支曉芳，李曉敏，戴新華，弓愛君，*，方 向

（1.北京科技大學應用科學學院，北京100083；2.中國計量科學研究院，北京100013）

固相萃取-離子對色譜法測定醬油與黃豆醬中的三聚氰胺

支曉芳1，李曉敏2，戴新華2，弓愛君1，*，方 向2

（1.北京科技大學應用科學學院，北京100083；2.中國計量科學研究院，北京100013）

建立了固相萃取-離子對色譜法測定醬油與黃豆醬中的三聚氰胺。樣品經(jīng)甲醇提取，Waters MCX固相萃取柱凈化。分析時用Inertsill ODS-SP C18色譜柱（5μm，4.6×250mm）分離。水（緩沖液：0.01moL/L檸檬酸+0.01moL/L辛烷磺酸鈉，pH=3.0）∶乙腈=92∶8（V/V）溶液為流動相，流速1.0mL/min，在紫外波長240nm下檢測。三聚氰胺在0.02～2.00mg/L的范圍內(nèi)，有良好的線性關系（r2=0.9999），方法檢出限為1.0mg/kg，加標回收率在83.5%～109.3%范圍內(nèi)，相對標準偏差小于5.0%。

三聚氰胺，醬油，黃豆醬，固相萃取，離子對色譜

三聚氰胺（melamine）簡稱三胺，學名三氨三嗪，別名蜜胺、氰尿酰胺、三聚酰胺，分子式為C3N6H6，是一種重要的氮雜環(huán)有機化工原料，具有腎毒性。三聚氰胺非法添加的根本原因是由于目前乳制品、豆制品等食品中蛋白含量檢測采用的凱氏定氮法，是通過測量樣品中總氮（包括蛋白氮和非蛋白氮）折算為蛋白含量，不能區(qū)分這種偽蛋白氮，給非法添加非蛋白質(zhì)氮帶來可乘之機。因此，如何快速、準確地分析食品中的三聚氰胺成為食品企業(yè)、食品監(jiān)管機構(gòu)和廣大民眾密切關注的問題。文獻報道的三聚氰胺的檢測方法有 HPLC法、HPLC-MS/MS法、GC-MS［1-4］法，但醬油與黃豆醬中三聚氰胺的檢測尚未見報道。醬油和黃豆醬系大豆制品，是我國傳統(tǒng)的、廣泛使用的調(diào)味品，它們的成分比較復雜，除食鹽外，還有氨基酸、糖類、有機酸、色素及香料等成分，尤其是醬油和黃豆醬含有大量的色素及蛋白，在進行液相色譜分離前，必須進行前處理才能避免基質(zhì)的干擾，同時延長色譜柱的使用壽命。由于三聚氰胺是強極性化合物，在傳統(tǒng)的C18反相柱上保留很差，因此，需在流動相中加入離子對試劑以改善其色譜保留行為。本文采用乙腈和0.01moL/L檸檬酸和辛烷磺酸鈉組成的離子對緩沖液為流動相，樣品用混合型陽離子固相萃取柱凈化，能很好地富集目標物，并與其它干擾物達到基線分離，回收率良好。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

三聚氰胺標準品 純度≥99.6%，擴展不確定度0.5%，中國計量科學研究院研制；甲醇、乙腈 均為色譜純，美國TEDIA公司；辛烷磺酸鈉、檸檬酸 純度≥99%，Alfa Aesar公司；氨水 分析純，北京化工廠；乙酸 分析純，比利時ACROS公司；水 超純水，Milli-Pore超純水器制備。

LC-20AT液相色譜 DAD檢測器SPD-M20A、四元泵，島津公司；美國Waters MCX固相萃取柱500mg，6mL；CP324S分析天平 德國Sartorius公司。

1.2 色譜條件

色譜柱：Inertsill ODS-SP C18色譜柱（5μm，4.6× 250mm）；流動相：A為100%乙腈，B為離子對緩沖液（由0.01moL/L檸檬酸及辛烷磺酸鈉組成，pH為3.0），乙腈∶離子對緩沖液 =92∶8（V/V）；流速：1.0mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：240nm；進樣量：20μL。此條件下三聚氰胺標準品溶液HPLC色譜圖如圖1。

圖1 三聚氰胺標準品溶液HPLC色譜圖

1.3 樣品前處理

1.3.1 醬油提取 稱取5g（精確至0.01g）試樣于50mL具塞塑料離心管中，加入40mL甲醇，劇烈振蕩提取6～7min，加水定容至滿刻度，充分混勻后靜置10min，4000r/min離心10min（4℃），上清液待凈化。

1.3.2 黃豆醬提取 稱取30g（精確至0.01g）試樣于小燒杯中，加入20g水（精確至0.01g），用均質(zhì)器勻漿15min。稱取5g（精確至0.01g）勻漿后的式樣于50mL具塞塑料離心管中，加入5mL水（70℃），充分混勻，超聲提取6min，加入30mL甲醇，再劇烈振蕩提取6～7min，加水定容至滿刻度，充分混勻后靜置10min，8000r/min離心10min（4℃），上清液待凈化。

1.3.3 凈化 用Waters MXC固相萃取柱（500mg，6mL）凈化。先依次用3mL甲醇、3mL水預處理固相萃取小柱，分別吸取“1.3.1”和“1.3.2”中的待凈化液5mL過柱，控制流速0.5～1mL/min，再依次用3mL水、3mL甲醇洗滌SPE小柱，棄去所有流出液，抽干，用體積分數(shù)5%的NH3·H2O甲醇溶液5mL洗脫，抽干。洗脫液中加乙酸0.3mL，用水定容至6mL，充分混勻，靜置15min，過0.22μm濾膜，進樣測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取條件的選擇

三聚氰胺的強極性和堿性決定了其提取溶劑一般都選用極性較強的有機溶劑、緩沖溶液、有機溶劑與水的混合溶液等，如甲醇、己烷磺酸鈉緩沖液、乙腈+水溶液、甲醇+水溶液、稀鹽酸溶液等。同時由于醬油和黃豆醬中含有大量的蛋白，ODS液相色譜柱不適合直接分析含有生物大分子（如蛋白質(zhì)之類）的樣品，因此在進行提取時要加入蛋白質(zhì)沉淀劑去除蛋白質(zhì)。常用的蛋白沉淀劑有乙腈、三氯乙酸、甲醇、醋酸鉛、醋酸鋅、亞鐵氰化鉀等。本實驗嘗試使用乙腈和甲醇進行三聚氰胺的提取和去除蛋白，并進行了比較。

乙腈沉淀：通過實驗發(fā)現(xiàn)沉淀析出較少，而且醬油中含有大量的油脂，在沉淀醬油樣品中的蛋白時，有明顯的分層現(xiàn)象，取下層醬油相（加標樣品）用乙腈二次萃取后，進樣測定，發(fā)現(xiàn)二次萃取液與一次萃取液中的目標物出峰一致，峰高、峰面積相近，說明乙腈提取分層后的下層醬油相也含有三聚氰胺。進樣檢測所得色譜圖雜質(zhì)峰也較多，因此乙腈沉淀并不適用。

甲醇沉淀：經(jīng)甲醇沉淀后，樣品無分層現(xiàn)象，沉淀較多，且樣品進入色譜柱雜質(zhì)含量較少，回收率也良好。

通過比較上述兩種沉淀蛋白方法的效果，最終確定用甲醇作為三聚氰胺的提取溶劑和蛋白沉淀劑，同時也避免了對毒性較大的乙腈的使用。

2.2 凈化條件的選擇

醬油與黃豆醬樣品，基質(zhì)組成十分復雜，含有大量具有紫外吸收的物質(zhì)，例如有機酸、氨基酸、醛類及酯類等，這些物質(zhì)可能會與待測組分三聚氰胺出峰時間相同而干擾三聚氰胺的檢測。尤其醬油中含有大量色素，若不經(jīng)過凈化處理，則干擾強，色譜基線不穩(wěn)定，不利于樣品檢測，而且還會影響色譜柱壽命。因此要對樣品中的分析物作預分離和富集后才能用高效液相色譜測定。

三聚氰胺呈弱堿性（弱陽離子化合物），所以本實驗采用Waters MCX固相萃取柱凈化，Waters MCX固相萃取柱能保留堿性化合物，有效地去除樣品中的雜質(zhì)。三聚氰胺有三個氨基，有較強的極性，可以選擇極性較強的有機溶劑將其洗脫。綜合以上因素，本實驗采用體積分數(shù)為5%的NH3·H2O甲醇溶液作為洗脫液，并對使用60、150、500mg三種不同容量填料的固相萃取小柱的加標回收率結(jié)果進行了比較，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可以看出，采用60mg和150mg填料的MCX固相萃取小柱，三聚氰胺大部分都被損失了，回收率分別只有約19%和48%，產(chǎn)生過載現(xiàn)象。使用500mg填料小柱，回收率約95%，因此選用500mg填料小柱，采用體積分數(shù)為5%的NH3·H2O甲醇溶液作為洗脫液。

2.3 色譜條件的選擇

本實驗嘗試使用SCX陽離子交換色譜柱和C18反相色譜柱對三聚氰胺進行分析，比較結(jié)果如下：

圖2 SPE柱容量對回收率的影響

SCX陽離子交換色譜柱：最初流動相選用0.05mol/L KH2PO4（pH=3）緩沖液與乙腈，發(fā)現(xiàn)存在嚴重干擾，調(diào)節(jié)乙腈比例從30%到10%，干擾物對乙腈比例不太敏感，30%乙腈條件下目標峰出現(xiàn)處存在大量干擾物，在10%乙腈比例條件下目標峰與所有干擾物一起出現(xiàn)，提高乙腈比例無改善。更換為甲醇后，調(diào)節(jié)甲醇比例從10%到90%，目標峰與前后干擾物均無法完全基線分離，加標回收率約55%。

C18反相色譜柱：由于三聚氰胺是強極性化合物，在傳統(tǒng)的C18反相柱上保留效果不佳，因此，在流動相中加入離子對試劑以改善其色譜保留行為。本文采用乙腈和0.01mol/L檸檬酸和辛烷磺酸鈉組成的離子對緩沖液（pH=3）為流動相。最初選取90%的緩沖液比例，三聚氰胺在13min出峰，與前面的干擾峰剛好基線分離，但重復實驗發(fā)現(xiàn)緩沖液濃度與pH的微小差別會使三聚氰胺與前面干擾峰不能完全分離。增大緩沖液比例到95%，三聚氰胺的出峰時間為28min，雖然能與前干擾峰完全分離，但保留時間太長。最后選取緩沖液比例為92%，在此條件下三聚氰胺在17min出峰，且與前面干擾峰能完全基線分離。

本實驗最后選用C18反相色譜柱，流動相為92%的0.01mol/L檸檬酸和辛烷磺酸鈉組成的離子對緩沖液（pH=3）：8%乙腈溶液（V∶V），醬油與黃豆醬出峰情況相似，此條件下分析物與干擾物能很好地分離，不受緩沖液濃度與pH微小差別的影響。醬油與黃豆醬添加三聚氰胺時的HPLC色譜圖如圖3所示。

圖3 醬油與黃豆醬加標樣品的HPLC色譜圖

2.4 線性范圍、檢出限及回收率

配制質(zhì)量濃度為0.02，0.10，0.20，0.50，2.00mg/L的三聚氰胺系列標準溶液，按照“1.2”的色譜條件進樣檢測，并以標準品質(zhì)量濃度（x，mg/L）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標作圖，同時用最小二乘法進行線性回歸，得三聚氰胺的標準曲線如圖4所示。曲線回歸方程為Y=74109x-1287，相關系數(shù)為r2=0.9999，說明在0.02～2.00mg/L范圍內(nèi)，標準品質(zhì)量濃度與峰面積有很好的線性關系。本方法檢出限為1.0mg/kg。

圖4 三聚氰胺的標準曲線

對8份醬油樣品和8份黃豆醬樣品進行加標回收實驗，對醬油樣品，分別加入三聚氰胺標準溶液0.670、0.400、0.170、0.083mg/L四個濃度水平；對黃豆醬樣品，分別加入三聚氰胺標準溶液0.400、0.240、0.100、0.050mg/L四個濃度水平；每個加標濃度均做六個平行樣，按“1.3”樣品處理方法進行處理，測定三聚氰胺含量，計算回收率。結(jié)果如表1所示，其回收率均在83.5%～109.3%之間，RSD小于5.0%，重現(xiàn)性良好。

表1 方法回收率及精密度測定結(jié)果（n=6）

3 結(jié)論

本研究建立了醬油與黃豆醬中三聚氰胺的檢測方法。利用甲醇沉淀樣品中的蛋白并提取三聚氰胺，MCX固相萃取柱凈化去除基質(zhì)干擾，方法簡單快速，可以作為調(diào)味品中三聚氰胺檢測的參考方法。

［1］李建華，何強，孔祥虹，等.固相萃取-離子交換色譜法測定植物提取物中的三聚氰胺［J］.分析實驗室，2008，27（10）：93-95.

［2］趙永彪，李自春，劉婷，等.高效液相色譜法測定寵物食品中的三聚氰胺［J］.分析實驗室，2008，27（1）：190-192.

［3］Wendy C A，Sherri B T，Christine M K，et al.Determination of Melamine Residues in Catfish Tissue by Triple Quadrupole LCMS-MS with HILIC Chromatography［J］.Laboratory Information Bulletin，2007，23：4396.

［4］Yokley R A，Mayer L C，Rezaaiyan R.Analytical method for the Determination of Cyromazine and Melamine Residues in Soil Using LC-UV and GC-MSD［J］.J Agric Food Chem，2000，48：3352-3358.

Determination of melamine in sauce and bean-sauce with solid phase extraction and ion pair chromatography

ZHI Xiao-fang1，LI Xiao-min2，DAI Xin-hua2，GONG Ai-jun1，*，F(xiàn)ANG Xiang2
（1.School of Applide Science，University of Science and Technology Beijing，Beijing 100083，China；2.National Institute Metrology P.R.China，Beijing 100013，China）

A method was developed for the determination of melamine in sauce and bean-sauce with solid phase extraction and ion pair chromatography.Samples were extracted with methanol and purified by Waters MCX solid phase extraction column.Chromatographic analysis was performed on a lnertsill ODS-SP C18column（5μm，4.6× 250mm）with 0.01mol/L+0.01mol/L citric acid buffer（pH=3）-acetonitrile（92∶8）as mobile phase and detected at 240nm.The presented method showed good linear relationship（r2=0.9999）for melamine in the range of 0.02～2.00mg/L.The detection limit was 1.0mg/kg，and the recoveries ranged from 83.5%to 109.3%with relative standard deviation less than 5.0%.The method is fast，accurate，simple for melamine analysis.

melamine；sauce；bean-sauce；solid phase extraction；ion pair chromatography

TS207.3

A

1002-0306（2011）02-0333-03

2009-10-26 *通訊聯(lián)系人

支曉芳（1982-），女，碩士研究生，研究方向：分析化學。

國家自然科學基金（NSFC20627004）；創(chuàng)新方法工作專項項目（2008IM040200）；北京市教委產(chǎn)學研項目。