葉聿程 詹 偉 徐松清 李祖巍 張向明 謝必峰

(1.福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建福州，350018;2.福建嘉豐生物化工有限公司，福建永安，366000)

降解天然樹脂的微生物分離與篩選

葉聿程1詹 偉1徐松清1李祖巍2張向明2謝必峰1

(1.福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建福州，350018;2.福建嘉豐生物化工有限公司，福建永安，366000)

從造紙廠采集的土樣中，經(jīng)過(guò)富集、初篩和多輪復(fù)篩實(shí)驗(yàn)，分離得到了5株降解天然樹脂能力較強(qiáng)的微生物。采用液體發(fā)酵以及穩(wěn)定性復(fù)篩的方法，從這5株微生物中篩選得到了降解天然樹脂能力穩(wěn)定并且降解率較高的菌株Z75、Z37。分別對(duì)這2株菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，培養(yǎng)24 h后的菌落直徑均大于1 mm，菌株Z75菌體長(zhǎng)度小于5 μm，初步判斷Z75菌株為短桿菌;菌株Z37菌體長(zhǎng)度小于0.1 μm，初步判斷Z37為細(xì)球菌。對(duì)Z75菌株的降解條件進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，在35 mL的Z75菌株發(fā)酵液中，最適降解反應(yīng)的樹脂底物顆粒 (球形)質(zhì)量為0.2 g，最適降解反應(yīng)時(shí)間≥20 h;發(fā)酵條件和培養(yǎng)基初步優(yōu)化的結(jié)果顯示，Z75菌株發(fā)酵液降解天然樹脂的降解率由優(yōu)化前的6.5%左右提高到43.3%。

樹脂障礙;天然樹脂降解;微生物;分離與篩選

馬尾松是制漿造紙生產(chǎn)的木材原料之一，其樹脂含量高達(dá)3.51%，容易在制漿過(guò)程中產(chǎn)生樹脂障礙問(wèn)題［1-2］;脫墨漿和機(jī)械漿的大量使用以及紙機(jī)白水封閉循環(huán)次數(shù)的增加，使樹脂障礙成為制約造紙生產(chǎn)效率提高的難題之一［3-5］。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，利用生物技術(shù)解決樹脂障礙問(wèn)題已成為近年來(lái)國(guó)內(nèi)的主要研究課題［6-8］。其中，以脂肪酶為主的生物酶樹脂障礙控制劑 (由不同菌株發(fā)酵產(chǎn)生的多種酶，按一定比例配制而成)顯示出較好的效果。但是，酶制劑生產(chǎn)成本較高，而且使用過(guò)程中酶易失活而降低使用效果［9-11］。為了解決上述難題，本研究采用直接分離具有降解天然樹脂能力的單一菌株，并通過(guò)對(duì)該微生物的發(fā)酵過(guò)程的探討，以期實(shí)現(xiàn)直接利用發(fā)酵濃縮液 (單一菌株發(fā)酵產(chǎn)生多種酶)處理樹脂。為真正實(shí)現(xiàn)生物法處理造紙樹脂障礙的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 土樣

土樣采集于福建南紙股份有限公司制漿生產(chǎn)線的漿渣和木片原料堆放處的土壤。

1.1.2 培養(yǎng)基［12］

①富集培養(yǎng)基

(NH4)2SO42 g，K2HPO43 g，MgSO41 g，天然樹脂液10 mL，NaCl 2 g，pH值7.0，H2O 1 L。

②選擇培養(yǎng)基

(NH4)2SO42 g，K2HPO43 g，MgSO41 g，天然樹脂液10 mL，NaCl 2 g，瓊脂20 g，pH值 7.0，H2O 1 L。

③液體培養(yǎng)基

牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，天然樹脂液10 mL，H2O 1 L，pH值7.0。

④斜面培養(yǎng)基 (LB培養(yǎng)基)

牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂15～20 g，H2O 1 L，pH值7.0。

⑤發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基

Na2HPO4·7H2O 1 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，葡萄糖 5 g， (NH4)2SO41 g，NaCl 5 g，K2HPO41 g，H2O 1 L，pH值7.5～8.0。

1.1.3 樹脂底物

固體樹脂取自福建沙縣高橋林場(chǎng)。天然樹脂液配制:0.5 mol/L NaOH 10 mL+天然樹脂顆粒1 g。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

pH計(jì)、移液槍、恒溫?fù)u床 (智城ZHWY-2112B)、電熱恒溫培養(yǎng)箱 (新苗DNP-9002BS-Ⅲ)、高速臺(tái)式冷凍離心機(jī) (湘儀TGL-16M)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 微生物菌種的分離與篩選方法

利用天然樹脂作為培養(yǎng)基的唯一碳源，篩選能夠降解天然樹脂的微生物，主要方法見(jiàn)文獻(xiàn) ［13］。

1.3.2 降解樹脂效價(jià)的測(cè)定方法

將發(fā)酵液在6000 r/min條件下，離心分離6 min，取上清液傾入已滅菌的150 mL三角瓶中。稱取均一質(zhì)量的天然樹脂顆粒，質(zhì)量為M1，將其放入上清液中，然后在45℃，150 r/min搖床中反應(yīng)24 h，然后取出天然樹脂顆粒晾干稱量，質(zhì)量為M2。由反應(yīng)前后的質(zhì)量差，計(jì)算降解率，即:降解率 =(M1－M2)/M1×100%。

1.3.3 菌株形態(tài)學(xué)鑒定［14］

①菌落形態(tài)觀察:將篩選到的菌株在LB培養(yǎng)基上劃線接種，在37℃培養(yǎng)24 h，連續(xù)觀察菌株的菌落形態(tài)變化。

②顯微鏡形態(tài)觀察:用細(xì)菌簡(jiǎn)單染色法對(duì)培養(yǎng)后的菌株進(jìn)行結(jié)晶紫染色，然后將染色后的玻片用油鏡觀察其形態(tài)。

2 結(jié)果與討論

2.1 微生物的篩選

2.1.1 降脂微生物的分離及建立資源庫(kù)

土壤是自然界中最大的菌庫(kù)，因此實(shí)驗(yàn)采用從造紙廠環(huán)境中采集土樣，并進(jìn)行微生物菌種的分離。主要步驟如下:

(1)富集培養(yǎng) 稱取5 g土樣置入裝有50 mL無(wú)菌水的三角瓶中，振蕩打散均勻后，取4 mL懸浮液加入裝有40 mL富集培養(yǎng)基的三角瓶中，37℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。

(2)平板初篩 將經(jīng)過(guò)富集培養(yǎng)后的培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋，然后從稀釋液中吸取0.1 mL加到裝有篩選培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，用無(wú)菌玻璃涂布棒在培養(yǎng)基的表面輕輕地涂布均勻，并在各個(gè)培養(yǎng)皿的對(duì)應(yīng)位置中作好標(biāo)記，放在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)果如圖1所示。圖1顯示，以天然樹脂為唯一碳源，選擇平板培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的大小不同的菌落，選擇生長(zhǎng)旺盛、菌落形態(tài)較大的菌株進(jìn)行劃線分離，即圖1中標(biāo)記的菌落，挑菌培養(yǎng)于試管斜面。實(shí)驗(yàn)中共分離到99株菌株，以此建立了復(fù)篩菌資源庫(kù)。

2.1.2 搖瓶篩選

依次將菌庫(kù)中的菌株分批進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，將斜面的菌株接種到裝有40 mL液體培養(yǎng)基的三角瓶中，在37℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，制備成種子液。然后取2 mL種子液于裝有40 mL搖瓶復(fù)篩培養(yǎng)基的三角瓶中，在37℃，200 r/min振蕩發(fā)酵培養(yǎng)48 h，制備成發(fā)酵液。將發(fā)酵液在6000 r/min下離心6 min，取上清液至已滅菌的150 mL三角瓶中，加入已稱取的均一質(zhì)量的天然樹脂顆粒，在45℃、150 r/min搖床中反應(yīng)24 h。通過(guò)反應(yīng)前后的質(zhì)量差，計(jì)算出降解率，從而選取降解率高的對(duì)應(yīng)菌株。結(jié)果經(jīng)過(guò)幾輪的搖瓶復(fù)篩，獲得降解率較高的Z75、Z37、Z53、Z77、Z70菌株，作為穩(wěn)定性考察的出發(fā)菌株。最后一輪復(fù)篩的結(jié)果如表1所示。

表1 搖瓶復(fù)篩后菌株的降解率

2.1.3 穩(wěn)定性考察

取初篩和復(fù)篩得到的5株菌株，做5個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行降脂穩(wěn)定性考察。結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出，Z75、Z37在5組平行實(shí)驗(yàn)中降解率相對(duì)較高且穩(wěn)定。所以，選擇這2株菌株作為復(fù)篩菌株。

圖25 株菌株穩(wěn)定性篩選

2.1.4 發(fā)酵液的顏色與降解率的關(guān)系

由于在發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵液的顏色是發(fā)酵特性的最直觀指標(biāo)，研究其與天然樹脂的降解率的關(guān)系，有利于今后發(fā)酵工藝的控制。由表2可以得出，降解率高的發(fā)酵液，其顏色比較深呈暗黃色，降解率低的發(fā)酵液，其顏色比較淺呈淺黃色。這提供了一個(gè)發(fā)酵過(guò)程中的參考指標(biāo)。

表2 發(fā)酵液顏色與降解率的關(guān)系

2.2 菌株形態(tài)特征

2.2.1 LB平板菌落的觀察

平板菌落的觀察結(jié)果見(jiàn)表3和圖3、圖4。

表3 Z37和Z75菌落形態(tài)

2.2.2 顯微鏡觀察微生物［14］

將Z75與Z37菌株通過(guò)涂片染色，在油鏡下觀察，結(jié)果如圖5和圖6所示。由圖5、圖6可以看出，Z37菌體長(zhǎng)度小于0.1 μm，初步判斷屬于細(xì)球菌;Z75的菌體長(zhǎng)度小于5 μm，初步判斷屬于短桿菌［14］。

2.2.3 降脂效價(jià)方法的研究

2.2.3.1 不同質(zhì)量大小的樹脂底物對(duì)降解率的影響

剪取形狀近似球形的、均一的樹脂顆粒，其質(zhì)量分別為0.100、0.150、0.200、0.250、0.300、0.350 g，分別進(jìn)行5個(gè)實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組的實(shí)驗(yàn)，研究不同質(zhì)量的樹脂顆粒對(duì)降解率的影響。取實(shí)驗(yàn)結(jié)果中平行性好的3個(gè)數(shù)據(jù)的平均值作圖 (見(jiàn)圖7)。由圖7可以看出，菌株Z75在降解過(guò)程中的顆粒質(zhì)量選擇0.200 g最好。

2.2.3.2 反應(yīng)時(shí)間的影響

在同一批菌株Z75的發(fā)酵離心液中，分別設(shè)置12、14、16、18、20、22、24 h共7個(gè)時(shí)間點(diǎn)，分別對(duì)7個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行5個(gè)實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組的實(shí)驗(yàn)，研究降解天然樹脂顆粒與反應(yīng)時(shí)間的關(guān)系，取實(shí)驗(yàn)平行性好的3個(gè)數(shù)據(jù)的平均值作圖 (見(jiàn)圖8)。由圖8可以看出，菌株Z75在降解反應(yīng)過(guò)程中選擇20 h及以上的降解率最好，降解率最高且穩(wěn)定。

表4 發(fā)酵培養(yǎng)基碳源的影響

表5 培養(yǎng)基氮源的影響

2.2.4 菌株Z75發(fā)酵培養(yǎng)基的研究

2.2.4.1 碳源

用初始搖瓶篩選的LB培養(yǎng)基作為對(duì)照組，進(jìn)行碳源對(duì)降解率的影響研究。改變基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源種類來(lái)研究碳源對(duì)降解率的影響 (見(jiàn)表4)。由表4可以看出，用葡萄糖作為碳源比用多糖作為碳源時(shí)的降解率和生物量 (OD600)均高很多。并且1.0%和1.5%的葡萄糖所產(chǎn)生的降解率和生物量差別不大。

2.2.4.2 氮源

用初始搖瓶篩選的LB培養(yǎng)基作為對(duì)照組，研究氮源對(duì)降解率的影響。改變基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基氮源的種類來(lái)研究氮源對(duì)降解率的影響，結(jié)果見(jiàn)表5。表5表明，用酵母粉作為氮源的降解率明顯高于用牛肉膏以及無(wú)機(jī)氮源的降解率。

2.2.4.3 基礎(chǔ)培養(yǎng)基初步調(diào)整結(jié)果

根據(jù)前面的碳源和氮源研究結(jié)果，對(duì)基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源和氮源進(jìn)行調(diào)整，取碳源為1.0%葡萄糖，氮源為2.0%酵母粉，其他組分及條件不變(即:Na2HPO4·7H2O 1 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，葡萄糖10 g，酵母粉20 g，NaCl 5 g，K2HPO41 g，H2O 1 L，pH值7.5～8.0)，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖9。由圖9可以看出，新培養(yǎng)基發(fā)酵液的降解率明顯高于LB培養(yǎng)基的降解率，并且高達(dá)43.3%。

2.2.4.4 基礎(chǔ)培養(yǎng)基初步調(diào)整后樹脂顆粒被降解情況對(duì)比

圖10為用對(duì)照組LB培養(yǎng)基發(fā)酵液反應(yīng)后的顆粒和新培養(yǎng)基發(fā)酵液反應(yīng)后的顆粒的實(shí)物照片。由圖10可以看出，用新培養(yǎng)基的發(fā)酵液反應(yīng)后的樹脂顆粒，明顯小于用LB培養(yǎng)基做對(duì)照的發(fā)酵液反應(yīng)后的樹脂顆粒，這表明調(diào)整后的培養(yǎng)基發(fā)酵液，對(duì)天然樹脂顆粒的降解作用比較明顯。

3 結(jié)論

本研究從自然界中分離出具有降解天然樹脂能力的微生物，建立了微生物菌庫(kù)，并在菌庫(kù)中篩選出了對(duì)天然樹脂降解能力強(qiáng)且穩(wěn)定的菌株Z37和Z75。初步鑒定Z37為細(xì)球菌、Z75為短桿菌。通過(guò)對(duì)Z75菌株降解天然樹脂過(guò)程中的數(shù)據(jù)評(píng)估、菌株發(fā)酵條件及培養(yǎng)基配方的初步調(diào)整，確定降解反應(yīng)適宜的底物顆粒質(zhì)量為0.200 g、降解時(shí)間為20 h以上;復(fù)篩菌株Z75的降解率由原來(lái)的6.5%顯著提高到43.3%。

在國(guó)內(nèi)外造紙生產(chǎn)中樹脂障礙處理研究的報(bào)道中，至今未見(jiàn)有通過(guò)篩選微生物并直接利用微生物發(fā)酵液 (主要是復(fù)合酶)進(jìn)行降解天然樹脂以解決造紙生產(chǎn)中樹脂障礙問(wèn)題的研究。本研究嘗試的初步結(jié)果顯示出重要的應(yīng)用前景。相信通過(guò)后期的發(fā)酵研究、制劑研究以及生產(chǎn)應(yīng)用適應(yīng)性研究，能夠?qū)崿F(xiàn)樹脂障礙的微生物處理。

［1］彭志軍．馬尾松天然樹脂的控制與實(shí)驗(yàn)［J］．造紙科學(xué)與技術(shù)，2005，24(6):54．

［2］陳守勤，林一亭，張玉德，等．馬尾松生產(chǎn)新聞紙過(guò)程中樹脂障礙的生物控制［J］．中國(guó)造紙，2001，20(4):63．

［3］張家利，李延軍．紙機(jī)濕部樹脂障礙的控制［J］．中國(guó)造紙，2002，21(1):59．

［4］胡可信．紙漿中的樹脂障礙及其控制技術(shù)與應(yīng)用［J］．湖南造紙，2006(3):9．

［5］王治艷．脂肪酶控制樹脂障礙的研究進(jìn)展［J］．上海造紙，2009(3):41．

［6］Gutierrez A，Del R J，Martinez A T．Microbial and enzymatic control of pitch in the pulp and paper industry［J］．Appl．Microbiol．Biotechnol．，2009，82(6):1005．

［7］陳秀霞．生物酶控制樹脂的機(jī)理與實(shí)踐［J］．國(guó)際造紙，2001，20(2):17．

［8］張春敬，劉 玉，李立波．生物酶技術(shù)控制紙漿中的樹脂障礙［J］．江蘇造紙，2011，3(1):37．

［9］徐麗麗，林 鹿，陳 鵬，等．脂肪酶結(jié)合表面活性劑控制樹脂障礙［J］．中國(guó)造紙學(xué)報(bào)，2007，22(1):28．

［10］宋德龍，鄺仕均．脂肪酶在機(jī)械漿生產(chǎn)中的應(yīng)用［J］．國(guó)際造紙，2000，19(6):56．

［11］許建軍，江 波，許時(shí)嬰．L actococcus lactis谷氨酸脫羧酶的分離純化及部分酶學(xué)性質(zhì)［J］．無(wú)錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，23(3):80．

［12］玄國(guó)營(yíng)，陳 芳，李予霞，等．土壤中脂肪酶生產(chǎn)菌的篩選、鑒定及脂肪酶基因的克隆［J］．生物技術(shù)通報(bào)，2009(8):139．

［13］韓銘海．高產(chǎn)中性纖維素酶菌株的誘變育種和篩選方法［J］．無(wú)錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，22(6):9．

［14］谷海瀛．形態(tài)學(xué)檢查方法的標(biāo)準(zhǔn)及其在細(xì)菌鑒定中的作用［J］．中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2006，29(10):951．

Separating and Screening of Microorganism for Degrading Natural Resin

YE Yu-cheng1ZHAN Wei1XU Song-qing1LI Zu-wei2ZHANG Xiang-ming2XIE Bi-feng1，*
(1．Biotechnology of Fujian Normal University，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian Province，350018;2．Fujan Jiafeng Bio-chemical Co．，Ltd．，Yongan，F(xiàn)ujan Province，366000)
(*E-mail:bfxie2004@163．com)

After enrichment，primary screening and stable repeat screening five strains of microorganism from the soil sample provided by Nanping Paper Co．，Ltd were separated，which can degrade natural resin．Using the method of liquid fermentation and stable repeat screening two strains with high degradation ability—Z75，Z37 were screened from the five strain microorganisms．After 24 h cultivation，the Morphology study of the two strains showed that the diameter of the bacterial agglutinin is ＞1mm，the length of the thalli is ＜5 μm．It is preliminary estimated that the Z75 is brevibacterium．sp and the Z37 is micrococcus varians．The primary study of degradation conditions for Z75 indicated that the optimum particle of natural resin is 0．2 g while the most appropriate cultivation time is 20 h or more．As a result of optimizing fermentation conditions and primary adjustment of culture medium，the degradation rate of Z75 rise from 6．55%to 43．3%，which is significant for using to degrade the natural resin．

pitch troubles;natural resin degrade;microorganism;separationg and screening

葉聿程先生，在讀碩士研究生;主要從事微生物發(fā)酵的研究。

Q55

A

0254-508X(2011)10-0028-05

2011-06-30(修改稿)

(責(zé)任編輯:趙旸宇)