劉海燕，郭 星，許文濤，3，王洪新，田洪濤，黃昆侖，3，*

（1.江南大學(xué)食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，食品安全實(shí)驗(yàn)室，北京100083；3.農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物食用安全檢驗(yàn)監(jiān)督測(cè)試中心，北京100083；4.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定071001）

轉(zhuǎn)基因植物乳桿菌LP590體外耐受性質(zhì)的研究

劉海燕1，2，郭 星2，許文濤2，3，王洪新1，田洪濤4，黃昆侖2，3，*

（1.江南大學(xué)食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，食品安全實(shí)驗(yàn)室，北京100083；3.農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物食用安全檢驗(yàn)監(jiān)督測(cè)試中心，北京100083；4.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定071001）

植物乳桿菌是乳酸菌中的一種，它具有許多適應(yīng)于工業(yè)生產(chǎn)的優(yōu)良性質(zhì)。轉(zhuǎn)基因乳桿菌LP590是由植物乳桿菌LP為親本，插入nisin基因得到的。為了研究轉(zhuǎn)基因植物乳桿菌LP590的體外耐受性質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)以LP590作為對(duì)照，將LP590對(duì)高溫（52℃）、低溫（4℃）、乙醇（20%）、過(guò)氧化氫（2%）、氯化鈉（4mol/L）的耐受性進(jìn)行了研究。研究表明，LP590與LP在4℃和20%乙醇環(huán)境中暴露240min，兩株菌有相同的耐受性。而LP590比LP更加耐受高溫（52℃）、過(guò)氧化氫（2%）和氯化鈉（4mol/L）。從研究結(jié)果可以看出，轉(zhuǎn)基因植物乳桿菌LP590的體外耐受性總體優(yōu)于LP，這也為從整體上評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因微生物提供了依據(jù)。

乳酸菌，轉(zhuǎn)基因乳酸菌，體外耐受

乳酸菌是一類(lèi)應(yīng)用廣泛的微生物，尤其在食品工業(yè)中，它添加到食品中產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)，作為發(fā)酵劑，在釀酒和乳品生產(chǎn)中更是應(yīng)用廣泛。乳酸菌之所以被廣泛應(yīng)用，是因?yàn)樗鼰o(wú)毒安全，并且具有許多適于工業(yè)生產(chǎn)的優(yōu)良性質(zhì)，如耐熱、耐冷、耐鹽、耐受乙醇等［1］。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，為了滿(mǎn)足人們的需要出現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因的微生物。正是因?yàn)槿樗峋脑S多優(yōu)點(diǎn)使它成為食品級(jí)的表達(dá)載體，使乳酸菌在工業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮更大的作用［2］。植物乳桿菌（LP）菌株分離于保健品中，以LP菌株為親本，將抗生物防腐劑的nisin基因插入其中，成為了轉(zhuǎn)基因乳桿菌LP590，目的是使轉(zhuǎn)基因乳桿菌LP590在有生物防腐劑存在時(shí)繼續(xù)發(fā)揮益生菌的作用［3-4］。而在轉(zhuǎn)入外源基因后，該菌株LP590的體外耐受性如果受到影響，它的用途會(huì)受到極大限制，所以有必要對(duì)轉(zhuǎn)基因植物乳桿菌LP590的耐受性進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌LP（AS1.2986）、轉(zhuǎn)基因植物乳桿菌LP590（LM0230） 以上兩種菌株均由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)田洪濤老師惠贈(zèng)；MRS液體復(fù)合培養(yǎng)基和MRS瓊脂復(fù)合培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)公司。

恒溫水浴鍋 北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司；UVIKON XL-172紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 法國(guó)SECOMAM公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌懸液制備 兩株菌分別接種在MRS液體培養(yǎng)基中，厭氧培養(yǎng)16h。取培養(yǎng)好的菌液10mL用離心機(jī)低速離心，并用無(wú)菌生理鹽水洗菌2次。將菌體重懸于10mL的生理鹽水中制成菌懸液。

分別用無(wú)菌生理鹽水配制20%的乙醇、15mmol/L的過(guò)氧化氫、4mol/L的氯化鈉，備用。

1.2.2 菌數(shù)的測(cè)定 將培養(yǎng)到一定時(shí)間的菌液用生理鹽水稀釋到適當(dāng)?shù)臐舛忍荻龋缓笥肕RS瓊脂復(fù)合培養(yǎng)基涂板培養(yǎng)，24h后計(jì)數(shù)確定菌數(shù)。

1.2.3 溫度的耐受性 將裝有10mL無(wú)菌生理鹽水的試管分別放于52℃的水浴鍋和4℃的冰水混合物中，取0.1mL菌懸液分別加入其中混勻，保溫0、60、120、180、240min。

1.2.4 乙醇、過(guò)氧化氫、氯化鈉的耐受性 將裝有10mL 20%乙醇、15mmol/L的過(guò)氧化氫、4mol/L氯化鈉的試管放于37℃水浴中，各試管中分別加入0.1mL菌懸液混勻，保溫0、60、120、180、240min。在以上各個(gè)時(shí)間點(diǎn)取0.1mL培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)缓笥肕RS固體培養(yǎng)基平板厭氧培養(yǎng)16h計(jì)數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

以上實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3個(gè)平行，所得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式給出，用T檢驗(yàn)檢測(cè)兩組間差異的顯著水平，P＜0.05差異有顯著性。

2 結(jié)果與討論

2.1 LP和LP590菌株的耐熱性

結(jié)果見(jiàn)圖1。從圖中可以看出，LP590比LP菌株有較高的耐熱性，暴露240min后LP590菌株還有20%的活菌，而此時(shí)LP菌株幾乎沒(méi)有菌存活。

2.2 LP和LP590對(duì)低溫耐受性

結(jié)果見(jiàn)圖2。從圖中可以看出，2株菌對(duì)低溫的耐受性相似，都可以較好地耐受4℃低溫。

2.3 LP和LP590對(duì)20%乙醇耐受性

結(jié)果見(jiàn)圖3。從圖中可以看出，2株菌在暴露于20%乙醇240min后，都有近50%的菌存活，2株菌耐受乙醇的性質(zhì)相似。

圖1 LP和LP590的耐熱性

圖2 LP和LP590的對(duì)低溫的耐受性

圖3 LP和LP590對(duì)20%乙醇的耐受性

2.4 LP和LP590對(duì)2%過(guò)氧化氫的耐受性

結(jié)果見(jiàn)圖4。從圖中可以看出，與LP菌株相比，LP590菌株對(duì)2%的過(guò)氧化氫有較好的耐受性，暴露240min后，LP590菌株還有55%以上的菌存活。

圖4 LP和LP590對(duì)20%過(guò)氧化氫的耐受性

2.5 LP和LP590對(duì)4mol/L氯化鈉的耐受性

結(jié)果見(jiàn)圖5。從圖中可以看出，LP590和LP菌株對(duì)4mol/L氯化鈉都有較好的耐受性，而LP590的耐受性更好，暴露240min后，活菌數(shù)達(dá)95%以上。

圖5 LP和LP590對(duì)氯化鈉的耐受性

3 結(jié)論

乳酸菌的體外耐受性是衡量它是否適合工業(yè)生產(chǎn)的重要指標(biāo)之一［5］，因?yàn)樵诠I(yè)生產(chǎn)中往往會(huì)遇到極端的環(huán)境條件。比如在釀酒過(guò)程會(huì)有較高濃度的乙醇環(huán)境，在腌制醬菜時(shí)鹽濃度較高，而制備干粉的噴霧干燥過(guò)程中會(huì)有較高的溫度［3，6-8］。只有能夠耐受這些環(huán)境條件的乳酸菌才是理想的乳酸菌。從研究結(jié)果可以看出，LP590菌株的體外耐受性較好而且總體優(yōu)于其親本LP菌株，從耐受性的角度來(lái)說(shuō)轉(zhuǎn)基因菌株LP590具備經(jīng)受工業(yè)生產(chǎn)中極端環(huán)境的要求，這一結(jié)果也為從整體上研究轉(zhuǎn)基因微生物提供了依據(jù)。

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Study on tolerance to multistresses in vitro for genetically modified Lactobacillus 590

LIU Hai-yan1，2，GUO Xing2，XU Wen-tao2，3，WANG Hong-xin1，TIAN Hong-tao4，HUANG Kun-lun2，3，*
（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，College of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Laboratory of Food Safety，College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China；3.The Supervision，Inspectionamp;Testing Center of Genetically Modified Food Safety，Ministry of Agriculture，Beijing 100083，China；4.Institute of Food Science and Technology，Hebei Agricultural University，Baoding 071001，China）

Lactobacillus as lactic acid bacteria has many excellent traits，which meets the needs of industrial production.Genetically modified（GM）LP590 was obtained from LP by inserting into the gene nisin，which can resist nisin and play a role in bio-preservative.To overall assess the safety of GM LP590 and establish an evaluation model in vitro，some useful explorations were carried out.The ability of LP590 to environmental tolerance（52℃，4℃，ethanol，oxygen，and osmotic stresses）were assessed.LP590 had similar tolerance to LP in 4℃and ethano（l20%）within 240min.Notably，LP590 can more tolerate of high temperature（52℃），H2O（22%）and NaC（l4.0mol/L）than LP.The above results indicated that GM LP590 had many good biological characteristics and good prospects for industrial applications.lt was a useful and comprehensive exploration to establish a new evaluation model in vitro for genetically modified micro-organisms.

Lactobacillus；genetically modified Lactobacillus；tolerance in vitro

TS201.2

A

1002-0306（2011）02-0104-03

2010-10-14 *通訊聯(lián)系人

劉海燕（1977-），女，博士研究生，研究方向：食品營(yíng)養(yǎng)與安全。

國(guó)家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專(zhuān)項(xiàng)課題（2008ZX08011-005，2009ZX08011-011B）。