馬 濤 劉德明

(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院1，沈陽(yáng) 110866)

(遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品與加工研究所2，沈陽(yáng) 110161)

酶法制備花生多肽工藝條件優(yōu)化的研究

馬 濤1，2劉德明1

(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院1，沈陽(yáng) 110866)

(遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品與加工研究所2，沈陽(yáng) 110161)

采用堿性蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解花生粕中的蛋白質(zhì)，制取抗氧化活性較高的花生多肽，以水解度(DH)和羥自由基清除率(E)為指標(biāo)，確定了最佳用酶為堿性蛋白酶?？疾炝说孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)、加酶量、時(shí)間、溫度和pH值5個(gè)因素對(duì)水解度(DH)和羥自由基清除率(E)的影響，采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析的方法確定了花生粕酶解制備花生多肽最佳工藝參數(shù)，條件為:底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%、加酶量8 070 U/g底物，pH 7.7，溫度55℃、時(shí)間3 h，該條件下得到的花生多肽羥自由基清除率為62.15%。

花生多肽 酶水解 抗氧化 優(yōu)化

花生粕作為壓榨花生油的一種副產(chǎn)物，產(chǎn)量大，來(lái)源廣，價(jià)格低，且其中含有30% ～50%的花生蛋白質(zhì)［1］。目前，我國(guó)大部分花生粕作為飼料使用，有的甚至作為廢料丟棄，不僅造成資源浪費(fèi)，而且污染環(huán)境。開(kāi)發(fā)花生粕提取花生多肽，原料價(jià)格較低，符合節(jié)約型經(jīng)濟(jì)發(fā)展的需求。

根據(jù)前人的研究表明，花生多肽含有許多活性物質(zhì)，含有人體所必需的8種氨基酸，尤其是硫氨酸的含量相當(dāng)高，總氮量高達(dá)14.8%［2］，其穩(wěn)定性、溶解性都優(yōu)于花生蛋白［3］。動(dòng)物試驗(yàn)表明，小分子肽具有極低的過(guò)敏性，可促進(jìn)脂肪代謝，增強(qiáng)肌肉運(yùn)動(dòng)力，加速肌紅細(xì)胞恢復(fù)，具有良好的吸濕性和保濕性，能促進(jìn)雙歧桿菌的增長(zhǎng)代謝，并且具有獨(dú)特的生理活性，可起到鎮(zhèn)痛，調(diào)節(jié)體溫、血壓、脈搏，促進(jìn)鈣離子吸收，增強(qiáng)免疫力等作用［4－5］，能有效降低血清的總膽固醇，提高高密度脂蛋白含量［6－7］，而這些作用都與其抗氧化活性有關(guān)。

花生多肽是冷軋花生粕經(jīng)適度水解后，分離得到的具有生物活性的肽，其中含有很多小肽，這些小肽易被人體消化和吸收，無(wú)毒副作用;但是如果水解過(guò)度，則會(huì)產(chǎn)生過(guò)多的游離氨基酸，口服后在腸道內(nèi)因高滲引起腹瀉［8］。所以，通過(guò)選擇蛋白酶的最佳作用條件，控制水解程度和酶解物的羥自由基清除率，可得到抗氧化活性較高的花生多肽。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

冷軋花生粕(蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為38.8%，水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%):遼寧宏圣花生股份有限公司。

堿性蛋白酶(200 000 U/g)、中性蛋白酶(200 000 U/g)、木瓜蛋白酶(800 000 U/g)、風(fēng)味蛋白酶(40 000 U/g):廣西南寧龐博生物工程有限公司;鹽酸:北京化學(xué)試劑有限公司;氫氧化鈉:北京化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器

YP3001N電子天平:上海光正醫(yī)療儀器有限公司;PHS－3C精密pH劑:上海日島科學(xué)儀器有限公司;CS501－SP恒溫磁力攪拌器:江蘇中大儀器廠;LXJ－ILB離心機(jī):上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;UV120紫外可見(jiàn)分光光度計(jì):尤尼科(上海)儀器有限公司;DHG－9053A數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱:上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 冷軋花生粕的酶解工藝［9］

按一定底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)準(zhǔn)確稱(chēng)取冷軋花生粕粉于反應(yīng)器中，加入適量蒸餾水，輕微攪拌至底物均勻分散于水中。然后在90℃下加熱10 min，冷卻到酶解反應(yīng)溫度后，用1.0 mol/L NaOH調(diào)節(jié)酸堿度至所需要的pH，依據(jù)所用的酶活力單位，準(zhǔn)確稱(chēng)取蛋白酶后加入水解反應(yīng)器，并慢慢攪拌。反應(yīng)過(guò)程中及時(shí)滴加1.0 mol/L NaOH使系統(tǒng)穩(wěn)定在最適pH。反應(yīng)到預(yù)定時(shí)間，即停止加熱攪拌，用1.0 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至4.5，迅速升溫到80℃，加熱10 min，鈍化蛋白酶。記錄水解過(guò)程中消耗的堿液量，并以此計(jì)算水解度DH。

1.3.2 水解度(DH)的測(cè)定:

采用 pH － Stat法［10，11］。按下式計(jì)算:

DH=(V×c)/(α×m×n)×100%

式中:V為堿液體積/L;c為堿液濃度/mol/L;α為氨基的解離度;m為底物中蛋白質(zhì)總量/g;n為底物中蛋白質(zhì)肽鍵總數(shù)，對(duì)花生蛋白而言，n=7.13(根據(jù)花生蛋白的氨基酸組成得到)。

1.3.3 花生多肽體外抗氧化活性的測(cè)定方法

以體外清除羥自由基·OH－做為花生多肽體外抗氧化測(cè)定方法:根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的方法稍加改進(jìn)建立·OH－產(chǎn)生模型［12－13］。樣品對(duì)羥自由基的清除率(E)按下式計(jì)算:

式中:A樣品為樣品的吸光度值;A空白對(duì)照為空白對(duì)照組的吸光度值;A0為空白組的吸光度值。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶的種類(lèi)的篩選

堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶水解冷軋花生粕，酶解的反應(yīng)條件按照蛋白酶推薦最適條件進(jìn)行，見(jiàn)表1。

表1 蛋白酶水解的最適pH和溫度

水解過(guò)程中維持反應(yīng)溶液的pH值和溫度恒定，從反應(yīng)開(kāi)始每間隔40 min取一次樣，滅酶后測(cè)DH，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 蛋白酶的水解進(jìn)程曲線

由圖1可以看出，風(fēng)味蛋白酶對(duì)花生蛋白的水解能力最差，而通過(guò)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)底物酪蛋白作為底物的酶活測(cè)定表明，其酶活力較高，這說(shuō)明從專(zhuān)一性來(lái)說(shuō)，花生蛋白是風(fēng)味蛋白酶的不良底物。木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的水解能力比較接近。在所使用的4種蛋白酶中，堿性蛋白酶的水解能力最強(qiáng)。

因各種蛋白酶的底物特異性及作用位點(diǎn)的差異，不同蛋白酶作用于花生蛋白得到的酶解產(chǎn)物的肽鏈結(jié)構(gòu)和長(zhǎng)度是不同的，其活性也不同。通常期望得到一定功能的活性肽往往是分子質(zhì)量較小的肽，單純的追求高水解度，會(huì)產(chǎn)生較多游離氨基酸，因此僅用水解度為檢測(cè)指標(biāo)來(lái)確定制備抗氧化活性較高的花生多肽的最適酶種及確定酶解最優(yōu)工藝條件是不適合的，應(yīng)該以酶解物的生物活性大小作為檢測(cè)指標(biāo)，因此考察幾種蛋白酶水解物體外抗氧化作用。

表2比較的不同蛋白酶水解物對(duì)羥自由基·OH－的清除作用。從表2中可以看出，雖然4種蛋白酶的水解物都有體外抗氧化作用，但是對(duì)羥自由基的清除作用有較大差異，其中堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶解物抗氧化作用較強(qiáng)［14］。

表2 不同蛋白酶水解物的體外抗氧化活性

由圖1和表2可以看出在4種蛋白酶中，堿性蛋白酶的水解能力最強(qiáng)，酶解物的抗氧化活性最高，而且價(jià)格較低，所以本試驗(yàn)選用堿性蛋白酶為水解用酶。

2.2 加酶量對(duì)水解度及抗氧化活性的影響

配制底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的花生粕溶液，反應(yīng)溫度為55℃，反應(yīng)時(shí)間為3 h，分別按酶和底物之比為2 000、4 000、6 000、8 000、10 000、12 000 U/g 加入不同量的酶進(jìn)行酶解。如圖2所示，水解度隨加酶量的增加而提高，底物的水解度取決于蛋白酶的濃度，只有當(dāng)酶分子在體系中趨于飽和后，部分酶分子不能和底物接觸時(shí)，水解度的提高才會(huì)減慢。當(dāng)加酶量為10 000 U/g底物時(shí)，水解度基本上已經(jīng)保持不變?？寡趸钚砸搽S著加酶量的增加而提高，當(dāng)加酶量為8 000 U/g底物時(shí)羥自由基清除率達(dá)到最大。隨著加酶量的增加，水解度在不段增加，水解物分子質(zhì)量分布范圍就越小，因較高的氧化性只在一定的分子質(zhì)量范圍之內(nèi)，水解不足或者過(guò)度水解會(huì)造成水解物抗氧化活性較低。

圖2 蛋白酶濃度對(duì)水解度和羥自由基清除率的影響

2.3 不同pH對(duì)水解度和抗氧化活性的影響

在加酶量為8 000 U/g底物，反應(yīng)溫度為55℃，反應(yīng)時(shí)間為3 h，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%時(shí)選用不同的pH進(jìn)行水解，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，在pH為8時(shí)，所得的花生多肽有較高的水解度。在pH為8時(shí)，所得水解物羥自由基的清除率也是最高，因此pH 8為蛋白酶作用的最適pH。酶分子是種特殊的蛋白質(zhì)分子，由一個(gè)或者若干個(gè)活性部位組成。酶的活性部位只有與蛋白酶保持一定的空間構(gòu)象才能存在，其催化功能才能實(shí)現(xiàn)，活性部位對(duì)反應(yīng)體系的pH變化比較敏感，其解離狀態(tài)隨pH值的變化而變化。作為反應(yīng)底物的花生蛋白隨著pH的變化也表現(xiàn)出不同解離狀態(tài)，因此，pH直接影響了酶與底物蛋白的結(jié)合和催化。

圖3 pH對(duì)水解度和清除率的影響

2.4 不同酶解溫度對(duì)水解度及抗氧化活性的影響

在底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，加酶量為8 000 U/g底物，pH為8，反應(yīng)時(shí)間為3 h的條件下，選擇不同的溫度進(jìn)行水解。各種催化反應(yīng)都有最適溫度，酶催化反應(yīng)在酶蛋白熱穩(wěn)定性層面和化學(xué)反應(yīng)速度層面起作用。如圖4所示，溫度對(duì)水解度的影響不是很顯著，在溫度40～60℃范圍內(nèi)，水解度的變化很小，羥自由基清除率變化較大，在溫度為55℃時(shí)水解物的抗氧化活性最高，所以選取55℃為最佳反應(yīng)溫度。

圖4 水解溫度對(duì)水解度和清楚率的影響

2.5 不同水解時(shí)間對(duì)水解物及抗氧化活性的影響

加酶量為8 000 U/g底物，pH為8，反應(yīng)溫度為55℃，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的條件下選擇不同的水解時(shí)間進(jìn)行水解度和抗氧化活性的測(cè)定，結(jié)果如圖5所示，隨水解時(shí)間的增加水解度不斷增加，當(dāng)時(shí)間達(dá)到3 h時(shí)，水解度基本上已經(jīng)趨于穩(wěn)定變化不是很大，抗氧化活性和水解度水解前期變化趨勢(shì)保持一致，當(dāng)水解時(shí)間達(dá)到3 h時(shí)活性達(dá)到最高，隨后隨時(shí)間增加抗氧化活性降低。原因可能是，蛋白酶水解蛋白質(zhì)是逐步水解的，當(dāng)?shù)鞍酌负偷孜锒际且欢ǖ臈l件下，蛋白質(zhì)被水解為較小的肽段，隨水解的進(jìn)行，蛋白質(zhì)中具有強(qiáng)自由基清除率的肽段被水解下來(lái)，然后進(jìn)一步被水解，導(dǎo)致部分抗氧化活性消失。因此選擇水解時(shí)間3 h為最佳水解時(shí)間。

圖5 水解時(shí)間對(duì)水解度和清除率的影響

2.6 不同底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)水解度及抗氧化活性的影響

加酶量為8 000 U/g底物，pH為8，反應(yīng)溫度為55℃，反應(yīng)時(shí)間為3 h，分別配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%、2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%的花生粕粉溶液進(jìn)行酶解，結(jié)果如6所示。當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.5%時(shí)，所得的花生多肽具有較高的水解度，對(duì)羥自由基的清除率也最大。根據(jù)酶解原理，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低時(shí)，底物不足以與所有的酶結(jié)合，一部分酶沒(méi)有結(jié)合底物，沒(méi)發(fā)揮催化作用。因此，產(chǎn)生的速度就隨著底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而增加，處于一級(jí)反應(yīng)狀態(tài)，生成的花生多肽就越多，羥自由基的清除率就越大。當(dāng)所有酶都結(jié)合了底物時(shí)，即使底物再增加，反應(yīng)速度達(dá)到飽和狀態(tài)，處于零級(jí)反應(yīng)狀態(tài)。當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)大于7.5%時(shí)，花生粕分的流動(dòng)性降低，抑制底物和酶的結(jié)合，因此反應(yīng)速率大大降低。

圖6 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)水解度和清除率的影響

2.7 酶解工藝參數(shù)的優(yōu)化

為了獲得抗氧化活性較高的花生多肽，在單因素水平基礎(chǔ)上，以加酶量、pH、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為因素，花生粕水解物的羥自由基清除率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平的二次回歸方程來(lái)擬合因素和指標(biāo)(響應(yīng)值)之間的函數(shù)關(guān)系，采取響應(yīng)面分析法(Response Surface Analysis，RSA)來(lái)尋求酶解最佳工藝參數(shù)［15］。試驗(yàn)的因素水平見(jiàn)表3，設(shè)計(jì)試驗(yàn)的結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 Box－Behnken試驗(yàn)因素水平及其編碼

表4 Box－Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)表及其試驗(yàn)結(jié)果

上述每個(gè)試驗(yàn)均進(jìn)行3次，對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值取3次試驗(yàn)結(jié)果的平均值，試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Design－Expert軟件進(jìn)行二次回歸分析，得到以下方程:

YDH=60.113 3+7.236 3A+8.433 8B+0.995 0C －11.352 9A2－9.637 9B2－ 11.180 4C2+0.347 5AB －4.865 0AC －4.610 0BC

其中A，B和C分別代表加酶量，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)和pH。通過(guò)進(jìn)行方差分析來(lái)驗(yàn)證模型及各參數(shù)的顯著度見(jiàn)表5。

表5 回歸模型方差分析

由表5可以看出，回歸方程的P＜0.01說(shuō)明花生多肽制備所建立的二次多項(xiàng)模型具有高度顯著性。模型相關(guān)系數(shù)R2為0.991 1＞0.9，說(shuō)明該模型能解釋99.11%的響應(yīng)值的變化，擬合程度良好。失擬項(xiàng)的P=0.63不顯著，說(shuō)明模型中不需要引入更高次數(shù)的項(xiàng)，模型選擇合適，可以用該模型代替試驗(yàn)點(diǎn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)［16］。

回歸方程的顯著性見(jiàn)表6，結(jié)果表明，模型中的參數(shù) A(加酶量)、B(底物質(zhì)量分?jǐn)?shù))、C(pH)、AC，BC，A2，B2，C2都是顯著的，對(duì)花生多肽的制備影響顯著。

表6 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)

為了進(jìn)一步研究相關(guān)變量之間的交互作用以及確定最優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)Design－expert軟件繪制響應(yīng)面曲線來(lái)進(jìn)行直觀的分析，見(jiàn)圖7至圖9。分別顯示了3組以清除率為響應(yīng)值的趨勢(shì)圖，從曲面圖可以直觀的反映出兩變量交互作用的顯著度。

從以上分析可知，得到清除率預(yù)測(cè)值最大的條件:底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)8.5%，加酶量8 070 U/g底物，pH 7.7，溫度55℃、時(shí)間3 h，該條件下得到羥自由基清除率為63.33%的花生多肽。

在預(yù)測(cè)條件下對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行試驗(yàn)，得到花生多肽的羥自由基清除率為62.15%，與理論預(yù)測(cè)值基本吻合，這表明模型是合理有效的。

3 結(jié)論

通過(guò)試驗(yàn)可以得知，在所選的4種蛋白酶中，堿性蛋白酶的酶解物抗氧化活性最高，因此堿性蛋白酶為制備抗氧化活性較高的花生肽的最佳用酶，通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析，確定了堿性蛋白酶制備抗氧化活性較高的花生多肽的最佳酶解條件為:底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%、加酶量8 070 U/g底物、pH 7.7、溫度55℃、時(shí)間3 h，該條件下得到的羥自由基清除率為62.15%的花生多肽。

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Study on Process Condition Optimization for Preparation of Peanut Polypeptide by Enzyme Hydrolysis

Ma Tao1，2Liu Deming1
(College of food，Shenyang Agriculture University1，Shenyang 110866)
(Liaoning Academy of Agriculture Sciences，F(xiàn)ood and Processing Institute，Shenyang 110161)

Alkaline protease，neutral protease，flavor protease and papain were used to hydrolyze peanut meal to prepare peanut polypeptides with higher antioxidant activity.With DH and E as the indices，alkaline protease was the best enzyme.Then，five factors，such as substrate concentration，proteases concentration，pH，temperature and time influence on DH and E，were investigated.Based on the results of one－factor－at－a－time－technique，a three－level Box－Behnken factorial design combining with response surface analysis(RSA)was employed to optimize the enzymatic hydrolyze condition of peanut polypeptides.The conditions were:substrate concentration 8.0%，proteases concentration 8 070 U/g per gram substrate，pH 7.7，temperature 55 ℃，and time 3.0 h.The peanut peptides scavenging rate on these conditions was 62.15%.

peanut polypeptides，enzymatic hydrolysis，antioxidant activity，optimization

TS221

A

1003－0174(2011)07－0089－06

2010－08－13

馬濤，男，1962年出生，教授，博士生導(dǎo)師，糧油食品儲(chǔ)藏保鮮與深加工

劉德明，女，1985年出生，碩士，食品科學(xué)