歐陽(yáng)文 劉 軍* 李俊輝

(1、武漢工業(yè)學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023；2、華中農(nóng)大浦城綠康生物工程研究所，湖北 武漢 430070)

一種地衣芽孢桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建

歐陽(yáng)文1劉 軍1*李俊輝2

(1、武漢工業(yè)學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023；2、華中農(nóng)大浦城綠康生物工程研究所，湖北 武漢 430070)

用PCR方法從地衣芽孢桿菌WH-08基因組DNA中分別擴(kuò)增α-淀粉酶基因amyL啟動(dòng)子PamyL和終止子TT，用重疊PCR技術(shù)將兩者連接，重疊PCR產(chǎn)物用Hind III和EcoR I雙酶切后，與經(jīng)相同酶切的載體PHY300 PLK連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒PHY-PamyL-TT。該重組載體的構(gòu)建為外源蛋白在地衣芽孢桿菌中的高效表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。

地衣芽孢桿菌；重疊PCR；表達(dá)載體

芽孢桿菌具有良好的分泌特性，其發(fā)酵工藝和產(chǎn)物回收技術(shù)也較成熟，用作外源蛋白的分泌型宿主菌，具有很大的潛力[1]。以往主要以枯草芽孢桿菌表達(dá)外源蛋白，但研究發(fā)現(xiàn)，地衣芽孢桿菌作為蛋白表達(dá)宿主有較多優(yōu)勢(shì)。地衣芽孢 桿菌是一種革蘭氏陽(yáng)性的腐生性微生物，廣泛分布于土壤和其它自然環(huán)境中，具有耐熱，酶系豐富，產(chǎn)酶量高，安全等諸多優(yōu)良特性，是芽孢桿菌中較具應(yīng)用潛力的菌種之一。與枯草芽孢桿菌相比，地衣芽孢桿菌生長(zhǎng)溫度高，不僅能節(jié)省生產(chǎn)能源，而且也使某些酶對(duì)結(jié)合在胞壁上的蛋白酶敏感性降低；其次，其生長(zhǎng)速率適中，容易使剛跨膜的未合適折疊的蛋白充分折疊[2]。作為高表達(dá)外源基因的宿主細(xì)胞，地衣芽孢桿菌提供了外源基因高效穩(wěn)定的細(xì)胞微環(huán)境，表達(dá)產(chǎn)物較穩(wěn)定，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)目的，且在酶產(chǎn)量方面，其比枯草芽孢桿菌更具優(yōu)勢(shì)，有成為生產(chǎn)工業(yè)用酶宿主菌的巨大潛力。

啟動(dòng)子是基因表達(dá)調(diào)控的重要順式元件，也是基因工程表達(dá)載體的一個(gè)重要元件，適宜啟動(dòng)子的選擇是重組蛋白高效表達(dá)的關(guān)鍵因素之一。地衣芽孢桿菌具有較強(qiáng)向胞外分泌α-淀粉酶的能力。一般來(lái)說(shuō)，高效表達(dá)的基因往往具有較強(qiáng)的啟動(dòng)子。牛丹丹等[3]利用地衣芽孢桿菌自身啟動(dòng)子PamyL，構(gòu)建表達(dá)載體在地衣芽孢桿菌中實(shí)現(xiàn)了α-淀粉酶基因的高效表達(dá)。本研究通過(guò)利用重疊PCR技術(shù)從地衣芽孢桿菌基因組中分別擴(kuò)增α-淀粉酶基因amyL啟動(dòng)子PamyL和終止子TT，構(gòu)建重組質(zhì)粒PHY-PamyL-TT，為外源蛋白在地衣芽孢桿菌中的高效表達(dá)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒 地衣芽孢桿菌WH-08，克隆載體PHY300PLK，均為本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 主要試劑 各種限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、PyrobestTMDNA Polymerase、DNA Marker DL2000均購(gòu)自TaKaRa公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒、膠回收試劑盒購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 啟動(dòng)子PamyL的擴(kuò)增

根據(jù)amyL基因啟動(dòng)子PamyL序列設(shè)計(jì)引物：上游引物P1：5'-ATGCAAGCTTGTCGAC ATTGGTAACTGTATCTCAGC-3'(引物引入Hind III和Sal I酶切位點(diǎn)，用下劃線標(biāo)注），下游引物P2：5'-AGATCTTCTAGAGGATCCGGTACCGAGCTC AAGATTTGCCGCCGCTGC-3'(下劃線標(biāo)注多克隆位點(diǎn)MCS)，以地衣芽孢桿菌WH-08基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增啟動(dòng)子PamyL。PCR反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性5min，94℃變性1min→51℃退火1min→72℃延伸1min (30 個(gè)循環(huán))，72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用PCR回收試劑盒回收，作為重疊PCR的模板。

1.2.2 終止子TT的擴(kuò)增

根據(jù)amyL基因終止子TT序列，設(shè)計(jì)引物：上游引物P3：5'-

GAGCTCGGTACCGGATCCTCTAGAAGATCT GATAGAAGAGCAGAGAGGA-3'(下劃線標(biāo)注多克隆位點(diǎn)MCS：

SacⅠ-KpnⅠ-BamHⅠ-XbaⅠ-BglⅡ),下游引物P4: 5'-GAATTCCCGGGACTAGTGCATGCGGCCGC GATCACCCGC

GATACCG-3'(下劃線標(biāo)注多克隆位點(diǎn)MCS：EcoRⅠ-SmaⅠ- SpeⅠ- SphⅠ - NotⅠ)，以地衣芽孢桿菌WH-08基因組為模板，

PCR擴(kuò)增amyL基因終止子TT。PCR反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性5min，94℃變性1min→51℃退火 1min→72℃延伸1min(30 個(gè)循環(huán))，

72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用PCR回收試劑盒回收，作為重疊PCR的模板。

1.2.3 啟動(dòng)子PamyL和終止子TT的連接

采用重疊PCR的方法，將回收的啟動(dòng)子PamyL和終止子TT混合，做為擴(kuò)增的模板，加入P1和P4作為PCR擴(kuò)增引物。PCR反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性5min，94℃變性1min→51℃退火 1min→72℃延伸1min (30個(gè)循環(huán))，72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用PCR回收試劑盒回收。

1.2.4 重組質(zhì)粒PHY-PamyL-TT的構(gòu)建

回收重疊PCR產(chǎn)物，用Hind III和EcoR I雙酶切后，與經(jīng)相同酶切的載體PHY300 PLK連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒PHY-PamyL-TT，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選陽(yáng)性克隆。提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，經(jīng)Hind III和EcoR I雙酶切鑒定后，測(cè)序分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 啟動(dòng)子PamyL的擴(kuò)增

提取地衣芽孢桿菌WH-08基因組，PCR擴(kuò)增amyL基因啟動(dòng)子PamyL，結(jié)果見圖1，擴(kuò)增產(chǎn)物與啟動(dòng)子PamyL大小相符（約280bp）。

圖1 PCR擴(kuò)增啟動(dòng)子PamyLM：DL2000核酸標(biāo)準(zhǔn)分子量；1~3：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 終止子TT的擴(kuò)增

提取地衣芽孢桿菌WH-08基因組，PCR擴(kuò)增amyL基因終止子TT，結(jié)果見圖2，擴(kuò)增產(chǎn)物與終止子TT大小相符（約280bp）。

圖2 PCR擴(kuò)增終止子TTM：DL2000核酸標(biāo)準(zhǔn)分子量；1~3：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.3 重疊PCR連接啟動(dòng)子PamyL和終止子TT

以回收的啟動(dòng)子PamyL和終止子TT混合物做為擴(kuò)增的模板，通過(guò)重疊PCR方法，將PamyL和終止子TT連接起來(lái)。結(jié)果見圖3。擴(kuò)增產(chǎn)物大小與預(yù)計(jì)相符，在550bp處可見擴(kuò)增條帶。

圖3 重疊PCR擴(kuò)增M：DL2000核酸標(biāo)準(zhǔn)分子量：1~3：重疊PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.4 重組質(zhì)粒PHY-PamyL-TT的構(gòu)建與鑒定

重組質(zhì)粒構(gòu)建過(guò)程見圖4。用Hind III和EcoR I酶切重疊PCR產(chǎn)物，連接到經(jīng)同樣雙酶切的PHY300PLK上，構(gòu)建重組質(zhì)粒PHY-PamyL-TT。重組質(zhì)粒經(jīng)Hind III和EcoR I雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳可見在4800bp和550bp處兩條帶，分別與質(zhì)粒PHY300PLK以及重疊片段大小相符，見圖5。測(cè)序結(jié)果表明，重組表達(dá)載體PHY-PamyL-TT構(gòu)建成功。

圖4 重組質(zhì)粒PHY-PamyL-TT的構(gòu)建

圖5 重組質(zhì)粒酶切鑒定M： DL2000核酸標(biāo)準(zhǔn)分子量；1：經(jīng)Hind III和EcoR I雙酶切的重組質(zhì)粒PHY-PamyL-TT；2： 質(zhì)粒PHY300PLK； 3: 重疊PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

本研究通過(guò)利用重疊PCR技術(shù)從地衣芽孢桿菌WH-08基因組中分別擴(kuò)增啟動(dòng)子PamyL和終止子TT，構(gòu)建重組質(zhì)粒PHY-PamyL-TT，內(nèi)含兩個(gè)多克隆位點(diǎn)，方便基因的插入，為外源蛋白在地衣芽孢桿菌中的高效表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。

[1]Simonen M, Palva I.Protein secretion in Bacillus species [J].Microbiol Mol Biol Rev. 1993 , 57(1): 109-137.

[2]牛丹丹,石貴陽(yáng),王正祥.分泌高效蛋白的地衣芽孢桿菌及其工業(yè)應(yīng)用[J].生物技術(shù)通報(bào),2009,(6): 45-50.

[3]牛丹丹,徐敏,王正祥,等.地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因的克隆及其啟動(dòng)子功能鑒定[J].微生物學(xué)報(bào),2006, 46(4): 576-580.

Q2-3

A

1673-2219（2011）12-0024-03

2011－09－25

歐陽(yáng)文（1985－），湖北仙桃人，碩士研究生，主要從事應(yīng)用微生物與生物技術(shù)研究。

通迅作者：劉軍(1966－)，副教授，湖北南漳人，主要從事應(yīng)用微生物與生物技術(shù)研究。

(責(zé)任編校：何俊華)