表達(dá)質(zhì)粒，得到長約1 022 bp和6 960 bp的2條片段；而應(yīng)用SalⅠ和NotⅠ雙酶切，則得到長約879 bp和約7 108 bp的2條片段。用pIRES載體上的T7/IRES-R引物、IRES-F/T3引物分別對重組質(zhì)粒的插入位點(diǎn)A片段和插入位點(diǎn)B片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果亦顯示了相應(yīng)大小的片段(含Vα片段：997 bp；含Vβ片段：1 152 bp),見圖 2。

對TCRVβ13-IRES-TCRVα23雙基因真核表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行測序分析，結(jié)果證實(shí)轉(zhuǎn)入的TCRVα和TCRVβ基因序列與DLBCL患者外周血中存在的克隆性增殖T細(xì)胞的TCRVα和TCRVβ基因的全長基因序列相一致，部分測序結(jié)果見圖3。并且能翻譯出相應(yīng)的氨基酸TCRVβ13和TCRVα23基因的CDR3區(qū)分別為“SRGISSTDTQY”和“VRVTGSRLT”。

Figure 2. Identification of recombinant plasmid TCR Vβ13-IRES-TCR Vα23 by electrophoreisis. 1: 15 kb DNA Marker; Lane 2, 3: TCR Vβ13(1 016 bp) and TCR Vα23(872 bp) PCR products amplified by regular primers; Lane 4, 5: TCR Vβ13(1 152 bp) and TCR Vα23(997 bp) PCR products amplified by primers in vector; Lane 6: TCR Vβ13-IRES-TCR Vα23 recombinant plasmid digested by EcoR Ⅰand MluⅠ; Lane 7: TCR Vβ13-IRES-TCR Vα23 recombinant plasmid digested by Sal Ⅰand Not Ⅰ; Lane 8: TCR Vβ13-IRES-TCR Vα23 recombinant plasmid; Lane 9: negative control of PCR products.

Figure 3. CDR3 sequences of both TCR Vβ13 and TCR Vα23 genes from TCR Vβ13-IRES-TCR Vα23. 1: the A site of TCR Vβ13-IRES-TCR Vα23 recombinant plasmid(TCR Vβ13); 2: the B site of TCR Vβ13-IRES-TCR Vα23 recombinant plasmid(TCR Vα23).

3間接免疫熒光法檢測重組質(zhì)粒的表達(dá)

通過Nucleofactor核轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染3 d后，用熒光顯微鏡檢測特異性TCRVβ13單抗標(biāo)記轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的正常人CD3+T細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的正常人CD3+T細(xì)胞出現(xiàn)綠色熒光，陽性率可達(dá)30%，而轉(zhuǎn)染空載體的陰性對照組細(xì)胞未見明顯熒光或熒光弱且很快淬滅,見圖4。

Figure 4. Antigen-specific TCR gene-transduced CD3+T cells were stained with a TCR Vβ13 monoclonal antibody(McAb)(LSM, ×630). A: CD3+T cells were transduced with TCR Vβ13-IRES-TCR Vα23 recombinant plasmid and were stained by FITC-TCR Vβ13 monoclonal antibody(McAb); B: CD3+T cells were transferred with empty vector served as a negative control for exogenous TCR Vβ13 expression.

4TCRαβ雙基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的正常人CD3+T細(xì)胞中mRNA水平的表達(dá)

轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒3 d后，通過real-time PCR對轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的正常人CD3+T細(xì)胞進(jìn)行外源TCRVα和TCRVβ基因mRNA水平表達(dá)的檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)以cDNA為模板的轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的正常人CD3+T細(xì)胞中外源的TCRVα和TCRVβ基因擴(kuò)增的Ct值較同比稀釋的RNA為模板擴(kuò)增的Ct值提前2-3個，表明轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細(xì)胞中外源TCR基因在mRNA水平得到了穩(wěn)定的表達(dá)；并且同一個重組質(zhì)粒的2個外源基因mRNA的表達(dá)水平基本上相一致(Ct值大約為14左右),見圖5。

Figure 5. Detection of mRNA expression of TCR Vβ13 and TCR Vα23 genes of healthy individual CD3+T cells which transfected with recombinant plasmids by real-time PCR. A: using cDNA template of healthy individual CD3+T cells transfected with recombinant plasmid；B: using RNA template of healthy individual CD3+T cells transfected with recombinant plasmid；C: using cDNA template of healthy individual CD3+T cells transfected with empty vector.

5Westernblotting檢測轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的正常人CD3+T細(xì)胞中TCRVβ13蛋白的表達(dá)

將轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒3 d后的正常人CD3+T細(xì)胞、陽性對照(表達(dá)Vβ13的臍血細(xì)胞)和陰性對照(轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞)的蛋白樣品分2組進(jìn)行SDS-PAGE電泳：第1組用小鼠抗人β-actin單抗和HRP-羊抗小鼠IgG抗體分別雜交；第2組用小鼠抗人TCRVβ13單抗和HRP-羊抗小鼠IgG抗體分別雜交，然后再與特異底物反應(yīng)產(chǎn)生熒光產(chǎn)物，經(jīng)DAB顯色后均得到特異的雜交帶。第1組雜交帶的蛋白質(zhì)分子量與人β-actin蛋白的分子量大小相一致，表明所提取的蛋白質(zhì)質(zhì)量良好；第2組雜交帶的蛋白質(zhì)分子量與轉(zhuǎn)入的TCRVβ13蛋白的理論分子量(約34 kD)一致，見圖6，說明轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的正常人CD3+T細(xì)胞可以穩(wěn)定表達(dá)TCRVβ13蛋白。

6轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒T細(xì)胞的特異性殺傷實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒3 d后，TCRVβ13-Vα23雙基因修飾的CD3+T細(xì)胞對Toledo細(xì)胞株的細(xì)胞毒殺傷活性明顯高于TCR未轉(zhuǎn)染組T細(xì)胞(P<0.05)，殺傷效力為(13.75±0.69)%。同時(shí)，以Raji細(xì)胞、Molt-4細(xì)胞和正常人PBMCs作為靶細(xì)胞的非特異

Figure 6. TCR Vβ13 protein expression was detected in TCR gene-transfected CD3+T cells by Western blotting.1: CD3+T cells transfected with TCR Vβ13-IRES-TCR Vα23 recombinant plasmid; 2: mononuclear cells from the cord blood expressing TCR Vβ13 protein served as positive control; 3: CD3+T cells transfected with empty vector served as negative control.

對照，用于檢測TCR基因轉(zhuǎn)染的正常人CD3+T細(xì)胞對Toledo細(xì)胞株的特異性細(xì)胞毒活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其對Toledo細(xì)胞株的殺傷活性均明顯高于Raji細(xì)胞和Molt-4細(xì)胞(均P<0.05),見圖7，而對正常人PBMCs的細(xì)胞毒活性按公式計(jì)算為零或負(fù)值，故認(rèn)為其對正常人PBMCs無明顯殺傷性。

Figure 7. Specific cytotoxicity of TCR gene-transduced CD3+T cells directed against Toledo cells were detected using the LDH release assay.

討 論

T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答在機(jī)體抗腫瘤免疫過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[5]，尤其在清除腫瘤微小殘留病變方面。眾多研究均提示腫瘤患者體內(nèi)存在殺傷腫瘤細(xì)胞的特異性效應(yīng)T細(xì)胞。在B-NHL患者體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)腫瘤侵潤T淋巴細(xì)胞(TILs)以及克隆性增殖的T細(xì)胞[6,7]。然而，分離純化及擴(kuò)增腫瘤患者體內(nèi)的這些特異性效應(yīng)T細(xì)胞非常困難從而限制其臨床的廣泛應(yīng)用。由于CTL的特異性是由其TCR基因決定的，抗原特異的TCR基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)就是CTL特異性的轉(zhuǎn)移。因此，通過TCR轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量的抗原特異性效應(yīng)細(xì)胞而用于腫瘤患者進(jìn)行過繼性免疫治療，被認(rèn)為是一種新的有希望的過繼性細(xì)胞免疫治療策略。盡管該研究技術(shù)已經(jīng)在多個中心廣泛開展[8,9]，而關(guān)于DLBCL相關(guān)抗原特異TCR基因的研究目前還沒有相關(guān)的報(bào)導(dǎo)。本研究所探討的是通過TCR轉(zhuǎn)基因技術(shù)而產(chǎn)生的一種可能有效治療DLBCL患者的T細(xì)胞克隆，期望為DLBCL患者探索性尋找一種新的治療手段。

進(jìn)行TCR基因轉(zhuǎn)導(dǎo)從而獲得大量用于治療的抗原特異TCR基因修飾T細(xì)胞的關(guān)鍵是獲得抗原特異的TCR基因，這也是眾多研究者關(guān)注的焦點(diǎn)。我們前期的研究工作發(fā)現(xiàn)DLBCL患者的外周血中存在克隆性增殖T細(xì)胞，并擴(kuò)增出呈單克隆增殖趨勢的TCRVα23和TCRVβ13亞家族T細(xì)胞的全長TCR基因序列(TCRVα23的GenBank accession：EU862326；TCRVβ13的GenBank accession：EU EU885174)，從而用于構(gòu)建TCR基因真核表達(dá)載體。為了解TCR α和TCR β鏈基因在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中的充分表達(dá)情況，我們前期的研究將TCRVα或TCRVβ基因分別連接入帶有增強(qiáng)綠色熒光蛋白基因的真核表達(dá)載體，構(gòu)建TCR α或β的單鏈基因重組質(zhì)粒，并在體外實(shí)現(xiàn)了共表達(dá)[1]。然而，臨床研究表明，對于TCR α β基因修飾T細(xì)胞的臨床應(yīng)用需要采用1個載體編碼TCR α和β兩條鏈而不是采用2個載體。在共表達(dá)載體的構(gòu)建中，利用IRES構(gòu)建多或雙順反子表達(dá)載體是較為被肯定的一種方法[10]。然而，文獻(xiàn)報(bào)道克隆到IRES下游位點(diǎn)基因的表達(dá)水平要明顯低于上游位點(diǎn)基因的表達(dá)水平[11]。還有研究發(fā)現(xiàn)TCR α β異源二聚體與特異性抗原肽特異性識別和結(jié)合的過程中，TCR β鏈可能發(fā)揮更為關(guān)鍵性的作用[12]。為此，本研究將TCR α和β鏈基因分別連接入IRES的3’端和5’端位點(diǎn)，從而構(gòu)建了攜帶TCR α和β鏈的TCRVβ13-IRES-TCRVα23雙基因重組質(zhì)粒。進(jìn)一步分別經(jīng)過PCR擴(kuò)增、雙酶切和序列分析進(jìn)行鑒定證實(shí)其構(gòu)建正確無誤。

通過TCR基因轉(zhuǎn)導(dǎo)賦予T細(xì)胞具有新的特異性的前提條件是一個能達(dá)到穩(wěn)定高水平的轉(zhuǎn)基因表達(dá)和高效的轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)。雖然目前TCR基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的載體主要還是病毒載體，但一直以來都在嘗試尋找更理想的理化轉(zhuǎn)導(dǎo)方式。本研究采用一種新的非病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)方式-NucleofactorTM技術(shù)，將TCR α β雙基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染正常人T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h的轉(zhuǎn)染效率大約為30%左右。并在mRNA和蛋白質(zhì)水平分別檢測到外源TCRVα23和TCRVβ13基因的穩(wěn)定表達(dá)。進(jìn)一步我們又通過LDH釋放法檢測TCR基因修飾T細(xì)胞的體外特異性細(xì)胞毒活性，發(fā)現(xiàn)其對DLBCL細(xì)胞株具有特異性殺傷活性，但是表現(xiàn)出較弱的殺傷效力，究其原因可能與以下幾點(diǎn)有關(guān)，首先，有研究者發(fā)現(xiàn)通過2A多肽連接子連接TCR α和β鏈基因可以提高2個外源基因的表達(dá)及轉(zhuǎn)基因修飾T細(xì)胞的功能活性[13]。而本研究采用IRES連接2個TCR鏈基因，如果通過一個P2A連接子連接或許可以使外源基因的表達(dá)水平進(jìn)一步提高；其次，最理想的特異性細(xì)胞毒效應(yīng)應(yīng)該是所制作的TCR基因修飾T細(xì)胞對自身腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷效應(yīng)，而本研究所進(jìn)行的是DLBCL相關(guān)抗原特異TCR基因修飾正常T細(xì)胞后細(xì)胞毒活性的檢測，可能存在MHC的限制性問題；而最主要的一個原因可能是因?yàn)槟[瘤細(xì)胞表達(dá)多種腫瘤特異或相關(guān)抗原，可以誘導(dǎo)多個T細(xì)胞克隆的增殖，而本實(shí)驗(yàn)過程僅僅選擇其中的一種特異TCR進(jìn)行基因修飾，可能其發(fā)揮作用不能達(dá)到最佳效果。因此，在后續(xù)研究中，我們還要繼續(xù)優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件以提高轉(zhuǎn)染效率，盡可能消除MHC的限制性以提高轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的功能活性，同時(shí)還有可能增加多個特異TCR基因修飾T細(xì)胞的聯(lián)合作用，期望可以提高殺傷腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng)。

總之，本研究成功構(gòu)建了DLBCL相關(guān)抗原特異性TCRVβ13-IRES-TCRVα23雙基因重組質(zhì)粒；進(jìn)一步將其轉(zhuǎn)基因修飾正常人T細(xì)胞，初步證實(shí)其對DLBCL細(xì)胞株具有特異性殺傷活性。為進(jìn)一步TCR基因修飾T細(xì)胞用于腫瘤患者進(jìn)行過繼性免疫治療提供基礎(chǔ)資料。

[1] 尹青松, 李揚(yáng)秋, 陳少華, 等. 抗原特異TCR Vα6-pIRES2-EGFP和TCRVβ13- pIRES2-EGFP真核表達(dá)載體的構(gòu)建及共轉(zhuǎn)染研究[J]. 免疫學(xué)雜志, 2009, 25(1): 1-5、11.

[2] 李揚(yáng)秋 主編. 血液腫瘤免疫治療學(xué)[M]. 第1版. 北京：人民衛(wèi)生出版社, 2005.361-371.

[3] 李 闖, 吳秀麗, 李揚(yáng)秋, 等. 獨(dú)特型TCR Vα1-pIRES-TCR Vβ8表達(dá)載體構(gòu)建及體外表達(dá)研究[J]. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志, 2008, 24(1): 30-33.

[4] Yin Q, Tan H, Chen S, et al. Charaterization of conserved CDR3 sequence of TCR α- and β-chain genes in peripheral blood T-cells from patients with diffuse large B-cell lymphoma[J]. Hematology, 2010, 15(1): 48-57.

[5] 羅羽宏，梁忠平，李接興，等.肝癌術(shù)后早期應(yīng)用胸腺肽α1對T淋巴細(xì)胞亞群的影響[J].中國病理生理雜志，

2009，25(6)：1117-1121.

[6] Schultze JL, Seamon MJ, Michalak S, et al. Autologous tumor infiltrating T cells cytotoxic for follicular lymphoma cells can be expandedinvitro[J]. Blood, 1997, 89(10): 3806-3816.

[7] Stopeck AT, Gessner A, Miller TP, et al. Loss of B7.2(CD86) and intracellular adhesion molecule 1(CD54) expression is associated with decreased tumor-infiltrating T lymphocytes in diffuse B-cell large-cell lymphoma[J]. Clin Cancer Res, 2000, 6(10): 3904-3909.

[8] Morgan RA, Dudley ME, Wunderlich JR, et al. Cancer regression in patients after transfer of genetically engineered lymphocytes[J]. Science, 2006, 314(5796): 126-129.

[9] Xue SA, Gao L, Thomas S, et al. Development of a Wilms’ tumor antigen-specific T-cell receptor for clinical trials: engineered patient’s T cells can eliminate autologous leukemia blasts in NOD/SCID mice[J]. Haematologica, 2010, 95(1):126-134.

[10]Kleiman SE, Pastan I, Puck JM, et al. Characterization of an MDR1 retroviral bicistronic vector for correction of X2 linked severe combined immunodeficiency[J]. Gene Ther, 1998, 5(5): 671-676.

[11]Mizuguchi H, Xu Z, Ishii-Watabe A, et al. IRES-dependent second gene expression is significantly lower than cap-dependent first gene expression in a bicistronic vector[J]. Mol Ther, 2000, 1(4): 376-382.

[12]Gargiulo L, Lastraioli S, Cerruti G, et al. Highly homologous T-cell receptor beta sequences support a common target for autoreactive T cells in most patients with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria[J]. Blood, 2007, 109(11): 5036-5042.

[13]Leisegang M, Engels B, Meyerhuber P, et al. Enhanced functionality of T cell receptor-redirected T cells is defined by the transgene cassette[J]. J Mol Med, 2008, 86(5): 573-583.

SpecificcytotoxicityofTCRVα23-Vβ13gene-modifiedT-cells

YIN Qing-song1,2, TAN Huo3, YANG Li-jian2, CHEN Shao-hua2, ZHA Xian-feng2, YE Jing-mei3, LI Yang-qiu2,4

(1HenanCancerHospital,Zhengzhou450008,China;2InstituteofHematology,SchoolofMedicine,4KeyLaboratoryforRegenerativeMedicineofMinistryofEducation,JinanUniversity,Guangzhou510632,China;3CentreofOncologyandHematology,FirstAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalCollege,Guangzhou510260,China.E-mail:jnyangqiuli@163.com)

AIM: To analyze the cytotoxicity of TCRVα23-Vβ13 gene-modified T-cells specific to diffuse large B-cell lymphoma(DLBCL) associated antigensinvitro.METHODSThe identified full-length TCRVβ13 andVα23 genes of monoclonally expanded T-cells in the peripheral blood from a DLBCL patient were amplified and cloned. The bicistronic recombinant plasmid TCRVβ13-IRES-TCRVα23 was constructed and transfected into T-cells isolated from a healthy individual by NucleofectorTMtechnology. The mRNA expression of antigen-specific TCRVα23 andVβ13 genes and the corresponding proteins were determined by real-time PCR and Western blotting, respectively. The specific cytotoxicity of TCR gene-transferred T-cellsinvitrowas detected.RESULTSThe recombinant plasmid was constructed successfully and verified by restriction enzyme digestion and nucleotide sequencing. The co-expression of antigen-specific TCRVα23 andVβ13 genes at mRNA and protein levels in the transfected healthy T-cells were observedinvitro. Three days after transfection, the cytotoxicity of TCR gene-transduced CD3+T-cells against Toledo cells was significantly higher than that against Raji cells or Molt-4 cells. The DLBCL-specific cytotoxic T-lymphocytes(CTL) were inducted.CONCLUSIONThe bicistronic eukaryotic expression plasmid TCRVβ13-IRES-TCRVα23 specific to DLBCL-associated antigens is constructed successfully. The TCR gene-transferred T-cells display the ability of DLBCL-specific cytotoxicity.

Diffuse large B-cell lymphoma; TCR gene transfer; Cytotoxicity

R392.11； R733.4

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.02-010

1000-4718(2011)02-0260-08

2010-07-14

2010-11-10

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目(No.2006AA02Z114)；廣東自然科學(xué)基金重點(diǎn)資助項(xiàng)目(No.05103293；No.9251063201000001)

△通訊作者 Tel: 020-85226877; E-mail: jnyangqiuli@163.com