胡鮮寶，呂加平，劉 鷺，范貴生，張書文，閆 坤，謝躍杰

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京100193；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010018）

葵花粕中綠原酸檢測(cè)方法的建立

胡鮮寶1，2，呂加平1，*，劉 鷺1，范貴生2，張書文1，閆 坤1，謝躍杰1

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京100193；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010018）

在分析高效液相色譜法（HPLC）和紫外分光光度法（UV）的基礎(chǔ)上，通過運(yùn)用Origin8.0數(shù)據(jù)處理分析軟件，建立了一種快速、有效、準(zhǔn)確的葵粕綠原酸（CGA）檢測(cè)方法。結(jié)果表明：這兩種方法測(cè)定的已知濃度CGA的含量符合方程：Y=1.386+0.4082X+0.0132X2-8.438X3，R2=0.9856，其中X為UV測(cè)定結(jié)果，Y為HPLC測(cè)定結(jié)果，并通過驗(yàn)證，在5.5～33μg/mL濃度范圍內(nèi)，該方程準(zhǔn)確可靠，從而可以實(shí)現(xiàn)UV法快速、準(zhǔn)確地測(cè)量大批量樣品中的CGA含量。

綠原酸，UV法，HPLC法，檢測(cè)

綠原酸（CGA）又名咖啡鞣酸，是植物在有氧呼吸過程中產(chǎn)生的一種由咖啡酸（caffiec acid）與奎尼酸（quinic acid）組成的酯類物質(zhì)［1］，分子式C16H18O9，分子量345.30［2］。綠原酸具有較強(qiáng)的藥理活性，它具有預(yù)防II型糖尿病和心血管疾病的功能［3-4］。而且據(jù)報(bào)道，綠原酸有抗病毒、抗細(xì)菌和抗真菌作用，并且毒副作用較低［5-7］。綠原酸主要存在于杜仲葉、金銀花和向日葵中，據(jù)報(bào)道向日葵栽培品種中綠原酸含量為1.1%～4.5%，平均為2.8%［8］，我國(guó)有豐富的葵粕資源，對(duì)葵粕中綠原酸進(jìn)行研究，不僅可以促進(jìn)向日葵資源的綜合開發(fā)利用，而且可解決向日葵產(chǎn)區(qū)葵粕積壓?jiǎn)栴}。隨著對(duì)CGA研究廣泛、深入的開展，進(jìn)行CGA分析檢測(cè)是各項(xiàng)研究開展的前提和基礎(chǔ)。目前國(guó)內(nèi)外定性和定量分析CGA的方法主要有紫外分光光度法（UV）、高效液相色譜法（HPLC）、熒光光度法、薄層色譜掃描法和毛細(xì)管電泳法（CE），其中UV法和HPLC法是最為常用和經(jīng)典的分析方法。HPLC法具有高靈敏度、高準(zhǔn)確度和高分離效果，但是比較費(fèi)時(shí)并且費(fèi)用較高，不適合常規(guī)檢測(cè)。UV法價(jià)格便宜，操作簡(jiǎn)便快速，國(guó)內(nèi)有好多學(xué)者利用UV分析CGA，但是該法易受各種雜質(zhì)的干擾，造成測(cè)定結(jié)果誤差較大。因此，亟待建立一種客觀、快速、簡(jiǎn)便的測(cè)定方法，本研究試圖采用UV和HPLC相結(jié)合的方法對(duì)CGA含量進(jìn)行測(cè)定，并通過曲線擬合，建立數(shù)學(xué)模型，用HPLC測(cè)定的結(jié)果對(duì)UV進(jìn)行修正，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葵花仁 內(nèi)蒙古恒信商業(yè)有限責(zé)任公司；石油醚 天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心；乙醇 北京化工廠；去離子水 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)；綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品Sigma公司。

UV2300紫外分光光度計(jì) 上海天美科學(xué)儀器有限公司；6410液相色譜-質(zhì)譜連用儀 配有電噴霧離子源（ESI），美國(guó)Agilent科技公司；Anke LXJ-IIB離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；JA2003N電子天秤 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 葵粕中綠原酸的提取 葵花籽→粉碎→浸提去油→濕粕低溫干燥→醇提→過濾→離心→檢測(cè)

1.2.2 最大吸收波長(zhǎng)的測(cè)定 將綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成濃度為 0.05mg/mL，用紫外分光光度計(jì)在200～1000nm掃描，由計(jì)算機(jī)讀出最大吸收波長(zhǎng)。

1.2.3 液質(zhì)連用（HPLC-MS）對(duì)提取物中的綠原酸進(jìn)行定性分析

1.2.3.1 色譜條件 色譜柱：ZORBAX SB-C18（2.1× 30mm，3.5μm）；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：2μL；流動(dòng)相：0.5%乙酸溶液∶乙腈=90∶10。

1.2.3.2 質(zhì)譜條件 電噴霧電離源（ESI）；負(fù)離子檢測(cè)；流速：0.3mL/min；噴霧壓力：120V；掃描方式（SIM模式）；m/z：354。

1.2.4 綠原酸紫外檢測(cè)方法的建立

1.2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱定綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品5mg，用95%乙醇定容到50mL，搖勻后，取0.5、0.75、1.0、1.25、2.0、2.5mL分別置于10mL容量瓶中，并且用95%乙醇稀釋到刻度。以95%乙醇為參比液，在327nm處測(cè)定各濃度的吸光值A(chǔ)。以綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品濃度C為橫坐標(biāo)，以其吸光度為縱坐標(biāo)繪圖，得回歸方程。

1.2.4.2 回收率的測(cè)定 在樣品制備液中加入一定濃度的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，在已經(jīng)測(cè)定的最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度OD，根據(jù)回歸方程計(jì)算回收率。B=A1/A2（式中：B-回收率，A1-實(shí)測(cè)量，A2-加入量）采用加樣回收法。取適量已知含量的同一批號(hào)樣品，分別精密加入一定量的綠原酸對(duì)照品，依方法操作測(cè)定，同法重復(fù)實(shí)驗(yàn)5次，測(cè)得綠原酸的平均回收率。

1.2.5 綠原酸高效液相色譜檢測(cè)方法的建立

1.2.5.1 液相色譜條件 色譜柱：C18柱（250mm× 4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：0.5%乙酸溶液∶乙腈=90∶10；流速：1.0mL/min；柱溫：35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：327nm；進(jìn)樣量：10μL。

1.2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程 稱取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品0.02g（精確至0.0001g）于100.0mL容量瓶中，加流動(dòng)相溶解并定容至刻度，混勻，此標(biāo)準(zhǔn)使用液在4℃冰箱中儲(chǔ)存，分別吸取此標(biāo)準(zhǔn)使用液，用流動(dòng)相稀釋并在容量瓶中定容的濃度分別為 2.0、10.0、20.0、40.0、80.0μg/mL標(biāo)準(zhǔn)系列，以綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品濃度C為橫坐標(biāo)，以其吸光度為縱坐標(biāo)繪圖，得回歸方程。

1.2.5.3 回收率實(shí)驗(yàn) 采用1.2.4.2所用回收率測(cè)定方法。

1.2.6 擬合方程的建立 在UV檢測(cè)方法和HPLC檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上，以CGA標(biāo)準(zhǔn)品為檢測(cè)樣品，通過運(yùn)用Origin8.0數(shù)據(jù)處理分析軟件，建立UV測(cè)定結(jié)果與HPLC測(cè)定結(jié)果之間的數(shù)學(xué)模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長(zhǎng)的測(cè)定

在200～1000nm對(duì)CGA標(biāo)準(zhǔn)品掃描，從圖1可以看出，CGA在327nm處有最大吸收峰。

2.2 綠原酸定性分析

為了對(duì)提取物中的綠原酸進(jìn)行定性分析，采用負(fù)離子檢測(cè)，建立綠原酸定性分析方法，其質(zhì)譜采用SIM模式，在m/z為354處有比較強(qiáng)的響應(yīng)，根據(jù)其質(zhì)譜特征，可以判斷該組分為綠原酸，圖2和圖3分別為葵粕提取液和標(biāo)準(zhǔn)品SIM譜圖。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)液UV掃描圖

圖2 葵粕綠原酸提取液SIM圖譜

圖3 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品SIM譜圖

2.3 UV法對(duì)CGA的測(cè)定

根據(jù)朗伯比爾定律，在一定濃度范圍內(nèi)吸光度值與樣品濃度成正比，由圖4可知，CGA濃度在0.01～0.03mg/mL時(shí)有良好的線性關(guān)系，并求得線性回歸方程為Y=0.0169X+0.0002，R2=0.9952。通過表1可知UV法的平均加樣回收率為1.16%，可見UV法具有一定的準(zhǔn)確度。

圖4 UV法測(cè)CGA標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1 UV法CGA回收率表

2.4 HPLC法對(duì)CGA的測(cè)定

通過計(jì)算得HPLC法測(cè)定葵花粕中CGA線性方程為：Y=0.09946+0.22857X，R=0.99984，方程顯著性水平是0.0001。并且由圖5可知，CGA在2～80μg/mL的濃度范圍內(nèi)是線性相關(guān)的，并且具有良好的線性關(guān)系。通過表2可知，HPLC法的平均加樣回收率為95.8%，說明HPLC法比較準(zhǔn)確和可信。

圖5 HPLC法測(cè)CGA標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 HPLC法CGA回收率表

2.5 擬合曲線的建立

為了找到HPLC法和UV法測(cè)定結(jié)果之間的關(guān)系，采用了線形擬合、指數(shù)擬合和多項(xiàng)式擬合的方法，線性擬合見圖6，擬合方程為：Y=0.9738X-3.8567，R2=0.9849，其中X軸為UV測(cè)定結(jié)果，Y軸為HPLC測(cè)定結(jié)果。指數(shù)擬合見圖7，其擬合方程為Y=y0+Ae-x/t，y0=-2.01327E7，A=2.01327E7，t= -2.06734E7，R2=0.98357。多項(xiàng)式擬合見圖8，其方程為Y=A+BX+CX2+DX3，A=1.386，B=0.4082，C=0.0132，D=-8.434，R2=0.9856。從上述擬合結(jié)果可以看出，HPLC法和UV法所測(cè)得結(jié)果存在差異，并且在一定的范圍內(nèi)，UV所測(cè)得結(jié)果要大于HPLC所測(cè)得的結(jié)果，其主要原因是在UV測(cè)量的過程中，除了綠原酸以外，其他的酚類物質(zhì)在327nm處也有吸收，從而為UV測(cè)定帶來了誤差，為了提高UV測(cè)定法的準(zhǔn)確性，采用Origin8.0對(duì)這兩種方法進(jìn)行擬合，結(jié)果表明多項(xiàng)式擬合的相關(guān)系數(shù)（R2=0.9856）略高于線性擬合（R2=0.9849）以及指數(shù)擬合（R2= 0.98357），由此選 Y=1.386+0.4082X+0.0132X2-8.438X3為最佳擬合方程。

圖6 線性擬合圖

2.6 擬合方程的驗(yàn)證

在以CGA標(biāo)準(zhǔn)品為檢測(cè)樣品建立了擬合方程后，利用UV法對(duì)醇提液中的CGA進(jìn)行測(cè)定，經(jīng)擬合方程校正CGA的含量，并通過HPLC對(duì)計(jì)算結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明在一定的濃度范圍內(nèi)（5.5～33μg/mL），樣品經(jīng)擬合方程校正的濃度值與HPLC法所測(cè)得的結(jié)果相近，t檢驗(yàn)的結(jié)果表明，在0.05水平下，兩組數(shù)據(jù)之間沒有顯著差異（p=0.6722）。

圖7 指數(shù)擬合圖

圖8 三次多項(xiàng)式擬合圖

紫外分光光度法是一般常規(guī)實(shí)驗(yàn)室常采用的檢測(cè)方法。但是提取液中成分復(fù)雜多樣，存在各種雜質(zhì)的干擾，造成測(cè)定結(jié)果誤差很大。高效液相色譜法以其高速、高效、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)在檢測(cè)應(yīng)用中逐漸增多，但缺點(diǎn)是利用HPLC檢測(cè)需要時(shí)間較長(zhǎng)，并且成本較高。國(guó)內(nèi)一些學(xué)者雖然對(duì)紫外可見分光光度法和高效液相色譜法對(duì)綠原酸的含量的測(cè)定有過研究和比較［9］，但是卻沒有對(duì)UV測(cè)定進(jìn)行校正，本研究給出UV法測(cè)定CGA含量的擬合方程，方程表明，在一定濃度范圍內(nèi)（5.5～33μg/mL），該方程準(zhǔn)確可靠，從而可以實(shí)現(xiàn)UV法快速、準(zhǔn)確地測(cè)量大批量樣品中的CGA含量。在實(shí)際操作中，建議將CGA濃度控制在推薦的范圍內(nèi)，如果濃度過低或過高，需要適當(dāng)?shù)貪饪s或稀釋，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

表3 多項(xiàng)式擬合結(jié)果驗(yàn)證

3 結(jié)論

3.1 建立了CGA的UV檢測(cè)方法，當(dāng)CGA濃度在0.01～0.03mg/mL時(shí)有良好的線性關(guān)系，并求得線性回歸方程為Y=0.0169X+0.0002，R2=0.9952。

3.1 建立了 CGA的 HPLC檢測(cè)方法，CGA在2～80μg/mL的濃度范圍內(nèi)是線性相關(guān)的，線性方程為Y=0.09946+0.22857X，R=0.99984，方程顯著性水平是0.0001。

3.3 在線性、指數(shù)、三次多項(xiàng)式曲線擬合的方法中，多項(xiàng)式擬合Y=1.386+0.4082X+0.0132X2-8.438X3為最佳擬合方程，其中Y為HPLC測(cè)定值，X為UV測(cè)定值，R2=0.9856。并且在5.5～33μg/mL濃度范圍內(nèi)，樣品經(jīng)擬合方程換算成的濃度與HPLC測(cè)定結(jié)果相近，并在0.05水平下，兩組數(shù)據(jù)之間沒有顯著差異（p=0.6722）。

［1］Michool N Clifford.Chlorogenic acids and other cinnamatesnature，occurrence and dietary burden，absorption and metabolism［J］.Journal of the Science of Food and Agriculture，2000，80（7）：1033-1043.

［2］陳永勝，李志光，董建國(guó).酶解法提取葵花粕綠原酸工藝研究［J］.食品科學(xué)，2008，29（2）：202-204.

［3］Paynter Nina P，Yeh H C，Voutilainen S，et al.Coffee and Sweetened Beverage Consumption and the Risk of Type 2 Diabetes Mellitus［J］.American Journal of Epidemiology，2006，164（11）：1075-1084.

［4］Lincoln W Morton，Rima Abu-Amsha Caccettah，Ian B Puddey，et al.Chemistry And Biological Effects Of Dietary Phenolic Compounds：Relevance To Cardiovascular Disease［J］. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology，2000，27（3）：152-159.

［5］Jassim S A，Naji M A.Novel antiviral agents：a medicinal plant perspective［J］.Journal of Applied Microbiology，2003，95（3）：412-427.

［6］De Sotillo，D Rodriguez，Hadley M，et al.Potato Peel Extract a Nonmutagenic Antioxidant with Potential Antimicrobial Activity［J］.Journal of Food Science，1998，63（5）：907.

［7］Bowels，Bobby L，Miller，et al.Caffeic Acid Activity Against Clostridium botulinum Spores［J］.Journal of Food Science，1994，59（4）：905.

［8］Dorrell D G.Chlorogenic acid content of meal from cultivated and wild sunflowers［J］.Crop Seience，1976，16（5-6）：422-424.

［9］烏蘭，張澤生.金銀花中綠原酸的提取及檢測(cè)［J］.食品科學(xué)，2005，26（6）：130-134.

Study on chlorogenic acid determination method from sunflower seed meal

HU Xian-bao1，2，LV Jia-ping1，*，LIU Lu1，F(xiàn)AN Gui-sheng2，ZHANG Shu-wen1，YAN Kun1，XIE Yue-jie1
（1.Institute of Agro-food Science and Technology，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193，China；2.Food Science and Engineering Department，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot 010018，China）

ln order to create a kind of quickly，effective and precise chlorogenic acid（CGA）determination method，on the basis of HPLC and UV methods，Origin8.0-statistical analysis software was adopted to build a fitted equation with HPLC results as Y value，and with UV result as X value.The equation was obtained as：Y=1.386+ 0.4082X+0.0132X2-8.438X3，R2=0.9856.According to confirmatory test results，in the 5.5～33μg/mL concentration range，the fitted equation was precise and reliable.And so the modified UV method can determine CGA quickly，precisely and with large quantities.

chlorogenic acid；UV method；HPLC method；determination

TS207.3

A

1002-0306（2011）02-0341-04

2010-03-09 *通訊聯(lián)系人

胡鮮寶（1984-），男，碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工。

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資助項(xiàng)目。