趙喜蘭

（漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，河南漯河462002）

桑葚多糖提取、純化分離及其降糖作用的研究

趙喜蘭

（漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南漯河462002）

目的：探討桑葚多糖純化工藝及降糖作用。方法：AB-8樹脂純化，乙醇醇沉，5%的三氯醋酸的正丁醇+氯仿正丁醇（5∶1）去蛋白，所得多糖經(jīng)DEAE-纖維素柱分離，所得多糖進(jìn)行降糖效果測定。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)表明，樹脂純化、乙醇醇沉，5%的三氯醋酸的正丁醇+氯仿正丁醇（5∶1）去蛋白純化效果較好，DEAE-纖維素柱分離中性多糖P-1，酸性多糖P-2、P-3，且降糖效果明顯。結(jié)論：該純化工藝和藥理實(shí)驗(yàn)為桑葚的綜合利用提供了新途徑。

桑葚多糖，樹脂，乙醇醇沉，去蛋白，降糖

桑葚為桑的聚合果，研究證明，桑中的黃酮和多糖對降血糖具有一定活性作用［1-3］。本研究主要針對桑葚多糖提取、純化分離工藝和降糖作用進(jìn)行了研究，為桑葚多糖的進(jìn)一步開發(fā)提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桑葚 漯河農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供；樹脂AB-8 上海試劑四廠；DEAE-纖維素、SepharoseCL-4B、sephadex -G-150 Sigma公司進(jìn)口分裝；四氧嘧啶 Sigma公司；試劑盒 均購自上?？菩郎锛夹g(shù)研究所；化學(xué)試劑 均為分析純。

雙光束紫外可見分光光譜儀 北京普析通用儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 桑葚多糖的提取 桑葚500g，石油醚回流脫脂lh，抽濾，2000mL蒸餾水100℃提取1h，提取三次，濃縮，醇沉，冷凍干燥，蒸餾水溶解，三氯醋酸（3%）去蛋白，得粗多糖，所得多糖蒸餾水溶解，備用，定量采用苯酚-硫酸法［4］。

1.2.2 AB-8大孔樹脂的純化 取多糖備用液60mL過AB-8樹脂，蒸餾水洗脫，流速1mL/min，每管10mL，到無糖為止。

1.2.3 乙醇濃度對醇沉條件的影響 取多糖備用液4份，無水乙醇調(diào)成不同濃度的溶液，冰箱靜置24h，離心，冷凍干燥，稱重。

1.2.4 去蛋白方法的選擇 采用傳統(tǒng)的Sevage法和3%三氯醋酸法去蛋白，并加以創(chuàng)新：取等體積的5%三氯醋酸的正丁醇溶液與等體積的多糖溶液充分振蕩，加入等體積氯仿正丁醇（5∶1），振蕩，取水溶液部分，蒸餾水透析。

1.2.5 多糖的DEAE-纖維素柱層析 取精制多糖過DEAE-纖維素柱（OH-），NaCl（0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol/L）溶液洗脫，流速2mL/min，6mL/管。蒸餾水洗脫得到的中性多糖濃縮到 10mL，上SepHadexG-150柱，用蒸餾水洗脫，流速2mL/min，5mL/管，得中性多糖P-1；0、0.05mol/L NaCl洗脫分別得酸性多糖P-2、P-3。

1.2.6 sepharseCL-B凝膠柱層 取標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖系列：T-10、T-30、T40、T-70、T-110進(jìn)行sepharseCL-B凝膠柱層析，測其洗脫體積（V），做V-lgM的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y=437.5-79.387x，R=0.986，由樣品的體積計(jì)算出相應(yīng)的平均分子量。

1.2.7 中性多糖的氣相色譜 樣品用硫酸（2N），100℃，12h封管將多糖水解，氫氧化鋇中和，過濾水解液，氣相色譜分析，以木糖、阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖、葡萄糖、甘露糖為對照。

1.2.8 降糖作用的研究

1.2.8.1 糖尿病模型的建立 昆明小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，禁食不禁水 12h，2d腹腔注射2%四氧嘧啶（120mg/kg），72h后形成糖尿病模型，末次注射四氧嘧啶后的4h，測定空腹血糖，血糖值大于11.0mmol/L者為造模成功小鼠［5］。

1.2.8.2 桑葚中性多糖對糖尿病小鼠血糖的影響造模成功的小鼠隨機(jī)分為5組，分別為：陽性對照，常規(guī)飼養(yǎng)；P-1、P-2、P-3陽性治療陽性對照組分別灌胃P-1、P-2、P-3和常規(guī)降糖藥物優(yōu)降糖，蒸餾水2mg/kg，每天兩次，陰性對照組常規(guī)飼養(yǎng)。第20d小鼠禁食12h，第2d早晨測定血糖含量，斷尾取血，用葡萄糖氧化酶法測定血糖濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 AB-8樹脂的純化

1g粗多糖由AB-8樹脂純化后，色素基本去除，極性較弱的有機(jī)物去除效率高，最終多糖的純度達(dá)到73.1%，效果較好。

2.2 醇沉條件的選擇

實(shí)驗(yàn)表明，不同的乙醇濃度所沉淀的多糖量不一樣，是由于不同多糖的溶解度在不同濃度的乙醇中是不同的，綜合多方面因素，選擇80%的乙醇作為醇沉條件。

表1 醇沉條件的選擇

2.3 去蛋白方法的選擇

從表2中可以看出，第三種方法同Sevga法和3%三氯醋酸法相比，蛋白質(zhì)的清除率略高于前兩種方法，得到多糖的損失率要低很多。

2.4 多糖的分離及分子量的測定

精制多糖上DEAE-纖維素柱，洗脫，根據(jù)硫酸苯酚法檢測的結(jié)果合并相同峰位的組分，減壓濃縮至適當(dāng)體積。其中蒸餾水部分經(jīng)過SepHadexG-150純化后得中性多糖P-1，0.05、0.1mol/L的NaCl洗脫得酸性多糖P-2、P-3。sepharseCL-B凝膠柱層析測定分子量分別為121000、45821、46824。

表3 桑葚多糖的降血糖作用

表2 去蛋白方法的選擇

2.5 中性多糖的氣相色譜

由氣相色譜圖表明，多糖主要是由葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖4種單糖組分組成。

圖1 中性多糖的氣相色譜圖

2.6 降糖作用

由表3比較發(fā)現(xiàn)，桑葚多糖和優(yōu)降糖都具有明顯的降糖作用，P-1、P-3、優(yōu)降糖與陽性對照比較，差異極顯著，血糖比陽性對照分別降低了66.9%、49.7%、40.6%，相比較而言，P-1降糖作用明顯，而P-2差異顯著；桑葚多糖與優(yōu)降糖比較，P-1、P-2差異極顯著，而P-3差異顯著，說明桑葚多糖的降糖作用明顯優(yōu)于優(yōu)降糖，其中P-1基本可以維持到正常水平。

3 討論與結(jié)論

3.1 對于多糖的純化采用了常規(guī)的大孔樹脂純化，效果較好，純度達(dá)到73.1%。而對于蛋白質(zhì)的去除，采取了5%的三氯醋酸的正丁醇+氯仿正丁醇（5∶l）方法，多糖回收率較高，蛋白質(zhì)的清除率較高，達(dá)到93.9%。所得多糖經(jīng)過DEAE-纖維素柱分離，得到三種多糖，分別為中性多糖P-1，酸性多糖P-2、P-3。

3.2 對所得多糖進(jìn)行了降糖作用的比較，說明桑葚多糖具有明顯的降糖作用，且效果明顯，中性多糖基本可以使血糖維持在正常的范圍內(nèi)。

［1］陳福君，盧軍，張永煌.桑葉降血糖有效組分對糖尿病動物糖代謝的影響［J］.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，1996，13（1）：24.

［2］廖森泰，鄒宇曉，鄭祥明.桑寧茶多糖對糖尿病小鼠的降血糖作用研究［J］.蠶業(yè)科學(xué)，2004，30（3）：327-328.

［3］李先佳，任麗平，王家國.桑葉黃酮和多糖對Ⅱ型糖尿病大鼠生化指標(biāo)的影響［J］.中國老年學(xué)雜志，2009，29（19）：2536-2537.

［4］陳忠，劉琳玲，何猛雄，等.多糖提取與純化技術(shù)應(yīng)用進(jìn)展［J］.食品研究應(yīng)用與開發(fā)，2007，28（3）：186-188.

［5］?；燮?，陶令霞，夏鐵騎.南瓜多糖對四氧嘧啶型糖尿病小鼠血糖和血脂的影響［J］.食品科技，2008（6）：247-248.

Study on the purification and hypoglycemic effect of polysaccharide in mulberries

ZHAO Xi-lan
（Luohe Medical College，Luohe 462002，China）

Objective：To explore the purification and hypoglycemic effect of polysaccharide in mulberries.Methods：AB-8 resin purification，ethanol precipitation，5%trichloroacetic acid of the n-butanol+chloroform n-butano（l5∶1）to remove protein，polysaccharide obtained was isolated by DEAE-cellulose column separation for hypoglycemic effect test.Results：The tests showed that resin purification，ethanol precipitation，5%trichloroacetic acid of the n-butanol+chloroform n-butanol（5∶1）removed protein absolutely，neutral polysaccharides P-1，acidic polysaccharide P-2，P-3 can be isolated by DEAE-cellulose column separation effectively，the polysaccharide also had remarkable hypoglycemic effect.Conclusion：The technology method provided a new approach for the comprehensive utilization of mulberries.

polysaccharide in mulberries；resin；ethanol precipitation；lustrating protein；hypoglycemic effect

TS255.1

B

1002-0306（2011）02-0259-02

2009-12-28

趙喜蘭（1969-），女，副教授，主要從事中藥方面的研究。