王守法，巢強國，葛 宇，*，成 姍

（1.華東理工大學生物工程學院，上海200237；2.上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗技術研究院，上海200233）

食物致敏原及其檢測技術的研究進展

王守法1，巢強國2，葛 宇2，*，成 姍2

（1.華東理工大學生物工程學院，上海200237；2.上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗技術研究院，上海200233）

近年來隨著食物過敏發(fā)病率的增加，有關食物過敏的研究越來越受人們的重視，食物過敏已成為當前食品安全領域較為突出的問題。介紹了食物致敏原的性質(zhì)、種類，詳細論述了兩類主要的食物致敏原檢測技術，并對食物致敏原檢測技術的發(fā)展趨勢和應用前景進行了展望。

食物致敏原，食物過敏，食品檢測

食物中能使機體產(chǎn)生過敏反應的物質(zhì)稱為食物致敏原，它們大多是具有酸性等電點的糖蛋白［1］，通常能耐受食品加工、加熱和烹調(diào)，并能抵抗腸道的消化作用。食物致敏原既有水溶性又有脂溶性，分子量為10～70kDa，無生物化學和免疫化學的共性，也無統(tǒng)一的氨基酸序列，傾向于耐熱、耐酸、耐酶解（果蔬致敏原例外）［2］。食物過敏是人們對食物中所含的食物致敏原產(chǎn)生的一種不良反應，在醫(yī)學上也叫做變態(tài)反應。就免疫學機制而言，食物過敏包括4個型的變態(tài)反應［3］：I型是IgE介導的超敏反應；II型即細胞毒性超敏反應，由抗細胞表面和組織表面抗原的抗體與補體途徑的一些成分及各種效應細胞相互作用，造成這些細胞和組織的損傷；Ⅲ型即免疫復合型超敏反應；Ⅳ型即T細胞介導的遲發(fā)性超敏反應，各型可同時存在。從廣義的角度來看，食物過敏可分為IgE介導和非IgE介導兩大類。

1 食物過敏的現(xiàn)狀

近年來食物過敏患者呈現(xiàn)日益增多的趨勢，流行病學研究顯示［4］，約33%的過敏反應由食物誘發(fā)，食物過敏已成為重要的食品安全問題，引起了廣泛的關注。據(jù)調(diào)查［5］，在美國約有2%～2.5%人（600萬～700萬）經(jīng)歷過食物過敏，嬰幼兒發(fā)生率約4%～6%，兒童和成人約1%～2%。在英國，食物過敏反應的發(fā)生率成人為1.4%～1.9%，兒童為5%，大約有1000萬人發(fā)病，其中100萬人反應嚴重［6］。荷蘭白種人食物過敏發(fā)生率成人為1.4%，兒童為5%～7%［7］。重慶醫(yī)科大學兒童醫(yī)院在一年內(nèi)對314名2歲以下兒童進行了食物過敏流行病調(diào)查，確診的食物過敏發(fā)病率為5.2%［8］。

過敏性疾病影響全世界近四分之一的人口，被世界衛(wèi)生組織列為21世紀重點防治的三大疾病之一。其中對食物的不良反應備受人們關注，大約30%的成年人在一生中至少有一次以上對食物不良反應的經(jīng)歷，20%～65%的過敏性腸道綜合癥和消化不良患者的病因與食物過敏有關［9］。目前尚無行之有效的方法治療食物過敏癥，而唯一公認的有效方法是避免食用會導致過敏的食物。因而就當前情況而言，充分認識可能導致過敏的食物并有效檢測出患者對何種食物會過敏就顯得尤為重要。

2 食物致敏原的種類

在致敏食物中，根據(jù)人們對不同的致敏原發(fā)生過敏機率的不同，可分為主要致敏原和次要致敏原成分，大多數(shù)過敏癥患者對主要致敏原敏感。據(jù)報道，有8類食物經(jīng)常引起過敏反應，占所有食物致敏原的90%以上［5］，它們分別為蛋、牛奶、魚類、甲殼類水產(chǎn)動物、花生、大豆、核果類食物及小麥。表1列出了幾種常見食物中毒致敏原成分。

表1 食物中常見的幾種蛋白致敏原［16］

表2 兩類致敏原檢測方法的比較

2.1 蛋類及其制品

雞蛋是兒童食物過敏反應最常見的原因之一，其陽性率在兒童食物過敏中達35%，而成人過敏也高達12%。蛋白的主要致敏原為卵類黏蛋白Gal d 1、卵白蛋白Gal d 2、卵傳鐵蛋白Gal d 3和溶菌酶Gal d 4；蛋黃的主要致敏原為卵黃蛋白。據(jù)報道［10］，在雞蛋過敏反應中，蛋白比蛋黃更易引起過敏，卵類黏蛋白為主要致敏原。

2.2 牛奶與奶制品

小于2歲的兒童的牛奶過敏率為1.6%～2.8%，50%～90%的兒童在6歲前轉(zhuǎn)為耐受［11］。牛奶主要致敏原為酪蛋白Bos d 8、β-乳球蛋白Bos d 5、α-乳白蛋白Bos d 4、牛血清白蛋白Bos d 6，其中酪蛋白的免疫原性與抗原性最強。牛奶致敏原相對穩(wěn)定，在常規(guī)處理后可保持其免疫原性。

2.3 甲殼類動物及其制品

隨著海產(chǎn)品受到越來越多人的青睞，這類食物過敏反應的報道也逐漸增多。其中，蝦致敏原備受關注，據(jù)報道0.6%～2.8%的過敏性疾病患者對蝦過敏。人們在蝦肉中檢測出至少13種IgE結(jié)合蛋白，但原肌球蛋白被鑒定為唯一的主要致敏原，相對分子質(zhì)量介于34000～39000之間。據(jù)報道，原肌球蛋白是蝦、蟹、牡蠣、烏賊等無脊椎動物的重要抗原，具有高度保守的氨基酸序列［12］。

2.4 花生及其制品

由于花生過敏反應的嚴重性及高發(fā)性，使得該致敏原引起醫(yī)療機構(gòu)的廣泛關注。據(jù)報道食物誘導的過敏反應中，花生過敏占10%～47%［13］。主要花生致敏原為Ara h 1和Ara h 2，其他相關致敏原有Ara h 3和Ara h 4；次要致敏原有Ara h 6、Ara h 7及肌動蛋白。經(jīng)ELISA抑制實驗證實Ara h 2是引起花生與榛子、杏仁等交叉反應的主要致敏原［14］。不同的食物處理方式對花生致敏原有不同影響，烘烤會提高Ara h l的含量，且使IgE抗體結(jié)合表位更易與抗體結(jié)合［15］。雖然花生與豆科植物有交叉反應蛋白，但臨床交叉反應卻不多見?；ㄉ^敏多見于對蛋、奶、核桃等過敏的個體，但并未發(fā)現(xiàn)其與核桃有交叉反應的致敏性蛋白。多數(shù)情況下，花生過敏終生存在且容易惡化。

除了主要的幾種致敏原之外，不常見的致敏食物有160多種，包括主要糧食、油菜籽、蔬菜作物以及一些加工食品（如啤酒、巧克力等）［17］。另有資料顯示，除食物本身成分致敏外，食物中含有的極微量的抗生素（如牛奶中殘留的抗生素）、食品添加劑（包括防腐劑、色素、抗氧化劑、香料、乳化劑、穩(wěn)定劑、膨松劑和保濕劑等）也會導致食物過敏，其中以人工色素、香料引起的過敏反應較為常見［18］。此外，隨著生物技術的迅速發(fā)展，轉(zhuǎn)基因食品不斷進入人類社會，轉(zhuǎn)基因食源性植物中引入了新的致敏原基因，這些人類未知的或從未經(jīng)人類食用過的成分均可能導致食物過敏。

3 食物致敏原的檢測方法

目前在實驗室里廣泛應用的對食物致敏原的檢測方法主要集中在兩個方面，即基于蛋白質(zhì)水平和基于DNA水平。由于這兩種方法的機理不同，且各有優(yōu)缺點，目前兩種方法的研究和應用都在同時進行，表2對這兩種方法的主要參數(shù)進行了比較。

3.1 基于蛋白質(zhì)的檢測方法

由于食物致敏原幾乎無一例外都屬于蛋白質(zhì)，因而蛋白質(zhì)作為其主要的分析物也具有針對性?；诘鞍踪|(zhì)的分析方法可以分為兩類：免疫分析方法和蛋白分離方法。免疫分析方法（如ELISA）因其具有高特異性及靈敏度的抗體而被多數(shù)實驗者采用，并被應用于食品工業(yè)實驗室和官方的食品控制機構(gòu)來檢測和定量食物中存在的致敏原。蛋白分離方法（如質(zhì)譜法）多數(shù)是根據(jù)蛋白質(zhì)大小的多樣性來確定致敏蛋白。

3.1.1 酶聯(lián)免疫法（ELISA） 酶聯(lián)免疫吸附分析法在致敏原的分析中尤其受歡迎。由于ELISA技術具有較強的特異性和靈敏度，且檢測限和定量限低至ppm，使之成為致敏原檢測和定量的簡單方法，可以進行相對快速和高通量的分析。它被廣泛應用于食品工業(yè)實驗室和官方食品控制機構(gòu)以檢測和定量分析致敏性食物或商品。目前，用于檢測谷物、冰淇淋和巧克力中的花生和榛子的ELISA試劑盒已得到了AOAC和歐盟聯(lián)合研究中心的認證［19］。

3.1.2 橫向流動檢測（LFT） 橫向流動檢測（Lateral Flow Test）也叫做橫向流動免疫色譜分析（Lateral Flow Immunochromatographic Assays），該方法利用免疫分析的方法快速檢測樣品或基質(zhì)中是否含有目標物，常被用于醫(yī)學診斷妊娠。該方法的檢測載體可以分為橫向流動試紙和橫向流動裝置。待測樣品經(jīng)染色后在毛細管作用下沿載體橫向流動，在經(jīng)過測試區(qū)域后含有致敏原的樣品就會被吸附在檢測區(qū)域的抗體上而使得檢測區(qū)域發(fā)生顏色反應，通過和對照區(qū)域做比較可以判定樣品中是否含有致敏原。這種技術非常適合于實驗室以外的檢測（如對清理后的食品加工生產(chǎn)線進行檢測），因為在這些檢測中往往需要快速的檢測結(jié)果且不需或只需對少數(shù)的樣品進行定量。目前該方法在食品檢測中的研究還相對較少，但也有些成功的例子，例如在2009年，Martin R?der等［20］用已有的商業(yè)化橫向流動裝置對曲奇和巧克力中的花生和榛子進行了定量檢測，結(jié)果表明其檢測的靈敏度和檢出限都接近于ELISA方法。

3.1.3 質(zhì)譜法（MS） 由于質(zhì)譜法具有檢測蛋白質(zhì)的能力，日后它很可能將會被用于確證致敏原。質(zhì)譜法通過破壞蛋白質(zhì)以提供序列信息（和基于DNA的檢測方法相比，它還可以給出種屬的特異性），同時，質(zhì)譜法對過敏原的檢測限接近于ELISA和PCR方法所能達到的水平［21］。質(zhì)譜實驗的高度自動化的特性自然可以使得該方法適用于高通量定量。但正如任何其他新的方法一樣，質(zhì)譜法對食物致敏原分析的應用前景受到設備成本高和缺少專業(yè)方法的阻礙。

3.2 基于DNA的檢測方法

盡管目前已經(jīng)開發(fā)了很多基于蛋白質(zhì)的致敏原檢測方法，但是由于食品加工過程中往往會采用高溫高壓等極端條件，使得食品中的致敏原會部分甚至全部變性。這就導致基于蛋白質(zhì)的檢測方法無法得到真實的結(jié)果。相對而言，基于DNA的致敏原檢測方法（尤其是PCR方法）則是一種更為可靠的方法。無論食品的加工過程多么復雜，只要在食品中提取出微量的致敏蛋白的DNA片斷，就可以通過適當?shù)腜CR方法進行擴增并對其進行檢測。

3.2.1 PCR/實時熒光PCR 當有多個引起過敏的食物需要檢測時，如果沒有合適的ELISA方法可選，PCR技術則是一個非常值得考慮的方法。同樣，在確認含有（或不含）致敏原的食物或商品時，PCR技術也可以對ELISA方法進行驗證分析。盡管受到來自于DNA末端殘片、殘留金屬離子、脂肪和蛋白質(zhì)的干擾作用，用PCR方法檢測含有較低水平（低于10ppm）的過敏原DNA含量依然是可行的［22］。

3.2.2 PCR-ELISA PCR-ELISA技術是利用了PCR技術的高敏感性和特異性、探針的特異性、酶標儀直接讀取結(jié)果的客觀性等優(yōu)點創(chuàng)建的一項技術。它主要由三部分組成，第一部分是聚合酶鏈式反應（PCR），第二部分是擴增產(chǎn)物與探針的雜交，第三部分即常規(guī)的ELISA的抗原抗體反應和酶標顯色。早在2002年，Thomas Holzhauser等人［23］就比較了PCR -ELISA法和ELISA法分別檢測食品中的致敏原榛子成分，并得出兩種方法均適用于檢測食物中殘留榛子成分的結(jié)論。

表2顯示，基于蛋白質(zhì)的食物致敏原檢測方法在前處理、耗時、操作等方面優(yōu)于基于DNA的檢測方法，而在穩(wěn)定性、特異性、檢出限等方面則不及基于DNA的檢測方法?？梢哉f這兩種方法各有千秋，因而在較長的時期內(nèi)它們將共存而不會替代對方。

除了以上較成熟的兩類方法以外，近年來隨著人們對食物致敏原的認識和科學技術的發(fā)展，生物傳感器（Biosensors）、放射變應性吸附法（RAST）、SDS-PAGE免疫印跡法、火箭免疫電泳（RIE）、斑點免疫印跡（Dot Immunoblotting）等多種技術被應用于食物致敏原的研究，使人們對食物致敏原的認識有了很大進步。臨床用于檢測食物致敏原的方法還有血IGG檢測、組胺釋放實驗、嗜堿性粒細胞活化實驗等，但目前尚無哪種方法能檢測出所有的食物致敏原，故臨床實踐中應采取聯(lián)合使用的方式。

4 總結(jié)與展望

致敏原的檢測對食物過敏疾病的預防和治療具有重要的意義。隨著各種檢測技術的發(fā)展，食物致敏原的檢測技術有了很大的進步，但也存在一些問題：一些致敏原對實驗條件不耐受，容易分解或變性，使得檢測結(jié)果的準確性和靈敏度受到限制；新型轉(zhuǎn)基因食物的出現(xiàn)會同時帶來未知的致敏原，需要一種全新的機制來對其致敏性進行評價；另外，一些堅果類食物、海鮮存在較嚴重的基質(zhì)效應，使得食物致敏原檢測特異性不是很強。這些都是今后亟需解決的問題。

已公開的各種食物致敏原檢測方法都只是針對特定的致敏蛋白，且往往要經(jīng)過其他方法確證后才具有較強的說服力。所以，不同方法的結(jié)合將會是今后食物致敏原檢測方法的一個發(fā)展方向，這些方法將覆蓋免疫學、分子生物學以及生物信息學等多種學科。國外包括 evaller、AllergenOnline在內(nèi)的一些網(wǎng)站已經(jīng)建立了致敏蛋白的數(shù)據(jù)庫，可以對蛋白質(zhì)的致敏性進行評估，甚至可以根據(jù)轉(zhuǎn)基因食物的基因序列來評估其致敏性。隨著理論和實踐研究的不斷深入，相信不久人們就會對食物致敏原有更深刻的認識，為今后食物過敏機制的研究、致敏原檢測試劑和檢測方法的研發(fā)提供更堅實的基礎。

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Research advances of food allergen and its detection techniques

WANG Shou-fa1，CHAO Qiang-guo2，GE Yu2，*，CHENG Shan2
（1.College of Bioengineering，East China University of Science and Technology，Shanghai 200237，China；2.Shanghai Institute of Quality Inspection and Technical Research，Shanghai 200233，China）

With the increasing incidence of food allergy，the study on which is becoming more and more important nowadays.Food allergy is becoming a highlighted problem in the field of food safety now.The characteristics and kinds of food allergens were introduced，two major technologies applied in food allergen detection were elaborated，including protein-based methods and DNA-based methods.And the trends in the development of food allergen detection and its prospect in the food safety determination were also forward commented.

food allergen；food allergy；food determination

TS201.1

A

1002-0306（2011）02-0362-04

2010-03-03 *通訊聯(lián)系人

王守法（1985-），男，碩士研究生，研究方向：食品安全與檢測。