馮湘沅 劉正初 段盛文 鄭科 成莉鳳 鄭霞

摘要：ＣＸＪＺＵ－１２０高效菌劑在４～８℃冷藏柜中保存540 d，分段取樣進(jìn)行成活率檢測(cè)，開(kāi)展高效菌劑活化技術(shù)研究。結(jié)果表明，ＣＸＪＺＵ－１２０高效菌劑在４～８ ℃冷藏柜中保存540 d，其成活率保持在８０％以上；該菌劑活化技術(shù)具有工藝流程短、技術(shù)難度小等特點(diǎn)，采用常規(guī)培養(yǎng)基對(duì)高效菌劑進(jìn)行蘇醒與擴(kuò)增（６、８ ｈ）、誘導(dǎo)（５ ｈ）兩個(gè)步驟，即可獲得６ ｈ完成苧麻脫膠的活化菌液；確保高效菌劑活化成功的關(guān)鍵在于掌握“休眠態(tài)的高效菌劑在蘇醒與擴(kuò)增過(guò)程的適應(yīng)期長(zhǎng)短與保存期呈正相關(guān)”的技術(shù)原理。其結(jié)果可為降低企業(yè)實(shí)施苧麻生物脫膠工藝的技術(shù)風(fēng)險(xiǎn)、長(zhǎng)期保持高效菌劑的優(yōu)良性能提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：苧麻脫膠；高效菌劑；活化技術(shù)

中圖分類號(hào)：Ｓ５６３．１文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０11）15－3136-03

Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔ ｆｏｒ Ｒａｍｉｅ Ｂｉｏ－ｄｅｇｕｍｍｉｎｇ

ＦＥＮＧ Ｘｉａｎｇ－ｙｕａｎ，ＬＩＵ Ｚｈｅｎｇ－ｃｈｕ，ＤＵＡＮ Ｓｈｅｎｇ－ｗｅｎ，ＺＨＥＮＧ Ｋｅ，ＣＨＥＮＧ Ｌｉ－ｆｅｎｇ，ＺＨＥＮＧ Ｘｉａ

（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂａｓｔ Ｆｉｂｅｒ Ｃｒｏｐｓ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｃｈａｎｇｓｈａ ４１０２０５，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｔｒａｉｎ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ＣＸＪＺＵ－１２０ ｈｉｇｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｇｅｎｔ ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ ａｔ ４～８ ℃ ｉｎ ｒｅｆｒｉｇｅｒａｔｏｒ ｗｉｔｈｉｎ 540 d ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ by step dyeing． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ，ｔｈｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｔｒａｉｎ ｒｅｍａｉｎｅｄ ｏｖｅｒ ８０％ ｉｎ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｇｅｎｔ ａｆｔｅｒ 540 d， ｔｈｅ ａｇｅｎｔ ａｆｔｅｒ ａｗａｋｅｎｉｎｇ ａｎｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ６、８ ｈ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ５ ｈ ｆｉｎｉｓｈｅｄ ｒａｍｉｅ ｄｅｇｕｍｍｉｎｇ ｗｉｔｈｉｎ ６ ｈ； ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｗａｓ ｓｉｍｐｌｅ， ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ， ｏｐｅｒａｂｌｅ， ａｎｄ ｓｏ ｏｎ； ｔｈｅ ｋｅｙ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｗａｓ ｔｏ ｃｏｎｔｒｏｌ ｔｈｅ ａｄａｐｔｉｖｅ ｐｈａｓｅ ａｎｄ ｌｅｎｇｔｈ ｆｏｒ ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ａ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｔｈｅ ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｒｉｓｋ ａｎｄ ｋｅｅｐｉｎｇ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｇｅｎｔ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｒａｍｉｅ ｂｉｏ－ｄｅｇｕｍｍｉｎｇ； ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｇｅｎｔ； ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ

隨著當(dāng)今世界能源的緊缺以及國(guó)家對(duì)環(huán)保力度的加強(qiáng)，草本纖維資源的開(kāi)發(fā)已引起了人們的高度重視。鑒于草本纖維的提取沿用普遍的傳統(tǒng)和化學(xué)方法造成對(duì)環(huán)境的污染等問(wèn)題［１－２］，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所工程酶項(xiàng)目組針對(duì)草本纖維原料的特性，對(duì)從自然界分離并采用基因工程手段選育的一個(gè)高效菌株進(jìn)行了系列研究［３－５］，研究形成了“苧麻生物脫膠工藝技術(shù)與設(shè)備（ＺＬ９５１１２５６４．８）［６］”、“歐文氏桿菌工廠化發(fā)酵快速提取苧麻纖維工藝（ＺＬ ０７ １ ０３０５３４０．５）［７］”以及“一種草本纖維工廠化脫膠或制漿用高效菌劑制備方法（ＺＬ ０２ １ ０８８２０．９）［８］”等發(fā)明專利。同時(shí)，應(yīng)用這些專利技術(shù)在湖南沅江市明星麻業(yè)有限公司、湖北精華紡織集團(tuán)有限公司等單位建成了高效節(jié)能清潔型苧麻生物脫膠示范工程。

本研究在前期研究基礎(chǔ)上，專門生產(chǎn)了一批高效菌劑在適宜溫度下進(jìn)行了長(zhǎng)期保存，擬通過(guò)定期取樣進(jìn)行活化與鑒定，以期獲得高效菌劑活化技術(shù)，為降低企業(yè)實(shí)施苧麻生物脫膠工藝的技術(shù)風(fēng)險(xiǎn)、長(zhǎng)期保持高效菌劑的優(yōu)良性能提供科學(xué)依據(jù)。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１高效菌劑ＣＸＪＺＵ－１２０菌株２００５年，通過(guò)紫外線誘變歐文氏桿菌ＣＸＪＺ９５－１９８而獲得變異菌株，２００７年４月以來(lái)在高效節(jié)能清潔型苧麻生物脫膠示范工程推廣應(yīng)用的菌種。制備方法詳見(jiàn)發(fā)明專利（ＺＬ ０２ １ ０８８２０．９）說(shuō)明書。高效菌劑采用可滅菌離心管分裝，塑料真空袋外包裝，４～８℃冷藏柜保存１８?jìng)€(gè)月。

１．１．２活化培養(yǎng)基①蘇醒與擴(kuò)增培養(yǎng)基。主要組分為葡萄糖、蛋白胨、牛肉浸膏、ＮａＣｌ、保護(hù)劑，自來(lái)水配制，自然ｐＨ值，滅菌后備用；②誘導(dǎo)培養(yǎng)基。主要組分為豆餅粉、Ｋ２ＨＰＯ４、ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ、誘導(dǎo)劑，自來(lái)水配制，自然ｐＨ值，滅菌后備用。

１．２方法

１．２．１高效菌劑活化前檢測(cè)保存期分別為１、３、５、７、３０、９０、１８０、２７０、３６０、４５０、５４０ ｄ，取出高效菌劑用顯微鏡進(jìn)行觀測(cè)，主要檢測(cè)菌體草酸銨結(jié)晶紫染色深淺程度，每個(gè)樣品取５個(gè)視野數(shù)出深色菌體（活菌）、淺色菌體（軀殼或死菌）的數(shù)量，加權(quán)平均可計(jì)算出活菌所占比例；比較并記錄菌體形態(tài)是否有變化。同時(shí)，采用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定不同保存期樣品的活菌量，與分裝前高效菌劑活菌量進(jìn)行比較并計(jì)算出活菌所占比例。

１．２．２高效菌劑活化①蘇醒與擴(kuò)增。按照蘇醒與擴(kuò)增培養(yǎng)基２％的比例添加不同保存期的高效菌劑，３５ ℃，１８０ ｒ/min振蕩１０ ｈ；②誘導(dǎo)。按照誘導(dǎo)培養(yǎng)基２％的比例接種蘇醒與擴(kuò)增菌液，３５ ℃，１８０ ｒ/min振蕩５ ｈ。

１．２．３高效菌劑活化效果檢測(cè)①蘇醒與擴(kuò)增過(guò)程。采用７５５Ｂ型紫外／可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)ＯＤ６００nm變化情況［９］；②誘導(dǎo)培養(yǎng)液（活化菌液）用于苧麻生物脫膠試驗(yàn)。浴比為１∶１０，菌液稀釋５０倍，用自來(lái)水配制接種菌液，分裝到５００ ｍＬ錐形瓶中（３００～３５０ ｍＬ／瓶），預(yù)熱至３５ ℃，將３０～３５ ｇ苧麻置于接種菌液中浸泡１５ ｍｉｎ，倒出接種余液，置于３５ ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中發(fā)酵６ ｈ。按照本課題組創(chuàng)立的“麻管實(shí)效法”記錄脫膠結(jié)果。

２結(jié)果與分析

２．１高效菌劑保存過(guò)程的監(jiān)測(cè)結(jié)果

２．１．１保存過(guò)程活菌數(shù)量變化情況根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，定期取出不同保存期的高效菌劑進(jìn)行觀測(cè)，結(jié)果列于表１。由表１可見(jiàn)，兩種方法檢測(cè)不同保存期的高效菌劑成活率變化趨勢(shì)基本相同，數(shù)值比較接近。平板計(jì)數(shù)數(shù)值偏低，原因可能是極少數(shù)染色深的菌體實(shí)際成活能力不強(qiáng)；高效菌劑在４～８ ℃冷藏柜中保存540 d，依然有８０％以上的成活率；成活率下降比較快的時(shí)段在５～３０ ｄ，保存90 d以后的成活率下降幅度比較緩慢。

２．１．２保存過(guò)程菌體形態(tài)變化情況圖１為高效菌劑保存３０ ｄ稀釋１００倍樣品的隨機(jī)視野顯微照片。照片中有９０％以上、染色較深的長(zhǎng)桿狀菌體，通過(guò)平板計(jì)數(shù)，證明它們就是可以活化出來(lái)的正常菌體；同時(shí)，也有少數(shù)形態(tài)不很規(guī)則而且染色較淺的菌體，可能就是實(shí)際成活能力不強(qiáng)的菌體或者死亡的菌體軀殼。

２．２高效菌劑活化效果監(jiān)測(cè)結(jié)果

２．２．１高效菌劑蘇醒與擴(kuò)增過(guò)程ＯＤ值檢測(cè)結(jié)果如圖２所示。由圖２ 可知，保存期在540 d以內(nèi)的高效菌劑，經(jīng)過(guò)８～１０ ｈ蘇醒與擴(kuò)增，均可形成ＯＤ600nm超過(guò)１．５的活化態(tài)菌液；保存期在７ ｄ以內(nèi)的高效菌劑，其適應(yīng)期在３ ｈ左右，保存期在７ ｄ以上90 d以內(nèi)，其適應(yīng)期在４ ｈ左右，保存期超過(guò)90 d，其適應(yīng)期長(zhǎng)達(dá)５ ｈ。概括起來(lái)說(shuō)，處于休眠態(tài)的高效菌劑在蘇醒與擴(kuò)增過(guò)程的適應(yīng)期長(zhǎng)短與保存期呈正相關(guān)?？梢哉f(shuō)，這就是高效菌劑活化工藝的技術(shù)原理。只要掌握了這個(gè)原理，就能根據(jù)高效菌劑保存期的長(zhǎng)短適當(dāng)調(diào)節(jié)蘇醒與擴(kuò)增的時(shí)間，就可以獲得理想的高效菌劑活化效果。

２．２．２活化菌液用于苧麻生物脫膠試驗(yàn)將６、８ ｈ蘇醒與擴(kuò)增菌液進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)５ ｈ以后，接種到苧麻上進(jìn)行濕潤(rùn)發(fā)酵６ ｈ，觀測(cè)脫膠效果見(jiàn)表２。表２結(jié)果表明，保存期在540 d以內(nèi)的高效菌劑，經(jīng)過(guò)８ ｈ蘇醒與擴(kuò)增所獲得的菌液誘導(dǎo)培養(yǎng)５ ｈ以后，接種到苧麻上進(jìn)行濕潤(rùn)發(fā)酵６ ｈ，即可完成苧麻脫膠；保存期在３０ ｄ以內(nèi)的高效菌劑，經(jīng)過(guò)６ ｈ蘇醒與擴(kuò)增所獲得的菌液誘導(dǎo)培養(yǎng)５ ｈ以后，接種到苧麻上進(jìn)行濕潤(rùn)發(fā)酵６ ｈ，即可完成苧麻脫膠。

３結(jié)論

１）在４～８ ℃下保存540 d的ＣＸＪＺＵ－１２０高效菌劑還有較高成活率。結(jié)果表明，按照發(fā)明專利（ＺＬ ０２ １ ０８８２０．９）說(shuō)明書生產(chǎn)的ＣＸＪＺＵ－１２０高效菌劑，在４～８ ℃冷藏柜中保存540 d以后，成活率還有８０％以上，經(jīng)過(guò)８ ｈ蘇醒與擴(kuò)增所獲得的菌液誘導(dǎo)培養(yǎng)５ ｈ，接種到苧麻上進(jìn)行濕潤(rùn)發(fā)酵６ ｈ，即可完成苧麻脫膠。

２）ＣＸＪＺＵ－１２０高效菌劑活化技術(shù)具有工藝流程短、技術(shù)難度小等特點(diǎn)。無(wú)論是蘇醒與擴(kuò)增培養(yǎng)基還是誘導(dǎo)培養(yǎng)基的主要組分都屬于常規(guī)物質(zhì)。不同保存期的高效菌劑只需要經(jīng)過(guò)６～８ ｈ蘇醒與擴(kuò)增和５ ｈ誘導(dǎo)培養(yǎng)這兩個(gè)簡(jiǎn)單的工藝過(guò)程（累計(jì)１１～１３ ｈ），均可形成用于苧麻脫膠的活化菌液，接種到苧麻上濕潤(rùn)發(fā)酵６ ｈ就能完成苧麻脫膠。

３）ＣＸＪＺＵ－１２０高效菌劑活化的關(guān)鍵在于掌握菌劑活化技術(shù)原理。處于休眠態(tài)的高效菌劑在蘇醒與擴(kuò)增過(guò)程的適應(yīng)期長(zhǎng)短與保存期呈正相關(guān)，這就是高效菌劑活化的技術(shù)原理。結(jié)果顯示，保存期在７ ｄ以內(nèi)的高效菌劑，其適應(yīng)期在３ ｈ左右，保存期在７ ｄ以上90 ｄ以內(nèi)，其適應(yīng)期在４ ｈ左右，保存期超過(guò)90 ｄ，其適應(yīng)期長(zhǎng)達(dá)５ ｈ。結(jié)果還顯示，保存90 ｄ以上的高效菌劑經(jīng)過(guò)６ ｈ蘇醒與擴(kuò)增所獲得的菌液誘導(dǎo)培養(yǎng)５ ｈ，接種到苧麻上進(jìn)行濕潤(rùn)發(fā)酵６ ｈ，不能完成苧麻脫膠。

４討論

１）ＣＸＪＺＵ－１２０高效菌劑保質(zhì)期的界定。本試驗(yàn)僅以高效菌劑成活率、活化菌液用于苧麻脫膠的效果等指標(biāo)對(duì)不同保存期的高效菌劑進(jìn)行了活化技術(shù)研究，沒(méi)有嚴(yán)格按照保質(zhì)期的指標(biāo)要求設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，可能是一個(gè)缺陷。苧麻是一種原產(chǎn)于中國(guó)、盛產(chǎn)于中國(guó)的特色農(nóng)產(chǎn)品［１０］，通過(guò)脫膠（初加工）獲得的產(chǎn)品僅用作紡織工業(yè)等制造業(yè)的基礎(chǔ)材料，附加值不會(huì)很高，在目前的科學(xué)技術(shù)和生產(chǎn)力水平下，采用高效菌劑進(jìn)行苧麻脫膠應(yīng)該說(shuō)是合適的選擇，也是最近取得的突破性成果，但是目前國(guó)內(nèi)外沒(méi)有相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)可以借鑒。

２）ＣＸＪＺＵ－１２０高效菌劑成活率下降速率不一致的原因。根據(jù)生物活體休眠保存理論，高效菌劑成活率下降速率應(yīng)該與保存時(shí)間呈線性關(guān)系。但是，試驗(yàn)結(jié)果顯示，高效菌劑在４～８ ℃冷藏柜中保存540 ｄ，依然有８０％以上的成活率，成活率下降比較快的時(shí)段在５～３０ ｄ，保存90 ｄ以后的成活率下降幅度比較緩慢。其原因有待進(jìn)一步研究。

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