馬 微，代漢慧，張英春，陳冬東，王海波，柳彩云，王秀君，唐英章

（1.黑龍江出入境檢驗(yàn)檢疫局，黑龍江哈爾濱150086；2.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京100123；3.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱150090）

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定減肥保健食品中非法添加藥物苯佐卡因

馬 微1，代漢慧2，張英春3，陳冬東2，王海波1，柳彩云2，王秀君2，唐英章2

（1.黑龍江出入境檢驗(yàn)檢疫局，黑龍江哈爾濱150086；2.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京100123；3.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱150090）

建立了測(cè)定減肥保健食品中非法添加藥物苯佐卡因的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。減肥咖啡、減肥茶、減肥膠囊、減肥片劑、減肥餅干等不同類(lèi)型的減肥保健食品經(jīng)超聲萃取后，以Waters Atlantis T3柱（150mm×2.1mm，3μm）分離后，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）正離子模式檢測(cè)，定性離子對(duì)為m/z166與m/z138和m/z166與m/z94，采用m/z166與m/z138進(jìn)行定量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，苯佐卡因在0.01～50μg/L的范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9985，在低、中、高的3個(gè)添加水平范圍內(nèi)的平均回收率為69.3%～95.6%。同時(shí)研究了苯佐卡因的電噴霧電離質(zhì)譜特征，推測(cè)其裂解途徑。本方法靈敏度高，操作簡(jiǎn)便，可用于不同減肥保健食品中非法添加苯佐卡因的檢測(cè)。

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜，超聲萃取，苯佐卡因，質(zhì)譜裂解途徑

苯佐卡因是一種非中樞性的食欲抑制藥，分子式為C9H11NO2，其分子結(jié)構(gòu)如圖1所示。它可以使口腔及腸胃黏膜麻木，通過(guò)影響味覺(jué)來(lái)抑制食欲，從而達(dá)到減肥的功效。然而，一些不法廠商為了追求療效，在減肥保健食品中添加了這種藥物，長(zhǎng)期服用苯佐卡因會(huì)帶來(lái)很大不良反應(yīng)，美國(guó)FDA報(bào)道了苯佐卡因容易引起高鐵血紅蛋白血癥，且有報(bào)道該藥可使過(guò)敏體質(zhì)患者發(fā)生局部或全身性的過(guò)敏反應(yīng)［1］。因此，迫切要求建立一種標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法對(duì)減肥保健食品中的非法添加藥物苯佐卡因進(jìn)行監(jiān)督和控制。對(duì)于減肥保健食品中苯佐卡因的檢測(cè)方法，目前尚無(wú)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，國(guó)內(nèi)外公開(kāi)報(bào)道的紫外分光光度法［2-3］、化學(xué)發(fā)光法［4］、氣相色譜法［5］和高效液相色譜法［6-10］等，主要針對(duì)藥物制劑、體液和組織中的檢測(cè)，沒(méi)有報(bào)道在食品中的檢測(cè)，且沒(méi)有通過(guò)質(zhì)譜方法進(jìn)行確證研究。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)不同基質(zhì)的減肥保健食品，采用超聲波萃取技術(shù)進(jìn)行提取，利用串聯(lián)四極桿質(zhì)譜的高選擇性、高靈敏度的優(yōu)勢(shì)，建立了減肥保健食品中苯佐卡因的的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。

圖1 苯佐卡因的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

苯佐卡因 德國(guó)Dr Ehrenstorfer Gmbh；甲醇HPLC級(jí)，美國(guó)Fisher公司；氮?dú)?、氬?＞99.999%；實(shí)驗(yàn)用水 經(jīng)Milli-Q凈化系統(tǒng)（0.22μm過(guò)濾膜）過(guò)濾的去離子水；其它試劑 均為分析純，北京化工廠。

ACQUITY超高效液相色譜議、XEVO三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀、Waters micromass四極桿飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜儀、MassLynx數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 美國(guó)Waters公司；KQ-600B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；MS2型漩渦振蕩器 德國(guó)IKA公司；Milli-Q超純水器 美國(guó) Millipore公司；Acrodisc GHP雙性濾膜 美國(guó)Pall公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件 Waters Atlantis T3柱（150mm× 2.1mm，3μm）；流動(dòng)相：甲醇∶水，梯度洗脫：0～8min，20%～95%甲醇；8～9min，95%～20%甲醇；9～12min，20%甲醇；流速0.2mL/min，柱溫30℃；樣品室溫度20℃；進(jìn)樣量為5μL。

1.2.2 三重四極桿質(zhì)譜條件 電噴霧離子源；正離子掃描；毛細(xì)管電壓3.5kV；射頻透鏡電壓0.5V；離子源溫度150℃；去溶劑氣溫度500℃；去溶劑氣流量800L/h；錐孔氣流量50L/h；光電倍增器電壓650V；碰撞氣體為氬氣，碰撞氣壓2.8×10-4Pa，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式檢測(cè)，質(zhì)譜分析參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 苯佐卡因的質(zhì)譜分析參數(shù)

1.2.3 四極桿-飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI）；采用正離子模式檢測(cè)；毛細(xì)管電壓3.0kV；離子源溫度100℃；去溶劑氣溫度350℃；去溶劑氣流量600L/h；錐孔氣流量50L/h；碰撞氣體為氬氣；微通道板電壓1800V，每0.1s采集一次譜圖，質(zhì)量掃描范圍m/z100～500。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱(chēng)取苯佐卡因10.0mg，用甲醇溶解并稀釋?zhuān)渲瞥蓾舛葹?.0g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，-18℃冰箱保存?zhèn)溆谩ＥR用時(shí)，用甲醇稀釋上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.5 樣品制備 精密稱(chēng)取不同減肥保健食品試樣0.5g置于25mL比色管中，準(zhǔn)確加入25.0mL甲醇，渦旋混勻，超聲提取15min后，過(guò)0.22μm有機(jī)微孔濾膜后上機(jī)測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)首先比較研究了甲醇∶水、乙腈∶水以及加入0.1%、0.2%甲酸，5、10mmol/L乙酸銨等二元溶劑體系作為流動(dòng)相時(shí)，苯佐卡因的儀器響應(yīng)信號(hào)和色譜峰形選擇性，結(jié)果表明甲醇-水為流動(dòng)相時(shí)苯佐卡因的質(zhì)譜響應(yīng)信號(hào)較高。又進(jìn)一步比較研究了等度洗脫和梯度洗脫對(duì)苯佐卡因色譜峰形的影響，結(jié)果表明梯度洗脫獲得了最優(yōu)的色譜分離效果，且得到基線平穩(wěn)、對(duì)稱(chēng)、尖銳的峰形，如圖2所示。

圖2 苯佐卡因的MRM圖

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化及裂解規(guī)律的研究

選用ESI+作為離子化模式，采用流動(dòng)注射泵連續(xù)進(jìn)樣方式進(jìn)行質(zhì)譜條件的優(yōu)化。對(duì)苯佐卡因的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀二級(jí)譜圖（見(jiàn)圖3）分析，苯佐卡因（m/z166）的二級(jí)質(zhì)譜碎片主要有m/z138、120、94、177。根據(jù)歐盟2002/657/EC指令規(guī)定對(duì)于質(zhì)譜確證方法必須達(dá)到4個(gè)確證點(diǎn)的要求，低分辨液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)應(yīng)在確定母離子的基礎(chǔ)上選擇兩個(gè)以上的子離子［11］。選擇離子豐度高、基線噪音低的離子對(duì) m/z166和 m/z138，m/z166和m/z94做為監(jiān)測(cè)離子對(duì)（定性離子），選擇離子豐度最高的m/z166和m/z138做為定量離子。

圖3 苯佐卡因的二級(jí)質(zhì)譜圖

根據(jù)苯佐卡因的二級(jí)質(zhì)譜圖和電離噴霧電離的特點(diǎn)，推測(cè)出質(zhì)譜裂解規(guī)律，如圖4所示。由于分子離子m/z166受羰基氧原子的作用，易在?；幇l(fā)生斷裂，生成豐度最高的碎片離子m/z138；由于電離噴霧這種軟電離技術(shù)容易丟失中性小分子，如：H2O、CO2等［12］，離子m/z138脫掉一分子CO2生成碎片離子m/z94；也可以脫掉一分子H2O生成碎片離子m/z120；隨著碰撞能量的加大，離子m/z94脫掉側(cè)鏈NH3生成碎片離子m/z77。

圖4 苯佐卡因的質(zhì)譜裂解途徑

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

電離噴霧離子化效率容易受樣品基質(zhì)的影響。本實(shí)驗(yàn)用離子抑制率，即基質(zhì)空白中添加監(jiān)控離子響應(yīng)強(qiáng)度比標(biāo)準(zhǔn)溶液中相應(yīng)監(jiān)控離子響應(yīng)強(qiáng)度減少的百分比，來(lái)表述樣品基質(zhì)對(duì)監(jiān)控離子響應(yīng)強(qiáng)度的抑制作用，結(jié)果見(jiàn)表2。以減肥咖啡、減肥茶、減肥膠囊、減肥片劑、減肥餅干等為基質(zhì)空白，分別添加1.0mg/kg苯佐卡因標(biāo)準(zhǔn)品，與1.0mg/kg苯佐卡因標(biāo)準(zhǔn)品比較，進(jìn)行監(jiān)控離子抑制率實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在減肥咖啡、減肥茶中由于存在大量的多酚和堿類(lèi)物質(zhì)等成分而對(duì)苯佐卡因電噴霧離子化效率有一定的干擾，因此，對(duì)于減肥咖啡、減肥茶的樣品需要在其基質(zhì)上配制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表2 不同樣品基質(zhì)對(duì)苯佐卡因的抑制作用

2.4 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線和線性范圍

在選定的色譜條件和質(zhì)譜條件下對(duì)一系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液分別進(jìn)樣5μL，平行測(cè)定3次。以苯佐卡因的峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，苯佐卡因的質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析，由實(shí)驗(yàn)得出苯佐卡因在質(zhì)量濃度0.01～50μg/L的范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，回歸方程為Y=26836.7X-3018.82，相關(guān)系數(shù)為0.9985，逐級(jí)稀釋苯佐卡因標(biāo)準(zhǔn)溶液，以10倍信噪比為基準(zhǔn)，儀器的定量限（LOQ）為0.03μg/L，以信噪比為3估算檢出限（LOD）為0.01μg/L。

表3 不同基質(zhì)減肥保健品中苯佐卡因添加回收率結(jié)果（n=6）

2.5 添加回收率實(shí)驗(yàn)

回收率實(shí)驗(yàn)針對(duì)減肥咖啡、減肥茶、減肥膠囊、減肥片劑、減肥餅干等不同類(lèi)型的減肥保健食品設(shè)定了3個(gè)添加濃度，每個(gè)濃度進(jìn)行6次重復(fù)，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.6 樣品測(cè)定

應(yīng)用本方法對(duì)30種不同基質(zhì)類(lèi)型減肥保健食品進(jìn)行了分析測(cè)定，均未檢出含有苯佐卡因。

3 結(jié)論

本文建立了不同基質(zhì)類(lèi)型的減肥保健食品中非法添加苯佐卡因的準(zhǔn)確定性和定量檢測(cè)方法。該方法前處理簡(jiǎn)便、不需濃縮、結(jié)果準(zhǔn)確，符合現(xiàn)代分析技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)。

［1］孫玉，沈良駿.苯佐卡因高分子載體藥物及其納米微球的合成［J］.合成化學(xué)，2007，15（3）：382-384.

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［11］Commission of the European Communities.Implamenting council directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results，2002/657/EC［EB/OL］.http：//www.wetgiw.gov.pl/old/U E/p raw o/02_657/ e02657.pdf.

［12］王光輝，熊少祥.有機(jī)質(zhì)譜解析［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.

HPLC-MS/MS determination of illegal drug benzocaine added in weight-loss functional foods

MA Wei1，DAI Han-hui2，ZHANG Ying-chun3，CHEN Dong-dong2，WANG Hai-bo1，LIU Hai-yun2，WANG Xiu-jun2，TANG Ying-zhang2
（1.Heilongjiang Entry-Exist Inspection and Quarantine Bureau，Haerbin 150086，China；2.National Academy of Inspection and Quarantine，Beijing 100123，China；3.Food Science and Engineering College of Harbin Institute of Technology，Harbin 150090，China）

A comprehensive analytical method based on high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry was developed for the determination of benzocaine.Various weight-loss functional foods，including weight-loss coffee，tea，capsule，tablet and biscuit were extracted under ultrasonication and were separated on Waters Atlantis T3（150mm ×2.1mm，3μm）column.Benzocaine was detected by MS/MS technique using positive electrospray ionization and multiple reaction monitoring（MRM）mode，and employing two precursor-product ion pairs：m/z166 and m/z 138，m/z166 and m/z 94，as qualitative ion pairs，m/z166 and m/z 138 as quantification ion pairs.The results showed that the calibration curve showed good linearity for benzocaine in the ranges of 0.01～50μg/L，and the correlative coefficient was 0.9985.The mean recoveries at the three spiked levels（low，middle，high）were 69.3%～95.6%.The mass spectrum characterization of benzocaine and speculated on fragmentation pathways were also studied.The method is sensitive，simple and adapt to the determination of benzocaine in the different weight-loss functional foods.

HPLC-MS/MS；ultrasonication extraction；benzocaine；mass spectrum fragmentation pathways

TS207.3

A

1002-0306（2011）02-0353-04

2009-11-16

馬微（1978-），女，博士，工程師，研究方向：食品安全。

國(guó)家科技支撐計(jì)劃農(nóng)業(yè)領(lǐng)域課題（2006BAD27B02）。