周曉慧, 牛成偉, 曹 凱, 徐 倩

(承德醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室， 河北 承德 067000)

丹皮酚通過抑制NF-κB信號通路下調(diào)高脂血清誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞黏附分子的表達*

周曉慧△, 牛成偉, 曹 凱, 徐 倩

(承德醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室， 河北 承德 067000)

目的觀察丹皮酚對高脂損傷人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)核因子-κB(NF-κB)的活化及細胞黏附分子表達的影響，探討丹皮酚抗動脈粥樣硬化的分子機制。方法以培養(yǎng)HUVECs作為靶細胞，用高脂血清制備損傷模型。采用MTT法檢測細胞活性；RT-PCR法檢測NF-κB p65 mRNA的表達；Western blotting法檢測κB 抑制蛋白α(IκB-α)、細胞間黏附分子-1(ICAM-1)和E-選擇素的蛋白表達。結(jié)果丹皮酚能使高脂損傷的HUVECs存活率增加，形態(tài)趨于正常；降低NF-κB p65 mRNA的表達，提高IκB-α的表達；下調(diào)ICAM-1和E-選擇素的蛋白表達。結(jié)論丹皮酚通過抑制血管內(nèi)皮細胞NF-κB/IκB通路，下調(diào)ICAM-1和E-選擇素的表達，減少炎癥反應(yīng)，這可能是丹皮酚抗動脈粥樣硬化的機制之一。

丹皮酚; 高脂血清; 臍靜脈內(nèi)皮細胞; NF-κB; 胞間黏附分子1； E-選擇素

動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)是慢性血管炎癥損傷性疾病，高脂血癥是導(dǎo)致動脈粥樣硬化的獨立因素。由血管細胞間黏附分子(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)、E-選擇素等介導(dǎo)的單核/巨噬細胞的黏附被認(rèn)為是血管損傷后炎癥反應(yīng)的首要環(huán)節(jié)[1]。有研究證明[2]，高脂可通過激活NF-κB，誘導(dǎo)ICAM-1與E-選擇素的表達，從而在AS的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。丹皮酚(paeonol, Pae) 又稱牡丹酚，是毛茛科植物牡丹根皮和蘿藦科植物徐長卿干燥根或全草的主要有效成分。研究表明，Pae具有抗炎、抗氧化、抗血栓、抗AS、抗腫瘤等廣泛的藥理作用[3]。 本研究采用高脂血清損傷人臍靜脈內(nèi)皮細胞模型，旨在觀察丹皮酚是否可以阻斷NF-κB/IκB通路，抑制ICAM-1、E-選擇素等的表達，為丹皮酚抗AS的研究提供實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

1材料

1.1藥物與試劑 丹皮酚購自寧波天真制藥有限公司，規(guī)格10 mg/2mL；DMEM培養(yǎng)基購自Gibco；胎牛血清(FCS)購自Clack；胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)購自Sigma；膽固醇購自北京雙旋微生物培養(yǎng)制品廠；Trizol購自Invitrogen；TaKaRa RNA PCR kit(AMV) Ver.3.0試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；NF-κB p65和β-actin 引物購自上海生物工程有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海申能博彩生物科技有限公司；ICAM-1、IκB-α兔抗人多克隆抗體、E-selectin山羊抗人多克隆抗體和β-actin小鼠抗人單克隆抗體購自Santa Cruz；Ⅱ抗山羊抗兔、兔抗山羊IgG/辣根酶標(biāo)記購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；甘油三酯、膽固醇和低密度脂蛋白試劑盒購自南京建成生物工程研究所；其它試劑均為市售的分析純。

1.2主要儀器 CO2培養(yǎng)箱，Heraeus； 倒置顯微鏡，Leica；凈化工作臺，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；酶標(biāo)儀，MK-3；紫外可見分光光度計(DU800)，三洋公司 ；梯度PCR擴增儀，ABI公司； 電泳凝膠成像分析系統(tǒng)(ChemiDoc XRS),Bio-Rad；全自動生化分析儀AU640，Olympus。

2方法

2.1人臍靜脈內(nèi)皮細胞的培養(yǎng) 無菌條件下取承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院產(chǎn)科健康剖腹產(chǎn)新生兒臍帶15-25 cm，于緩沖液中浸泡，用0.1%Ⅰ型膠原酶與0.25%胰蛋白酶(V/V=1∶1)的混合消化酶灌注法分離人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含20%的胎牛血清的DMEM,并添加20 μg·L-1bFGF，隔天換液,待HUVECs生長至80%以上融合時，采用0.125%胰蛋白酶、0.01% EDTA消化傳代，按1.0×108cells·L-1密度接種。原代及傳代細胞呈典型的鋪路石樣形態(tài)。實驗所用細胞為第2-3代。

2.2高脂血清的制備 選用健康家兔(承德醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供)10只，體重(2.0±0.5)kg，每天給予高脂飼料(1%膽固醇，5%蛋黃粉，10%煉制豬油，84%基礎(chǔ)飼料)100 g/只，自由飲水。10周末，無菌條件下心臟取血，分離血清，其中1 mL用全自動生化分析儀AU640測得甘油三酯(5.01±2.15)mmol·L-1,膽固醇(33.50±6.87)mmol·L-1，低密度脂蛋白(11.32±5.32) mmol·L-1。將所有的高脂血清56 ℃，30 min滅活，微孔濾膜(0.22 μm) 過濾分裝，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3實驗分組 將處于對數(shù)生長期的人臍靜脈內(nèi)皮細胞分為5組： 正常對照組：加含20 μg·L-1bFGF、20%正常兔血清的DMEM；高脂血清模型組：加含20 μg·L-1bFGF、20%兔高脂血清的DMEM；Pae低劑量組：加含20μg·L-1bFGF、20%兔高脂血清和25 mg·L-1Pae的DMEM；Pae中劑量組：加含20 μg·L-1bFGF、20%兔高脂血清和50 mg·L-1Pae的DMEM；Pae高劑量組：加含20 μg·L-1bFGF、20%兔高脂血清和100 mg·L-1Pae的DMEM。各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h，倒置相差顯微鏡下觀察各組細胞形態(tài)變化。

2.4MTT法檢測細胞活力 將生長良好的第2代HUVECs細胞用0.25%胰蛋白酶、0.01%EDTA消化、重懸，以1.0×108cells·L-1密度接種于96孔板中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至細胞達到80%融合時，按上述實驗分組處理，培養(yǎng)24 h后，每孔加入5 g·L-1MTT溶液20 μL，37 ℃、5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)100 μL，振蕩10 min，使結(jié)晶物完全溶解，選擇490 nm波長，酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度(A)值。

2.5RT-PCR檢測NF-κB p65 mRNA的表達 利用Trizol試劑從各組HUVECs中提取細胞總RNA，紫外分光光度計測定A260/A280為1.8-2.2，應(yīng)用RT-PCR法(試劑盒購于大連寶生物工程有限公司)檢測NF-κB p65 mRNA的表達，逆轉(zhuǎn)錄，cDNA為PCR反應(yīng)模板，β-actin為內(nèi)參照。NF-κB p65的引物序列：上游5’-GCACTTACGGATTCTGGTGG-3’， 下游5’-CTCAAACGCTGGTGTTAGGC-3’，擴增片段 426 bp。β-actin引物序列：上游 5’-AGCGGGAAATCGTGCGTGAC-3’，下游5’-ACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3’，擴增片段453 bp。反應(yīng)條件：94 ℃ 預(yù)變性2 min, 94 ℃變性30 s,57 ℃(NF-κB p65)或58 ℃(β-actin)退火50 s，72 ℃延伸1 min,共計30個循環(huán)，末次循環(huán)后，72℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物5 μL于2%瓊脂糖凝膠上電泳，并在凝膠成像分析儀中掃描記錄圖片作半定量分析，以各組HUVECs中NF-κB p65/β-actin掃描灰度值計算各組細胞NF-κB p65 mRNA的相對表達量。

2.6Western blotting檢測IκB-α、ICAM-1和 E-選擇素的蛋白表達 收集各組細胞，用PBS洗滌3次，加入含有PMSF的細胞裂解液，冰上作用20 min, 4 ℃、12 000 r·min-1離心20 min,取上清，采用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。 以30 μg總蛋白上樣，進行SDS-PAGE電泳，PVDF膜進行轉(zhuǎn)印，5%脫脂奶粉封閉后，用IκB-α(1∶200)、ICAM-1(1∶200)、E-選擇素(1∶200)Ⅰ抗4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，每次10 min，再用Ⅱ抗(1∶5 000)室溫孵育1 h, ECL顯色劑顯色，X射線膠片顯影、定影，蛋白條帶用Quantity One凝膠分析軟件進行半定量分析。以IκB-α、ICAM-1和E選擇素蛋白條帶的積分吸光度值/β- actin蛋白條帶的積分吸光度值表示IκB-α蛋白、ICAM-1和E選擇素蛋白的相對蛋白含量。

3統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1MTT法檢測各組HUVECs細胞活力

高脂血清模型組的A值明顯低于正常對照組(P<0.01)。Pae低、中、高劑量組的A值顯著高于高脂模型組(P<0.01)，見表1。

表1 Pae對高脂血清損傷內(nèi)皮細胞細胞活力的影響

2倒置顯微鏡觀察下細胞形態(tài)變化

高脂模型組的細胞出現(xiàn)片狀分離，脫落現(xiàn)象，損傷作用明顯。Pae干預(yù)組使細胞間隙變窄，形態(tài)趨于正常，見圖1。

Figure 1. Morphology of HUVECs in each group (×40).A:normol control group; B:hyperlipidemic serum-treated group; C: hyperlipidemic serum+ Pae-treated group. Compared with normal control group, most cells in hyperlipidemic serum-treated group shaped like a lobe and came off.Enlarged space narrowed down among the cells and the morphology was tending to normal after intervention with Pae.

3RT-PCR檢測各組HUVECsNF-κBp65mRNA的表達

高脂模型組NF-κB p65 mRNA的表達明顯高于正常對照組(P<0.01)。Pae低、中、高劑量組的NF-κB p65 mRNA的表達明顯低于高脂模型組(P<0.01)，見表2、圖2。

表2 丹皮酚對高脂血清損傷內(nèi)皮細胞NF-κB p65 mRNA表達的影響

Figure 2. NF-κB p65 mRNA expression in HUVECs detected by RT-PCR. Lane 1: normal group; Lane 2: hyperlipidemic serum group；Lane 3: hyperlipidemic serum+Pae at low dose；Lane 4: hyperlipidemic serum+Pae at middle dose；Lane 5: hyperlipidemic serum+Pae at high dose.

4Westernblotting檢測各組HUVECsIκB-α、ICAM-1和E-選擇素的蛋白表達

高脂血清模型組IκB-α的表達明顯低于正常對照組(P<0.01)， Pae低、中、高劑量組IκB-α的蛋白表達顯著高于高脂血清模型組(P<0.01),見表3、圖3; 高脂血清模型組ICAM-1和E-選擇素蛋白表達明顯高于正常對照組(P<0.01)，Pae低、中、高劑量組ICAM-1和E-選擇素的蛋白表達顯著低于高脂模型組(P<0.01),并且顯示一定的劑量依賴性。見表3、圖4、5。

表3 丹皮酚對高脂血清損傷內(nèi)皮細胞IκB-α,、ICAM-1和E-selectin蛋白表達的影響

Figure 3. IκB-α protein expression in HUVECs detected by Western bloting. Lane 1: normal group; Lane 2: hyperlipidemic serum group；Lane 3: hyperlipidemic serum+Pae at low dose；Lane 4: hyperlipidemic serum+Pae at middle dose；Lane 5: hyperlipidemic serum+Pae at high dose.

Figure 4. ICAM-1 protein expression in HUVECs detected by Western bloting. Lane 1: normal group; Lane 2: hyperlipidemic serum group；Lane 3: hyperlipidemic serum+Pae at low dose；Lane 4: hyperlipidemic serum+Pae at middle dose；Lane 5; hyperlipidemic serum+Pae at high dose.

Figure 5. E-selectin protein expression in HUVECs detected by Western bloting. Lane 1: normal group; Lane 2: hyperlipidemic serum group；Lane 3: hyperlipidemic serum+Pae at low dose；Lane 4: hyperlipidemic serum+Pae at middle dose；Lane 5: hyperlipidemic serum+Pae at high dose.

討 論

炎癥過程的最早變化之一為內(nèi)皮細胞表達黏附分子。人AS的斑塊中有ICAM-1的表達，并在AS的病理過程中起重要作用[4]。正常情況下，動脈內(nèi)皮細胞及平滑肌細胞不表達或微量表達ICAM-1黏附分子，但在各種炎癥信號刺激后表達急劇增加，ICAM-1與其配體結(jié)合，介導(dǎo)激活的內(nèi)皮細胞與循環(huán)中的白細胞相互黏附，黏附到血管內(nèi)皮的白細胞遷移到內(nèi)皮下, 遷移到內(nèi)皮下的單核細胞攝取氧化修飾的低密度脂蛋白(ox-LDL)變?yōu)榧せ畹木奘杉毎罱K成為充滿脂質(zhì)的泡沫細胞[5]；ICAM-1還介導(dǎo)淋巴細胞聚集在損害部位，共同促進AS的慢性炎癥過程；黏附到血管內(nèi)皮下的白細胞又可通過一系列機制促進內(nèi)皮細胞損傷，使ICAM-1表達進一步增強，進而吸附大量的白細胞，形成自我增殖的惡性循環(huán)，從而加重AS的發(fā)生發(fā)展[6]。ICAM-1在AS形成過程中，還能介導(dǎo)平滑肌細胞的分化與遷移。

E-選擇素(E-selectin)又稱為內(nèi)皮-白細胞黏附分子-1(endothelial leukocyte adhesion molecule-1，ELAM-1)，為一種I型跨膜糖蛋白，是黏附分子選擇素家族中的一個重要成員[7]。E-selectin主要介導(dǎo)白細胞與血管壁黏附的第一階段,即可逆性黏附階段，通過與其相應(yīng)配體結(jié)合介導(dǎo)白細胞(中性粒細胞、T、B淋巴細胞及單核細胞等)與血管壁(特別是毛細血管后靜脈)接觸產(chǎn)生微弱黏附，使白細胞在激活的內(nèi)皮細胞表面滾動，為進一步黏附創(chuàng)造條件[8]。正常情況下血管內(nèi)皮具有白細胞抵抗性，不表達或低表達E-selectin，只有在內(nèi)皮細胞受到炎癥因子刺激后才分泌表達E-selectin。

NF-κB是一種分布和作用均十分廣泛的細胞轉(zhuǎn)錄因子，控制著細胞因子、黏附分子及生長因子等基因表達[9,10]。正常情況下，NF-κB與IκB結(jié)合組成異源多聚體，以無活性的潛在狀態(tài)存在于胞漿中[11]，最經(jīng)典的NF-κB激活通路是通過絲氨酸或酪氨酸的磷酸化和蛋白酶介導(dǎo)的IκB蛋白降解[11,12]，在多種因素(如炎癥細胞因子TNF-α、IL-1β，血管活性物質(zhì)AngⅡ等)的誘導(dǎo)下，激活I(lǐng)κB激酶使IκB蛋白磷酸化并被蛋白酶降解，使IκB與NF-κB解離，活化的NF-κB從胞漿轉(zhuǎn)移至細胞核，與核內(nèi)DNA特定區(qū)域結(jié)合，激活靶基因(細胞因子、黏附分子、生長因子)，促進其轉(zhuǎn)錄，引起各種血管細胞間黏附分子(ICAM-1、VCAM-1、E-選擇素等)和趨化蛋白在損傷的血管內(nèi)皮中表達增加，導(dǎo)致炎癥分子的募集，引發(fā)AS的形成[13]。

本研究結(jié)果顯示，高脂血清損傷的HUVECs的細胞，細胞存活率明顯降低，光鏡下可見細胞間隙加寬，細胞收縮變圓，細胞邊界模糊，部分細胞脫落，而Pae干預(yù)后，高脂血清損傷的細胞存活率顯著提高，形態(tài)明顯改善。表明Pae對高脂血清損傷的內(nèi)皮細胞有直接保護作用。

如前所述，IκB的降解程度決定NF-κB的活化水平，所以IκB的含量與NF-κB活化水平成反比，本實驗通過檢測IκB的含量來反映NF-κB的活化情況，結(jié)果顯示，高脂損傷的HUVECs的細胞IκB的含量明顯低于正常對照組，NF-κB的表達明顯升高，Pae干預(yù)后，IκB的含量較高脂損傷組明顯升高，NF-κB的表達明顯降低，表明丹皮酚能夠降低高脂損傷的HUVECs細胞NF-κB的表達并抑制其活化。

進一步研究發(fā)現(xiàn)，高脂損傷的HUVECs細胞ICAM-1和E-選擇素的蛋白表達較正常對照組明顯增加，Pae干預(yù)后ICAM-1和E-選擇素的蛋白表達較高脂損傷組明顯降低，且顯示明顯的劑量依賴性。ICAM-1和E-選擇素為NF-κB下游基因的表達產(chǎn)物[14]，本研究結(jié)果顯示，在高脂損傷模型組和Pae干預(yù)組，NF-κB的表達及活化與ICAM-1和E-選擇素的蛋白表達變化是一致的，提示在高脂損傷的過程中，丹皮酚通過阻斷IκB/NF-κB信號通路，從而降低ICAM-1和E-選擇素的表達，減輕炎癥反應(yīng)，進而發(fā)揮抗動脈粥樣硬化的作用。

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PaeonolreducesexpressionofadhesionmoleculesinHUVECsinducedbyhyperlipidemicserumviainhibitingthepathwayofNF-κBsignaling

ZHOU Xiao-hui, NIU Cheng-wei, CAO Kai, XU Qian

(DepartmentofBiochemistry,ChengdeMedicalCollege,Chengde067000,China.E-mail:zxh5055@sina.com)

AIM: To observe the anti-atherosclerosis effect of paeonal(Pae) on the activation of NF-κB and the expression of cell adhesion molecules in human umbilical vein endothelial cells(HUVECs) induced by hyperlipidemic serum.METHODSCultured HUVECs were used as target cells. Hyperlipidemic serum was added to the culture medium to establish the injury mode of HUVECs. Methyl thiazolyl tetrazolium(MTT) method was used to examine the cell viability. The mRNA expression of NF-κB p65 was determined by RT-PCR. The protein levels of IκB-α, intercellular cell adhesion molecule-1(ICAM-1)and E-selectin were detected by Western blotting.RESULTSAfter treated with Pae, the cell viability was increased and the morphological changes of HUVECs injured by hyperlipidemic serum trended to normal. The expression of IκB-α in HUVECs injured by hyperlipidemic serum increased, while the expression of NF-κB p65 mRNA, ICAM-1 and E-selectin protein was decreased.CONCLUSIONThe anti-atherosclerosis mechanism of paeonal may be related to the inhibitory effect of the natural compound on the pathway of NF-κB/IκB, thereby reducing the expression of ICAM-1 and E-selectin and attenuating the inflammatory reaction in vascellum.

Paeonal; Hyperlipidemic serum; Umbilical vein endothelial cells; NF-kappa B; Intercellular adhesion molecule-1; E-selectin

R285.5

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.02-008

1000-4718(2011)02-0249-05

2010-08-23

2010-11-16

河北省科技廳基金資助項目(No.07276101D-47)

△通訊作者 Tel：0314-2291158; E-mail: zxh5055@sina.com