白娣斯，張 靜

（陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安710062）

氣相色譜分析多糖衍生化方法的研究與比較

白娣斯，張 靜*

（陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安710062）

采用糖腈衍生化和糖醇衍生化兩種方法分析多糖組分，找出線性關(guān)系，計(jì)算摩爾比，測(cè)定加樣回收率、精密度、重復(fù)性等。糖醇衍生化中，果糖經(jīng)過(guò)還原可得到山梨醇和甘露醇的混合物，測(cè)定結(jié)果容易導(dǎo)致色譜峰的混亂，不易定性分析，并且衍生化方法反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)，操作比較麻煩。糖腈乙酸酯衍生物氣相色譜法具有衍生物制備簡(jiǎn)便、試劑易得等優(yōu)點(diǎn)，并且每種糖都能得到單一的色譜峰。通過(guò)對(duì)氣相色譜糖腈衍生化法和糖醇衍生化法的研究和比較，表明糖腈衍生化方法是氣相色譜研究食品多糖較為合適的衍生化方法。

多糖，氣相色譜，糖腈乙酰酯衍生法，糖醇醋酸鹽衍生法

近年來(lái)，人們致力于研究多糖的生理活性和它的化學(xué)結(jié)構(gòu)方面的關(guān)系，從更深層次探討多糖的作用機(jī)制。有關(guān)多糖立體構(gòu)型的改變、分子量變化、重復(fù)結(jié)構(gòu)單位主側(cè)鏈的類型以及主側(cè)鏈分子比例、降解或引進(jìn)基團(tuán)等因素對(duì)多糖生理活性影響的研究己有相關(guān)報(bào)道［1-3］。氣相色譜是多糖結(jié)構(gòu)分析中最重要的手段之一，測(cè)定糖類具有選擇性好、樣品用量少、分辨率強(qiáng)、靈敏度高、分析速度快以及可用于定性及定量分析等優(yōu)點(diǎn)［4］。氣相色譜要求試樣具有良好的揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性。中藥多糖為生物大分子物質(zhì)，由于含大量羥基不能在高溫下直接揮發(fā)，不適用于氣相色譜，因而在研究中藥多糖中需要將大分子多糖降解為單糖或寡糖，并且將其衍生成易揮發(fā)，且熱穩(wěn)定的衍生物。本實(shí)驗(yàn)研究了兩種衍生化方法，通過(guò)對(duì)多糖的定性定量分析以及重復(fù)性、回收率的測(cè)定，比較這兩種衍生化方法的優(yōu)劣，從而建立一種較好的適用于中藥多糖的氣相色譜衍生化方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樣品 南瓜皮粗多糖APP以及用CTAB法分離得到的南瓜皮多糖APP1和APP2；D-果糖 Shanghai Green Rird Technology Devel.Ltd.；D-半乳糖 上海恒信化學(xué)試劑有限公司；D-甘露糖、D-木糖 中國(guó)醫(yī)藥（集團(tuán)）上海化學(xué)試劑公司；D-核糖 北京鼎國(guó)生物技術(shù)發(fā)展中心；葡萄糖 天津市科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心；吡啶、鹽酸羥胺、硼氫化鈉、乙酸、三氟乙酸等試劑 均為分析純。

TDL80-2B飛鴿牌系列離心機(jī) 上海安婷科學(xué)儀器廠制造；Trace GC氣相色譜儀 美國(guó)菲尼根；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，ACQ-600超聲波發(fā)生器，LXJ -ⅡB型低速大容量多管離心機(jī)，Christ ALPH1-4真空冷凍干燥機(jī)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)單糖糖腈衍生化［5］

準(zhǔn)確稱取各種標(biāo)準(zhǔn)單糖10mg，分別加入10mg的鹽酸羥胺，用0.5mL的吡啶溶解后封管，在90℃水浴中反應(yīng)30min，冷卻至室溫加入0.5mL無(wú)水醋酸酐封管后于90℃水浴中反應(yīng)30min，反應(yīng)物直接進(jìn)行氣相色譜分析。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)單糖糖醇衍生化［5］

準(zhǔn)確稱取各種標(biāo)準(zhǔn)單糖10mg，加入30mg硼氫化鈉，加入2mL水振蕩后，在室溫下放置至少1.5h，使糖還原成相應(yīng)的糖醇，滴入醋酸分解過(guò)量的硼氫化鈉，至無(wú)氣泡產(chǎn)生為止。溶液在60℃下減壓濃縮至干，加入0.1%（V/V）鹽酸甲醇溶液2mL，振蕩后加壓蒸發(fā)至干，重復(fù)四次以除去硼酸根，剩余物在105℃烘箱中加熱15min除去水分。加入0.5mL吡啶和0.5mL醋酸酐，封管后在沸水浴中反應(yīng)1h，反應(yīng)物進(jìn)行氣相色譜分析。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.4.1 糖腈衍生化法標(biāo)準(zhǔn)曲線 準(zhǔn)確稱取500mg肌醇六乙酰酯，用無(wú)水吡啶溶解并定容于50mL容量瓶中作為內(nèi)標(biāo)。精確稱取各標(biāo)準(zhǔn)單糖阿拉伯糖、鼠李糖、核糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖各10、15、20、25、30mg，用無(wú)水吡啶溶解并定容于5mL容量瓶中，分別吸取各標(biāo)準(zhǔn)單糖0.6mL于具塞試管中，分別加入內(nèi)標(biāo)溶液0.1mL和10mg的鹽酸羥胺，各管以無(wú)水吡啶補(bǔ)至1.0mL，溶解后封管，在90℃水浴中反應(yīng)30min，冷卻至室溫加入0.5mL無(wú)水醋酸酐封管后于90℃水浴中反應(yīng)30min進(jìn)行乙酰化，冷卻后用氯仿萃取3次，合并氯仿層，減壓抽干后加入1mL氯仿溶解進(jìn)行氣相色譜分析。以每種單糖進(jìn)樣前濃度為橫坐標(biāo)，單糖與內(nèi)標(biāo)的峰面積比為縱坐標(biāo)作線性回歸，計(jì)算出回歸方程與相關(guān)系數(shù)。

1.4.2 糖醇衍生化法標(biāo)準(zhǔn)曲線 準(zhǔn)確稱取500mg肌醇六乙酰酯，用無(wú)水吡啶溶解并定容于50mL容量瓶中作為內(nèi)標(biāo)。精確稱取各標(biāo)準(zhǔn)單糖阿拉伯糖、鼠李糖、核糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖各10、15、20、25、30mg，用蒸餾水溶解并定容于5mL容量瓶中，分別吸取各標(biāo)準(zhǔn)單糖0.6mL于具塞試管中，分別加入3.6、5.4、7.2、9.0、10.8mg NaBH4還原，加入1.4mL蒸餾水，使其體積均為2mL。在室溫下放置至少1.5h，使糖還原成相應(yīng)的糖醇，滴入醋酸分解過(guò)量的硼氫化鈉，至無(wú)氣泡產(chǎn)生為止。溶液在60℃下減壓濃縮至干，加入甲醇2mL，振蕩后加壓蒸發(fā)至干，重復(fù)四次以除去硼酸根，剩余物在105℃烘箱中加熱15min除去水分。加入0.5mL吡啶和0.5mL醋酸酐，封管后在沸水浴中反應(yīng)1h，反應(yīng)物進(jìn)行氣相色譜分析。以每種單糖進(jìn)樣前濃度為橫坐標(biāo)，單糖與內(nèi)標(biāo)的峰面積比為縱坐標(biāo)作線性回歸，計(jì)算出回歸方程與相關(guān)系數(shù)。

1.5 肌醇六乙酰酯的制備

稱取3g肌醇，加入4.5g鹽酸羥胺、45mL醋酸酐和3mL吡啶，在90℃水浴中加熱2h，并不斷攪拌，將反應(yīng)液冷卻至室溫后倒入50mL冰水中，使肌醇六乙酰酯析出，過(guò)濾后加20mL水洗滌，將壓干后產(chǎn)物放入100℃烘箱中烘干備用。氣相色譜檢測(cè)肌醇六乙酰酯為單峰。

1.6 氣相色譜條件

OV-17毛細(xì)管柱；FID檢測(cè)器；升溫程序：150℃（7℃/min）→190℃（15℃/min）→250℃；進(jìn)樣口溫度280℃；檢測(cè)器溫度260℃；Air：H2∶N2=300∶30，載氣流速10mL/min；進(jìn)樣量0.1μL。

1.7 多糖組分的定性分析

1.7.1 多糖的完全酸水解 取南瓜皮多糖5mg，置于安培管中，加入0.4mL蒸餾水溶解，再加入等體積的4mol/L三氟乙酸，封管，置于110℃水解3h，將水解液減壓蒸干，加入1.5mL甲醇溶解，再減壓蒸干，重復(fù)三次以除盡殘余的三氟乙酸，得到水解后的南瓜皮多糖。

1.7.2 多糖糖腈乙酸酯衍生物的制備 將水解后的多糖加入10mg的鹽酸羥胺，用0.5mL的吡啶溶解后封管，在90℃水浴中反應(yīng)30min，冷卻至室溫加入0.5mL無(wú)水醋酸酐封管后于90℃水浴中反應(yīng)30min，冷卻后用氯仿萃取3次，合并氯仿層，減壓抽干后加入1mL氯仿溶解進(jìn)行氣相色譜分析。

1.7.3 多糖糖醇醋酸鹽衍生物的制備 多糖水解后，用NaBH4（15mg）還原，加入2mL蒸餾水振蕩后，在室溫下放置至少1.5h，使糖還原成相應(yīng)的糖醇，滴入醋酸分解過(guò)量的硼氫化鈉，至無(wú)氣泡產(chǎn)生為止。溶液在60℃下減壓濃縮至干，加入甲醇2mL，振蕩后加壓蒸發(fā)至干，重復(fù)四次以除去硼酸根，剩余物在105℃烘箱中加熱15min除去水分。加入0.5mL吡啶和0.5mL醋酸酐，封管后在沸水浴中反應(yīng)1h，反應(yīng)物進(jìn)行氣相色譜分析。

1.8 多糖組成的定量分析

1.8.1 多糖的衍生化 準(zhǔn)確稱取水解后的南瓜皮多糖10mg，加入4mg的肌醇六乙酰酯作為內(nèi)標(biāo)物，然后分別按照兩種衍生化方法制備多糖衍生物。

1.9 多糖中單糖摩爾比的計(jì)算

根據(jù)各單糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出多糖中單糖的含量，各單糖的摩爾數(shù)：

式中：C為測(cè)得的單糖的濃度，L為進(jìn)樣前的體積，M為該單糖的分子量。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)單糖衍生化方法比較

采用糖腈衍生化和糖醇衍生化兩種衍生化方法進(jìn)行對(duì)比，通過(guò)氣相色譜對(duì)七種單糖標(biāo)品的混標(biāo)進(jìn)行定性分析。

圖1為混合標(biāo)準(zhǔn)單糖糖腈化衍生物的氣相色譜圖，采用這種方法衍生化后，各種單糖能完全在石英毛細(xì)管柱中很好的分離，幾乎無(wú)雜峰產(chǎn)生，且這種衍生化方法制備簡(jiǎn)單，能夠有效克服由于糖的異構(gòu)化而造成的多峰現(xiàn)象，每種糖都能得到單一的色譜峰，有利于進(jìn)行氣相色譜的定性和定量分析。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)單糖的糖腈乙酰酯衍生物的氣相色譜圖

如圖2所示，采用糖醇乙?；ㄑ芯炕旌蠘?biāo)準(zhǔn)單糖時(shí)，糖醇乙酰化衍生物在色譜柱中沒(méi)有有效的分離，經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)，在氣相色譜圖中果糖出現(xiàn)兩個(gè)峰，葡萄糖和半乳糖的保留時(shí)間重合，在實(shí)驗(yàn)中很難根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)單糖的色譜峰作定性的對(duì)照。

圖2 混合標(biāo)準(zhǔn)單糖的糖醇醋酸鹽衍生法的氣相色譜圖

2.2 南瓜多糖中單糖組成的定性分析結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)采用糖腈衍生化方法完成了7種單糖（阿拉伯糖、鼠李糖、葡萄糖和半乳糖、果糖、木糖、苷露糖）在毛細(xì)管柱中的分離，南瓜多糖中單糖種類的定性采用與標(biāo)準(zhǔn)單糖的色譜保留時(shí)間相對(duì)照的方法。

2.3 南瓜多糖中單糖組成的定量分析結(jié)果

南瓜多糖中各種單糖組成的定量采用糖腈衍生化方法依照1.4.1中所作標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程求得，回歸方程和相關(guān)系數(shù)如表1所示。

表1 標(biāo)準(zhǔn)單糖測(cè)定的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)

由回歸方程求出南瓜皮多糖APP、APP1、APP2中各種單糖的含量、摩爾數(shù)及摩爾比如表2所示。采用糖腈衍生化方法測(cè)定南瓜皮粗多糖APP由鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖組成，摩爾比為0.3256∶0.1936∶0.3150∶0.3529；用CTAB法得到的APP1由鼠李糖、果糖、葡萄糖和半乳糖組成，摩爾比為0.5934∶0.7194∶0.2612：0.3312；以及 APP2由鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖組成，摩爾比依次為0.3667∶0.1824∶0.1891∶0.3638。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，糖腈衍生化既能確定多糖的組成，也能確定多糖的摩爾比；而糖醇衍生化則不能確定多糖的組成及摩爾比，因此糖腈衍生化為較好方法。

表2 南瓜多糖組分分析結(jié)果

2.4 南瓜多糖加樣回收率的測(cè)定和精密度實(shí)驗(yàn)

在多糖樣品中定量加入標(biāo)準(zhǔn)單糖，采用糖腈衍生化方法操作后測(cè)定回收率，樣品進(jìn)行了重復(fù)（6次）實(shí)驗(yàn)，計(jì)算6次平行測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）和回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。從表中可以看出，用糖腈衍生化方法測(cè)定回收率較高，重復(fù)性較好，而糖醇衍生化不能準(zhǔn)確定量，較糖腈衍生化差。

表3 方法的精密度和回收率（n=6）

3 結(jié)論

3.1 制備糖醇乙酸酯衍生物時(shí)，果糖經(jīng)過(guò)還原可得到山梨醇和甘露醇的混合物，測(cè)定結(jié)果容易導(dǎo)致色譜峰的混亂，不易定性分析，并且衍生化方法反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)，操作比較麻煩。

3.2 糖腈乙酸酯衍生物氣相色譜法具有衍生物制備簡(jiǎn)便、試劑易得等優(yōu)點(diǎn)，并且每種單糖都能得到單一的色譜峰。

3.3 采用糖腈衍生化方法對(duì)南瓜多糖APP、APP1、APP2中各種單糖的組成進(jìn)行定性和定量分析，結(jié)果表明，采用糖腈衍生化方法可準(zhǔn)確地得到南瓜多糖的單糖組成及單糖的含量、摩爾分?jǐn)?shù)以及摩爾比，而糖醇衍生化方法則不能，因此，糖腈衍生化方法是用氣相色譜研究食品多糖的較為合適的衍生化方法。

［1］楊懷謹(jǐn).多糖研究進(jìn)展［J］.中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2003，9（10）：70-71.

［2］ Schepetkinia， Quinnmt. Botanical， polysacchsrides：macrophage immunomodulation and the therapeutic potentiallntemational［J］.Immunopharmacology，2006（6）：317-333.

［3］Wangjy，Kasperdl，Tzianabos A.Biological chemistry of immunomodulation by zwitterionic polysaceharides［ J］. Carbohydrate Research，2003，338：2531.

［4］陶樂(lè)平，丁在富，張部昌.氣相色譜在多糖結(jié)構(gòu)測(cè)定中的應(yīng)用［J］.色譜，1994，5（12）：1-7.

［5］張惟杰.糖復(fù)合物生化研究技術(shù)［M］.浙江大學(xué)出版社，2006：38-40.

Study and comparison of two derivatization methods of polysaccharides by GC

BAI Di-si，ZHANG Jing*
（Department of Food Engineering and Nutrient Science，Shaanxi Normal University，Xi’an 710062，China）

Two methods of derivatization：glyc-nitrile derivatization and furfury alcohol derivatization in gas chromatography（GC）were used to analyze the composition of the polysaccharides，find the linear correlation，calculate the molar ratio and determine recovery of the sample，precision and the repeatability.ln the method of furfury alcohol derivatization，fructose was deoxidized to the mixture of sorbitol and mannitol，and the results could cause the chaos of the chromatographic peaks，made it hard to determine the amounts of the components of the polysaccharides，meanwhile，the reaction of derivatization lasted a long time，manipulation was also troublesome. While using glyc-nitrile derivatization to prepare the derivative，its manipulation was easier，and the reagent was easy to get，every monosaccharide got a single peak.From the study and comparison of the two methods of derivatization，we can see that the method of glyc-nitrile derivatization is the more suitable derivatization method.

polysaccharides；GC；glyc-nitrile derivatization；furfury alcohol derivatization

TS201.2+3

A

1002-0306（2011）02-0322-04

2009-10-12 *通訊聯(lián)系人

白娣斯，女，碩士研究生，主要從事天然產(chǎn)物有效成分的化學(xué)研究。

國(guó)家自然科學(xué)基金（10874108）；陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃（SJ08A16）。