康 靜 成 蓓, 姜 蕾

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院高干科，湖北 武漢 430022)

內(nèi)脂素對THP-1源性巨噬細胞ATP結合盒轉(zhuǎn)運蛋白A1表達的影響*

康 靜△成 蓓, 姜 蕾

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院高干科，湖北 武漢 430022)

目的觀察內(nèi)脂素(visfatin)對人單核細胞株THP-1源性巨噬細胞ATP結合盒轉(zhuǎn)運蛋白A1(ABCA1)表達的影響，探討visfatin誘導THP-1源性泡沫細胞形成的機制。方法THP-1單核細胞誘導分化為巨噬細胞，予不同濃度和時間的visfatin進行干預，分別運用油紅O染色觀察細胞漿脂滴變化，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)法和蛋白免疫印跡(Western blotting)法檢測各組細胞ABCA1 mRNA和蛋白表達，酶熒光學法檢測細胞內(nèi)總膽固醇(TC)和游離膽固醇(FC)含量，TC與FC之差為膽固醇酯(CE)含量。結果與對照組比較，visfatin干預組細胞漿脂滴明顯增多，細胞內(nèi)FC和CE含量增加(均P<0.05)。Visfatin呈濃度和時間依賴性地下調(diào)ABCA1 mRNA和蛋白表達(P<0.05)。結論Visfatin下調(diào)THP-1源性巨噬細胞ABCA1的表達，使細胞內(nèi)FC流出減少，CE合成增加，從而誘導泡沫細胞的形成。

內(nèi)脂素； ATP結合盒轉(zhuǎn)運體A1； 泡沫細胞

內(nèi)脂素(visfatin)是由脂肪組織分泌的細胞因子，在巨噬細胞中高表達[1]，近年來的許多研究發(fā)現(xiàn)，visfatin與缺氧、內(nèi)皮功能紊亂、血管增生、炎癥和易損斑塊破裂等密切相關，從而促進動脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展[2]。泡沫細胞的形成是早期動脈粥樣硬化的一個典型的病理特征，巨噬細胞膽固醇代謝穩(wěn)態(tài)的失衡貫穿于泡沫細胞形成的整個過程。ATP結合盒轉(zhuǎn)運蛋白A1(ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1)是參與巨噬細胞膽固醇代謝的關鍵酶， ABCA1介導膽固醇流出[3]，ABCA1表達下調(diào)將導致細胞內(nèi)游離膽固醇流出減少，膽固醇酯聚集，而膽固醇酯的聚集是泡沫細胞形成的主要標志[4]。本實驗以人單核細胞株(human acute monocytic leukemia cell line,THP-1)源性巨噬細胞為研究對象，觀察visfatin對巨噬細胞膽固醇代謝的關鍵蛋白ABCA1表達的影響，探討visfatin誘導THP-1源性泡沫細胞形成的機制。

材 料 和 方 法

1材料

THP-1單核細胞株購于武漢大學典型培養(yǎng)物保藏中心。佛波酯(phorbol myristate acetate,PMA)、牛血清白蛋白(albumin from bovine serum,BSA)和辣根過氧化物酶(horseradish perioxidase,HRP)標記的羊抗兔Ⅱ抗購于Sigma 。胎牛血清和RPMI-1640 培養(yǎng)基購于Gibco。氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)購于上海滬尚生物有限公司。兔抗人ABCA1抗體購于Millipore。 RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Toyobo。PCR 引物由上海英駿生物技術有限公司合成。ECL試劑購于Pierce。人visfatin購于Phoenix Pharmaceuticals。

2方法

2.1細胞培養(yǎng)及分組 THP-1細胞按美國典型物培養(yǎng)中心的說明培養(yǎng)和傳代。THP-1 細胞加入160 nmol/L PMA孵育48 h，誘導分化為巨噬細胞后隨機分組。(1)對照組：在培養(yǎng)液中加入100 mg/L ox-LDL，孵育24 h；(2)不同濃度visfatin干預組：給予不同濃度的visfatin(10-7mol/L、10-6mol/L和10-5mol/L)預孵2 h后加入100 mg/L ox-LDL，孵育24 h；(3)不同時間visfatin干預組：給予10-6mol/L visfatin預孵2 h后加入100 mg/L ox-LDL，分別孵育24 h、36 h和48 h。

2.2油紅O染色 稱取0.5 g的油紅O粉溶解于100 mL 98%異丙醇中，取6 mL加入蒸餾水稀釋至10 mL，靜置10 min，普通濾紙過濾。將培養(yǎng)皿中的細胞進行染色，棄培養(yǎng)基，PBS漂洗后加入冰浴的4%多聚甲醛固定10-15min，棄去甲醛，加入稀釋后的油紅O染液，室溫放置10 min，蘇木素染核1 min，PBS沖洗，細胞保存于PBS中，置于顯微鏡下觀察并拍照記錄。

2.3RT-PCR檢測ABCA1 mRNA表達 收集各組細胞按Biozol試劑盒說明書提取總RNA，取1.5 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再取2.5 μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行PCR循環(huán)。ABCA1的引物序列：上游5’-TCT CAC CAC TTC GGT CTC CAT-3’，下游5’-CTT CTC ATC ACT TTC CTC GCC -3’，產(chǎn)物長度298 bp。β-actin的引物序列：上游5’-GTC CAC CGC AAA TGC TTC TA-3’，下游5’-TGC TGT CAC CTT CAC CGT TC- 3’，產(chǎn)物長度249 bp。PCR反應條件：95 ℃預變性2 min， 95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 45 s， 40個循環(huán)后，72 ℃ 10 min。反應結束后各取反應產(chǎn)物2.5 μL進行2﹪瓊脂糖凝膠電泳(含1 mg/L溴化乙啶)，UVP型凝膠圖像分析系統(tǒng)攝圖，將各組的ABCA1分別與β-actin mRNA灰度值進行比較，二者的比值代表ABCA1 mRNA的表達。

2.4Western blotting檢測ABCA1蛋白表達 收集各組細胞加入細胞裂解液提取總蛋白，并用Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度，用9%SDS-PAGE凝膠進行電泳分離，每孔的上樣量為50 μg，然后轉(zhuǎn)膜，封閉，加Ⅰ抗、辣根過氧化物酶標記Ⅱ抗，用ECL液進行熒光檢測并顯示于X光片上。結果均用Gelwork圖像分析軟件進行分析，將各組的ABCA1分別與β-actin的面積灰度值進行比較，二者的比值代表ABCA1蛋白的表達。

2.5細胞內(nèi)總膽固醇和游離膽固醇含量的測定 收集各組細胞用PBS漂洗3次，用超聲破碎細胞，酶熒光學法分別測定細胞內(nèi)總膽固醇(total cholesterol，TC)和游離膽固醇(free cholesterol，F(xiàn)C)含量[5]，TC與FC之差為膽固醇酯(cholesterol ester，CE)的含量，以mg/g蛋白為單位。CE占TC的50﹪以上可界定為泡沫細胞形成。

3統(tǒng)計學處理

結 果

1Visfatin對THP-1源性巨噬細胞內(nèi)脂滴的影響

THP-1 單核細胞中加入PMA(160 nmol/L) 培養(yǎng)48 h 后，分化為巨噬細胞，巨噬細胞與100 mg/L ox-LDL共同孵育24 h后，細胞內(nèi)形成脂滴，油紅O染色呈現(xiàn)紅色圓形顆粒狀，見圖1A。與對照組比較，visfatin干預組細胞漿脂滴明顯增加，隨著visfatin濃度的升高，細胞漿脂滴逐漸增加，見圖1B、C、D；隨著visfatin作用時間的延長，細胞漿脂滴亦逐漸增加，見圖1E、F。

Figure 1. The lipid droplet content of THP-1-derived monocytes was observed by oil red O staining(×400).A：control；B：visfatin 10-7 mol/L 24 h；C：visfatin 10-6 mol/L 24 h；D：visfatin 10-5 mol/L 24 h；E：visfatin 10-6 mol/L 36 h；F：visfatin 10-6 mol/L 48 h.

2不同濃度visfatin對THP-1源性巨噬細胞ABCA1mRNA表達影響

Visfatin干預組隨著visfatin濃度(10-7mol/L、10-6mol/L和10-5mol/L)升高， ABCA1 mRNA的表達水平呈下降趨勢，分別為2.37±0.09、1.52±0.03和0.70±0.02，與對照組3.51±0.08比較，差異顯著(n=3，P<0.05)，不同濃度組間比較差異顯著(P<0.05)；直線相關分析顯示，ABCA1 mRNA表達水平與visfatin濃度呈顯著負相關(r=-0.97，P<0.05)，提示visfatin呈濃度依賴性下調(diào)ABCA1 mRNA表達,見圖2。

Figure 2. The expression of ABCA1 mRNA was determined by RT-PCR in visfatin groups at different concentrations.M：marker；1：control；2：visfatin 10-7 mol/L；3：visfatin 10-6 mol/L；4：visfatin 10-5 mol/L.

3不同濃度visfatin對THP-1源性巨噬細胞ABCA1蛋白表達影響

Visfatin干預組隨著visfatin濃度(10-7mol/L、10-6mol/L和10-5mol/L)升高，ABCA1蛋白的表達水平呈下降趨勢，分別為1.81± 0.05、1.52± 0.04和0.61 ± 0.01，與對照組2.92± 0.09比較，差異顯著(P<0.05)，不同濃度組間比較差異顯著(n=3，P<0.05)；直線相關分析顯示，ABCA1蛋白表達水平與visfatin濃度呈顯著負相關(r=-0.71，P<0.05)，提示visfatin呈濃度依賴性下調(diào)ABCA1蛋白表達,見圖3。

4不同時間visfatin對THP-1源性巨噬細胞ABCA1mRNA表達影響

Visfatin 10-6mol/L組隨著visfatin作用時間(24 h、36 h和48 h)的延長， ABCA1 mRNA的表達水平呈下降趨勢，分別為1.52±0.03、0.79±0.02和0.47±0.01，組間比較差異顯著(n=3，P<0.05)；直線相關分析顯示，ABCA1 mRNA表達水平與visfatin作用時間呈顯著負相關(r=-0.82，P<0.05)，提示visfatin呈時間依賴性下調(diào)ABCA1 mRNA表達，見圖4。

Figure 3. The expression of ABCA1 protein was determined by Western blotting in visfatin groups at different concentrations.1：control；2：visfatin 10-7 mol/L；3：visfatin 10-6 mol/L；4：visfatin 10-5 mol/L.

Figure 4. The expression of ABCA1 mRNA was determined by RT-PCR in visfatin groups for different time points.M：marker；1：visfatin 10-6 mol/L 24 h；2：visfatin 10-6 mol/L 36 h；3：visfatin 10-6 mol/L 48 h.

5不同時間visfatin對THP-1源性巨噬細胞ABCA1蛋白表達影響

Visfatin 10-6mol/L組隨著visfatin作用時間(24 h、36 h和48 h)的延長，ABCA1蛋白的表達水平呈下降趨勢，分別為1.52± 0.04、1.01 ± 0.02和0.51± 0.02，組間比較差異顯著(n=3，P<0.05)；直線相關分析顯示，ABCA1蛋白表達水平與visfatin濃度呈顯著負相關(r=-0.73，P<0.05)，提示visfatin呈時間依賴性下調(diào)ABCA1蛋白表達，見圖5。

Figure 5.The expression of ABCA1 protein was determined by Western blotting in visfatin groups for different time points.1：visfatin 10-6 mol/L 24 h；2：visfatin 10-6 mol/L 36 h；3：visfatin 10-6mol/L 48 h.

6Visfatin對細胞內(nèi)總膽固醇(TC)、游離膽固醇(FC)和膽固醇酯(CE)含量的影響

酶熒光學法檢測顯示，與對照組比較，visfatin干預組細胞內(nèi)TC、FC和CE含量增加(n=3，P<0.05)，隨著visfatin濃度(10-7mol/L、10-6mol/L和10-5mol/L)升高，TC、FC和CE含量逐漸增加。與visfatin 10-6mol/L作用24 h組比較，隨著visfatin 10-6mol/L作用時間(36 h和48 h)延長，TC、FC和CE含量逐漸增加(n=3，P<0.05),見表1。

表1 Visfatin對各組細胞TC、FC和CE含量的影響

討 論

Visfatin是由內(nèi)臟脂肪細胞高表達的一種脂肪細胞因子，與動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展過程密切相關。動脈粥樣硬化是心腦血管疾病的發(fā)病基礎，研究發(fā)現(xiàn)[6]，在冠心病患者的動脈粥樣硬化斑塊中有visfatin的高表達，而且它還可能介導了斑塊的不穩(wěn)定性，在急性心肌梗死患者破裂斑塊局部表現(xiàn)出更顯著的visfatin免疫染色。動脈粥樣硬化發(fā)生的早期病理特征是泡沫細胞的形成，膽固醇代謝穩(wěn)態(tài)的失衡貫穿于泡沫細胞形成的整個過程。ABCA1是一種整合膜蛋白，以ATP為能源促進細胞內(nèi)游離膽固醇的流出，是細胞內(nèi)膽固醇逆轉(zhuǎn)運的重要途徑[7-9]。研究顯示[10]，ABCA1高表達促進細胞內(nèi)游離膽固醇流出，抑制泡沫細胞形成； ABCA1功能障礙將導致細胞內(nèi)游離膽固醇流出減少，促進泡沫細胞形成。因此，ABCA1是影響巨噬細胞膽固醇代謝平衡的關鍵基因，在泡沫細胞形成中起重要作用。

本實驗觀察了visfatin對THP-1源性巨噬細胞ABCA1表達的影響，結果顯示，與對照組比較，visfatin干預組細胞漿脂滴明顯增加，ABCA1 mRNA和蛋白表達水平降低，細胞內(nèi)游離膽固醇和膽固醇酯含量增加。隨著visfatin濃度的升高及作用時間的延長，細胞漿脂滴逐漸增加，ABCA1 mRNA和蛋白表達水平逐漸降低，細胞內(nèi)游離膽固醇和膽固醇酯含量逐漸增加。相關分析顯示visfatin呈濃度及時間依賴性下調(diào)ABCA1的表達。

綜上所述，visfatin通過對THP-1源性巨噬細胞ABCA1表達的下調(diào)，減少細胞內(nèi)游離膽固醇流出，從而增加細胞內(nèi)膽固醇酯聚集，促進泡沫細胞的形成。這為我們研究visfatin致動脈粥樣硬化的機制提供了新的理論依據(jù)。

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EffectofvisfatinonexpressionofATPbindingcassettetransporterA1inTHP-1-derivedmacrophages

KANG Jing, CHENG Bei, JIANG Lei

(DepartmentofGeriatrics,TheUnionHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430022,China.E-mail:kangj97@sina.com)

AIM: To explore the mechanism of foam cell formation by investigating the expression of ATP binding cassette transporter A1(ABCA1) in human acute monocytic leukemia cell line(THP-1)-derived macrophages treated with visfatin.METHODSTHP-1 monocytes were induced into macrophages by exposure of the cells to phorbol myristate acetate(PMA, 160 nmol/L) for 48 h. The macrophages were then treated with visfatin at different concentrations and for different time points. The lipid droplets in cytoplasm of the macrophages were observed by oil red O staining. The expression of ABCA1 at mRNA and protein levels was determined by reverse transcriptase polymerase chain reaction(RT-PCR) and Western blotting, respectively. The contents of intracellular total cholesterol(TC) and free cholesterol(FC) was measured by enzyme fluorescence analysis. The content of cholesterol ester(CE) was calculated according to the difference between TC and FC.RESULTSCompared with control group, the lipid droplets and the content of FC and CE were increased in visfatin-treated macrophages. The expression of ABCA1 at mRNA and protein levels was down-regulated by visfatin in a concentration-and time-dependent manner(P<0.05).CONCLUSIONThe down-regulation of ABCA1 expression is induced by visfatin through reducing FC efflux and increasing CE synthesis. This may induce the formation of THP-1-derived foam cells.

Visfatin; ATP binding cassette transporter A1; Foam cells

R34

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.02-005

1000-4718(2011)02-0234-04

2010-08-23

2010-11-08

國家自然科學基金資助項目(No.30471921)

△通訊作者 Tel：027-85351556; E-mail:kangj97@sina. com