張春嬌，許文濤，，程國靈，趙維薇，戴蘊青，羅云波，黃昆侖，，*

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083；2.農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物食用安全檢驗監(jiān)督測試中心，北京100083）

轉(zhuǎn)基因玉米的多重PCR-毛細管電泳紫外檢測技術(shù)研究

張春嬌1，許文濤1，2，程國靈1，趙維薇1，戴蘊青2，羅云波1，黃昆侖1，2，*

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083；2.農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物食用安全檢驗監(jiān)督測試中心，北京100083）

建立了轉(zhuǎn)基因玉米Ly038、Mon863和Mon810的品系特異性基因多重PCR產(chǎn)物的毛細管電泳-紫外檢測方法。根據(jù)三種轉(zhuǎn)基因玉米的基因序列設(shè)計多重PCR引物，優(yōu)化PCR擴增體系和條件，以8.0g/L羥乙基纖維素為篩分介質(zhì)，用毛細管電泳-紫外檢測法同時檢測出三種玉米的品系特異性基因，11.195min內(nèi)即可完成檢測。用Origin軟件對電泳結(jié)果進行分析并得出不同范圍的DNA曲線方程，樣品出峰時間的相對誤差在1.03%～5.02%之間。并對純化前后的樣品進行了毛細管電泳分離的對照，發(fā)現(xiàn)PCR產(chǎn)物純化后更適于紫外檢測的毛細管電泳。多重PCR具有節(jié)約模板、節(jié)省試劑和縮短檢測時間的優(yōu)點，毛細管相對于傳統(tǒng)的瓊脂糖凝膠電泳，具有高效、快速、靈敏且經(jīng)濟環(huán)保的優(yōu)點，所以此方法可廣泛地應(yīng)用于食品安全檢測和臨床檢驗等領(lǐng)域中。

轉(zhuǎn)基因玉米，多重PCR，毛細管電泳，紫外檢測

表1 多重PCR引物

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

轉(zhuǎn)基因玉米 Ly038、Mon863和Mon810為實驗室自有品種；rTaq DNA聚合酶、dNTP（含 dATP、dGTP、dCTP和dTTP） TaKaRa公司；普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒 TIANGEN公司；羥乙基纖維素、Tris -base Amersco公司；引物 上海生物工程技術(shù)有限公司合成，PAGE純化。

3DCE毛細管電泳儀 安捷倫；熔融石英毛細管長46.5cm（有效長度38cm），內(nèi)徑75μm，河北永年光導(dǎo)纖維廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 CTAB法提取轉(zhuǎn)基因玉米基因組 將轉(zhuǎn)基因玉米樣品于液氮中研磨成粉末狀，稱取80mg加入到1.5mL的Eppendorf離心管中，加入1000μL CTAB溶液，65℃溫育40min，其間混勻多次，4℃下12000r/min離心10min。取上清到一新管中，加入與上清等體積的Tris飽和酚∶三氯甲烷∶異戊醇（25∶24∶1），振蕩均勻，4℃下12000r/min離心10min，并重復(fù)一次。取上清到一新管中，加入2/3體積的異丙醇［14］，-20℃條件下靜置20min，4℃下12000r/min離心10min。棄上清，加入適量的70%乙醇洗滌沉淀。吹干沉淀后用60μL無菌超純水溶解，加入2μL RNA酶，37℃消化30min后，用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳對提取的基因組進行驗證［15］。

1.2.2 引物設(shè)計 引物的選擇是PCR反應(yīng)能否成功進行的關(guān)鍵。選取三種品系的轉(zhuǎn)基因玉米DNA序列，設(shè)計多重PCR產(chǎn)物，一條引物與玉米基因組匹配，另一條引物與轉(zhuǎn)入的載體匹配。

本文設(shè)計了3對品系特異性引物，同時對三種轉(zhuǎn)基因玉米Ly038、Mon863、Mon810的品系特異性基因進行擴增，一次性完成對三種玉米成分的篩選和鑒定。多重PCR引物的設(shè)計結(jié)果見表1。

社會實踐的發(fā)展，不斷提出需要解決的新課題，推動著人類的認識不斷發(fā)展，人們在總結(jié)實踐提供的新經(jīng)驗基礎(chǔ)上，提出新理論，解決新問題。我國北方某縣在20世紀80年代開始發(fā)展大田糧食作物噴灌，不僅有效緩解了當?shù)剞r(nóng)業(yè)用水緊缺狀況，增加了城市供水，取得了實實在在的節(jié)水效益，而且在噴灌工程建設(shè)過程中充分調(diào)動多方積極性，做到了國家和地方、集體和農(nóng)民共同投入，同時將土地經(jīng)營規(guī)模適度集中，創(chuàng)造了噴灌技術(shù)的良好應(yīng)用條件，加之良好的管理維護和澆地專業(yè)隊等服務(wù)網(wǎng)絡(luò)保障了噴灌系統(tǒng)的良好運行。正是因為對噴灌技術(shù)與設(shè)備的再認識，又把這些認識再次應(yīng)用到具體的實踐中去，在新的認識水平上開展農(nóng)業(yè)節(jié)水噴灌工作，才取得了長久效益。

1.2.3 多重PCR反應(yīng)體系和條件 PCR擴增體系如下（30μL）：10×PCR buffer：3μL（10×PCR Buffer：100mmol/L Tris-HCl，500mmol/L KCl，15mmol/L MgCl2）；2.5mmol/L dNTP：2.4μL；轉(zhuǎn)基因玉米Ly038、Mon863和Mon810的品系特異性引物的終濃度依次為0.4、0.3和0.3μmol/L；Taq DNA聚合酶：0.4μL，提取的 DNA加入3μL作為模板，用 ddH2O水補足至30μL。

PCR的擴增條件如下：預(yù)變性：94℃，5min；變性：94℃，30s；退火：57℃，30s；延伸：72℃，30s；共設(shè)40個循環(huán)，終止延伸：72℃，7min。擴增結(jié)束后，用TIANGEN普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒對樣品進行純化。

1.2.4 毛細管電泳分離多重PCR產(chǎn)物 電泳開始之前要對新毛細管進行活化，前處理如下：1bar條件下（1bar=105pa）用0.1mol/L的鹽酸沖洗毛細管5min；再用去離子水沖洗5min?；罨?，在10bar的條件下填充8.0g/L的羥乙基纖維素5min。電泳緩沖液為TBE溶液（89mmol/L的 Tris，332mmol/L的硼酸，2mmol/L的EDTA，pH為7.4）。CE運行的參數(shù)如下：電泳溫度為25℃，-5.0kV下電動進樣20s，電泳的運行電壓為-15.0kV，在Sig.260/8nm和Ref.350/ 80nm處檢測。每次電泳結(jié)束后用8.0g/L的羥乙基纖維素沖洗毛細管3min，再進行下一次檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米樣品的DNA提取

采用CTAB法提取了轉(zhuǎn)基因玉米樣品的基因組，CTAB法適用于一些深加工食物中的植物基因組提?。?4］。1.0%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明（見圖1），玉米基因組的亮度良好，用Modulus多功能熒光計測定其濃度在10～15ng/μL之間，可以作為PCR反應(yīng)的模板。

圖1 轉(zhuǎn)基因玉米基因組DNA瓊脂糖電泳

2.2 多重PCR反應(yīng)體系和條件的優(yōu)化

影響多重PCR反應(yīng)的因素有很多，其中退火溫度、引物對的濃度和模板的量是比較關(guān)鍵的影響因素［16］。采用單因素實驗分別對多重PCR體系的退火溫度（56～62℃）、引物濃度（0.1～1.0μmol/L）、混合模板量（1～5μL）進行了實驗。經(jīng)過逐一優(yōu)化，得到了三種轉(zhuǎn)基因玉米的多重PCR擴增參數(shù)（詳見1.2.3）。

2.3 毛細管電泳分離條件的優(yōu)化

2.3.1 篩分介質(zhì)濃度對DNA分離的影響 篩分介質(zhì)是毛細管無膠篩分電泳能否達到分離效果的關(guān)鍵因素。本研究選取羥乙基纖維素為篩分介質(zhì)。在一定的濃度范圍內(nèi)，篩分介質(zhì)的濃度越大，DNA片段的分離效果越好，遷移時間逐漸變長，這是因為隨著篩分介質(zhì)濃度的提高，篩分孔徑逐漸減小，DNA片段的遷移阻力也隨之增大［17］。因此，要綜合分離效果和遷移時間，確定一個最適的篩分介質(zhì)濃度。本實驗選用了分子生物學(xué)實驗中最常見的 DNA Marker DL2000作為毛細管電泳的標記Marker，對篩分體系進行優(yōu)化，考察了不同質(zhì)量濃度（1.0～10.0g/L）的羥乙基纖維素對Marker的分離情況。由實驗結(jié)果（圖2）可知，當羥乙基纖維素的濃度小于5.0g/L時，DNA標準片段的電泳峰有所重疊；當濃度大于8.0g/L時，篩分介質(zhì)的粘度過大，電泳時間變長。當篩分介質(zhì)的濃度在5.0～8.0g/L之間時，隨著篩分介質(zhì)濃度的增大，Marker的各個條帶的分離度越來越好。因此，本研究選取了質(zhì)量濃度為8.0g/L的羥乙基纖維素作為CE的篩分介質(zhì)。

2.3.2 電泳電壓對DNA分離的影響 毛細管電泳的分離電壓對DNA分子的遷移時間存在一定的影響［18］。一般而言，CE分離的電場強度在300～500V/cm的范圍之間，綜合考慮分析時間和分離效果，本文選擇在320V/cm的場強下進行分離。體現(xiàn)到分離電壓，壓力為15kV，負壓運行。

在優(yōu)化好的毛細管電泳條件下，DNA Marker DL2000純化前后的CE結(jié)果見圖2。

圖2 純化前（a）后（b）DNA Marker DL2000的毛細管電泳圖

由圖2可以看出，純化前的DNA Marker的CE結(jié)果雜峰較多且峰形雜亂，無法對目的條帶進行準確地判斷。其原因可能是Marker的貯存液中含有某些在260nm處有紫外吸收的成分，從而導(dǎo)致在7min處出現(xiàn)雜質(zhì)峰且目的條帶的峰形不明顯。

純化后的DNA Marker的CE結(jié)果峰形完整，分離效果較好。DNA Marker的6個片段大小依次是100、250、500、750、1000、2000bp，而純化后的 DNA Marker共出現(xiàn)7個峰，已知Marker中的750bp的濃度大概是其它條帶濃度的兩倍，因此可以確定前5個峰分別與100、250、500、750、1000bp相對應(yīng)。6號峰和7號峰的峰形相似且峰面積較小，可能的原因有兩點：此Marker專用于瓊脂糖凝膠電泳，其靈敏度要比毛細管電泳低，在瓊脂糖上無法看到的條帶也可能會出現(xiàn)在CE的結(jié)果中，也許是Marker中混有微量的1000～2000bp之間的DNA片段所致；也有可能是2000bp的大片段DNA在純化過程中出現(xiàn)了一定程度的降解而多出一個條帶。因此，初步推測6號峰和7號峰均在2000bp左右。采用Origin軟件對Marker的前5個峰進行分析并繪圖（見圖3），求得其曲線關(guān)系方程為：y=A2+（A1-A2）/［1+（x/x0）p］，其中：A1=157.4062；A2=5145.82359；x0=12.69898；p=14.81059。6、7號峰的出峰時間依次為11.863min和12.063min，由公式計算出2000bp的出峰時間為12.2485min，6、7號峰與公式計算的出峰時間的相對誤差分別為3.15%和1.51%，故初步判斷7號峰為2000bp，6號峰是7號峰降解所致。一般而言，PCR產(chǎn)物的大小均在1000bp以內(nèi)，所以6號峰的出現(xiàn)并不會影響對PCR產(chǎn)物大小的驗證和判斷，因此，采用DNA Marker DL2000作為毛細管電泳的標記Marker是可行的，不但可以降低實驗成本，還可以提高實驗進行的普遍性。

觀察圖2（b），可以看出前4個峰的出峰時間間隔較后面的時間間隔較大，這是由于每種濃度的篩分介質(zhì)在不同范圍內(nèi)的分離效果有差異，可以推測出8g/L的篩分介質(zhì)羥乙基纖維素對于100～750bp的分離效果要優(yōu)于1000～2000bp的分離效果。因此，本文對于Marker的6個峰值（排除6號峰）做了兩組曲線：1、2、3和4號峰為一組；3、4、5和7號峰為一組，以便對樣品的CE結(jié)果進行有效的判斷。采用Origin軟件對以上兩組數(shù)據(jù)進行分析并繪圖（見圖4和圖5），其曲線關(guān)系方程分別為：y=A2+（A1-A2）/［1+（x/x0）p］和 y=A1+（A2-A1）/［1+10（logx0-x）p］第一組的參數(shù)為：A1=89.88261，A2=20148.47564，x0= 17.55886，p=7.53957；第二組的參數(shù)為：A1= 471.50899，A2= 2139.3661，Logx0= 11.52922，p=1.94856。

圖3 Marker前5個條帶的擬合曲線圖

圖4 Marker前4個條帶的擬合曲線圖

圖5 Marker后4個條帶的擬合曲線圖

2.4 PCR產(chǎn)物純化對毛細管電泳的影響

以單重PCR產(chǎn)物的原液和純化后的單重PCR產(chǎn)物做為對照，在優(yōu)化好的CE條件下進行分析分離。轉(zhuǎn)基因玉米Ly038、Mon863和Mon810的品系特異性引物的單重PCR結(jié)果的純化前后的CE結(jié)果分別見圖6～圖8。

從圖6～圖8中可以看出，3對品系特異性引物的單重PCR產(chǎn)物，純化前的CE結(jié)果的雜峰很多，且雜質(zhì)峰的出峰時間集中在6～7.5min之間。這說明PCR產(chǎn)物中含有一些除樣品以外的具有紫外吸收物質(zhì)，比如rTaq酶、Buffer、引物二聚體等等，由于其在紫外下有吸收而6～7.5min之間產(chǎn)生了雜峰。對3組樣品純化后的CE結(jié)果表明，純化不但可以有效去除雜質(zhì)峰，且在純化中樣品體積有所濃縮而增加了樣品濃度，使目的條帶的峰形更為突出。由此可見，PCR產(chǎn)物的純化對于紫外檢測的CE的分離具有很重要的作用和意義。由此可以推出，采用毛細管電泳分離多重PCR產(chǎn)物，純化有著同樣的重要性和必要性。

圖6 純化前（a）后（b）轉(zhuǎn)基因玉米Ly038單重PCR產(chǎn)物的毛細管電泳圖

圖7 純化前（a）后（b）轉(zhuǎn)基因玉米Mon863單重PCR產(chǎn)物的毛細管電泳圖

圖8 純化前（a）后（b）轉(zhuǎn)基因玉米Mon810單重PCR產(chǎn)物的毛細管電泳圖

2.5 多重PCR產(chǎn)物的毛細管電泳分離

在驗證了樣品的純化對毛細管電泳的積極作用之后，對多重PCR產(chǎn)物進行了同樣的純化操作，在優(yōu)化好的毛細管電泳條件下，對多重PCR產(chǎn)物進行分離。CE的分離結(jié)果見圖9。

由圖9可見，純化后的多重PCR產(chǎn)物，PCR反應(yīng)體系中的一些有紫外吸收的雜質(zhì)得到了有效地去除，多重PCR產(chǎn)物得到了有效的分離，其峰形明顯，分離效果良好。樣品的出峰時間依次為 7.674、9.901、11.195min，由圖4的曲線方程計算出1號樣品和2號樣品的出峰時間依次為 7.59584min和9.8325min，圖5中的曲線方程計算出3號樣品的出峰時間為11.25143min。樣品出峰時間的相對誤差依次為1.03%、0.70%和5.02%，均在10%以內(nèi)，可見此方法的準確度良好，在11.195min即可實現(xiàn)對多重PCR產(chǎn)物的分離。

圖9 多重PCR產(chǎn)物的毛細管電泳圖

3 結(jié)論

本文成功地建立了紫外檢測器下的無膠篩分毛細管電泳對多重PCR產(chǎn)物進行快速分離的方法，實現(xiàn)了對加工食物中是否含有轉(zhuǎn)基因玉米品系Ly038、Mon863和Mon810的快速檢測。采用了分子生物學(xué)實驗中常見的DNA Marker DL2000作為毛細管電泳的標記Marker，不但降低了實驗成本，而且具有簡便性、普遍性和可行性。通過進行樣品純化前后的毛細管電泳對照實驗，充分證明了純化樣品對于紫外檢測器下進行的毛細管電泳的必要性。采用優(yōu)化的毛細管電泳體系和條件，僅需11.195min即可完成對三種品系的轉(zhuǎn)基因玉米的檢測，并且將Origin繪圖軟件應(yīng)用于CE結(jié)果的分析，通過建立不同范圍的DNA曲線方程來對樣品的CE結(jié)果進行有效的判斷，驗證了檢測方法的準確度?？梢宰鳛橐环N檢測手段，為今后檢測更多品系的轉(zhuǎn)基因玉米以及轉(zhuǎn)基因作物奠定了基礎(chǔ)，也為食品安全檢測和臨床檢驗等領(lǐng)域提供了一種可靠的檢測和監(jiān)測手段。

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Study on genetically modified maize by multiplex polymerase chain reaction-capillary electrophoresis with UV detection

ZHANG Chun-jiao1，XU Wen-tao1，2，CHENG Guo-ling1，ZHAO Wei-wei1，DAI Yun-qing2，LUO Yun-bo1，HUANG Kun-lun1，2，*
（1..College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China；2.The Supervision，Inspectionamp;Testing Center of Genetically Modified Orginisms Food Safety，Ministry of Agriculture，Beijing 100083，China）

Event-specific qualitative detection of three kinds of genetically modified（GM）maize by multiplex polymerase chain reaction-capillary electrophoresis（CE）with UV detection was established.Three sets of primers were designed to amplify the event-specific fragments of GM maize events（Ly038，Mon863 and Mon810）. Multiplex PCR and the separation of CE were systematically optimized，8.0g/L hydroxyethylcellulose in trisphosphate-EDTA（TBE）buffer as sieving matrix，three event-specific multiplex PCR products were detected by CE in 11.195min.Using Origin program to analyze the CE results and also get the fitting curves of different DNA range，the relative error was between 1.03%and 5.02%.Unpurified and purified normal PCR products were also detected by CE which suggested purification of PCR products was important for CE with UV detection.Compared with normalPCR and agarose gelelectrophoresis，themultiplexpolymerasechain reaction-capillary electrophoresis method in this study was efficient，rapid，sensitive and low-cost.This event-specific detection method could be widely applied in the fields of food safety and clinical tests.

genetically modified maize；multiplex polymerase chain reaction；capillary electrophoresis；UV detection

TS207.3

A

1002-0306（2011）02-0328-05

2010-01-07 *通訊聯(lián)系人

張春嬌（1986-），女，碩士研究生，研究方向：食品安全檢測技術(shù)。

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863）項目（2006AA10Z440）；國家自然基金（30800770）；轉(zhuǎn)基因生物重大專項（2008ZX08012-001）。