朱淑云，董 英

（江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

響應(yīng)面法優(yōu)化水飛薊粕蛋白的提取工藝

朱淑云，董 英

（江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

在pH、液料比、溫度及提取時(shí)間4個(gè)單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用響應(yīng)面分析法確定了提取水飛薊粕蛋白的最佳工藝條件。結(jié)果表明，用堿提酸沉法提取水飛薊粕蛋白的最佳條件是：pH11，液料比16∶1，溫度50℃，提取時(shí)間60min，在此條件下蛋白的提取率為54.52%。

水飛薊粕，蛋白，提取工藝，響應(yīng)面法

水飛薊 silibum marianum（L.）Gaertn（milk thistle），又名水飛雉、乳雉子，為菊科水飛薊屬草本植物，以果實(shí)入藥，果實(shí)中有較大利用價(jià)值的成分主要是水飛薊素、水飛薊油和水飛薊蛋白。其中的水飛薊素具有保肝、抗氧化、抗血小板聚集和抑制癌細(xì)胞增值等生理功能［1-4］。水飛薊素主要分布于種殼中，種仁中含量極微［5］，目前國內(nèi)對水飛薊資源的利用主要還是以提取水飛薊素為主，對種籽中油和蛋白的提取利用為輔，一般剩下的餅粕直接作為飼料或肥料利用，其中的營養(yǎng)成分沒有得到很好的利用。研究證明水飛薊粕中蛋白含量較高，氨基酸種類齊全，是一種很好的植物蛋白源［6］。本工作擬對影響水飛薊粕蛋白提取率的主要工藝參數(shù)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，并以蛋白提取率為指標(biāo)，采用響應(yīng)面法對蛋白的提取條件進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，以期為水飛薊的綜合開發(fā)和合理利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

水飛薊種仁 由江蘇中興藥業(yè)有限公司提供，經(jīng)過低溫加壓溶劑萃取技術(shù)脫脂，然后將脫脂水飛薊粕進(jìn)行粉碎過80目篩。

加壓溶劑萃取裝置 江南集團(tuán)與江蘇大學(xué)聯(lián)合研制；FC-160型錘式粉碎機(jī) 上海中藥機(jī)械廠；UNICO WFJ7200可見光分光光度計(jì) 尤尼柯（上海）儀器有限公司；ALPHAI-4/2-4型冷凍干燥機(jī) 德國CHRIST公司；BS110S型電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)公司；LD5-2A型離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠；pHS-3TC型pH計(jì) 上海天達(dá)儀器有限公司；SHZ-10組合式水浴搖床 太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 水飛薊粕蛋白提取工藝 脫脂水飛薊粕→以一定的液料比加水→調(diào)節(jié)pH→水浴（過程中控制一定的溫度和時(shí)間，并用NaOH調(diào)節(jié)pH）→3800r/min離心20min→收集上清液→調(diào)節(jié)pH5.5→3800r/min離心20min→傾去上清液→真空冷凍干燥→測定蛋白含量

1.2.2 主要成分測定方法 水分含量：105℃恒重法；粗蛋白：凱氏定氮法；粗脂肪：索氏抽提法；總糖：硫酸-苯酚法［7］；灰分：高溫灼燒法；蛋白質(zhì)含量測定：考馬斯亮藍(lán)比色法［8］。

1.2.3 蛋白質(zhì)提取率的計(jì)算方法：

1.2.4 水飛薊粕蛋白提取實(shí)驗(yàn) 以水飛薊粕蛋白提取率為指標(biāo)，分別研究了pH、提取時(shí)間、溫度、液料比對蛋白提取率的影響。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，以水飛薊粕蛋白的提取率為響應(yīng)值，選取液料比、pH、溫度這三個(gè)主要因素為自變量，設(shè)計(jì)三因素三水平RSM表，實(shí)驗(yàn)因素與水平如表1所示。

表1 RSM實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素及水平

1.2.5 pH對水飛薊蛋白沉淀率的影響［9］將提取的水飛薊粕蛋白溶液分裝到10支離心管中，分別用HCl調(diào)至不同的pH，靜置30min，然后經(jīng)4000r/min離心15min，測定上清液中蛋白質(zhì)的含量，利用以下公式計(jì)算水飛薊蛋白的沉淀率：

沉淀率（%）=酸沉淀前上清液中蛋白質(zhì)的含量-酸沉后上清液中蛋白質(zhì)的含量/酸沉前上清液中蛋白質(zhì)的含量×100%

2 結(jié)果與討論

2.1 水飛薊粕蛋白提取的單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 pH對水飛薊粕蛋白提取率的影響 由圖1可知，pH在7～10之間時(shí)，提取率隨著pH的升高而提高，且提高幅度較大；pH達(dá)到10后，提取率增加緩慢。從實(shí)際生產(chǎn)考慮，提取水飛薊粕蛋白的pH在10左右較好，這樣一方面減少了加堿加酸量，降低了成本；另一方面，考慮到pH過高會(huì)引起蛋白質(zhì)變性，因此要限制體系的pH。

圖1 pH對水飛薊粕蛋白提取率的影響

2.1.2 液料比對水飛薊粕蛋白提取率的影響 由圖2可知，隨著液料比的增大，提取率逐漸增加，當(dāng)液料比為16∶1時(shí)，提取效果達(dá)到最佳，當(dāng)料液繼續(xù)增大時(shí)，提取率略有下降，可能是由于有蛋白酶溶出，分解了部分蛋白質(zhì)，因此選定提取水飛薊粕蛋白的液料比為16∶1。

圖2 液料比對水飛薊粕蛋白提取率的影響

2.1.3 溫度對水飛薊粕蛋白提取率的影響 由圖3可知，伴隨著溫度的升高，提取率也在不斷地提高，在30～40℃之間，提取率的增長速度較快，當(dāng)溫度達(dá)到40℃后，提取率增長緩慢?？紤]到溫度過高會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，故選定提取水飛薊粕蛋白的溫度為40℃。

圖3 溫度對水飛薊粕蛋白提取率的影響

2.1.4 時(shí)間對水飛薊粕蛋白提取率的影響 由圖4可知，當(dāng)提取時(shí)間比較短時(shí)，蛋白溶解得不充分，故提取率較低，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到60min后，延長提取時(shí)間對蛋白的提取率影響并不大，因此選定蛋白的提取時(shí)間為60min即可。

圖4 時(shí)間對水飛薊粕蛋白提取率的影響

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面（RSM）設(shè)計(jì)及結(jié)果 根據(jù)3因素3水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，共設(shè)立了15個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，其中12個(gè)為析因點(diǎn)，3個(gè)為零點(diǎn)。零點(diǎn)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次，以估計(jì)誤差。實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果

2.2.2 響應(yīng)面分析與優(yōu)化 RSM程序通過對各因素值和響應(yīng)值分析計(jì)算，說明響應(yīng)值與各因素值之間不是簡單的線性關(guān)系，進(jìn)一步對回歸模型進(jìn)行分析，其系數(shù)顯著性結(jié)果如表3。

表3 方差分析表

從表3中可以看出，模型是高度顯著的（P＜0.01），失擬誤差不顯著（P＞0.05），回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2為0.9788，校正后的R2為0.9406，這說明實(shí)驗(yàn)誤差小，變量與自變量之間的模型關(guān)系顯著，回歸方程與實(shí)際情況擬合良好，所以該實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是可靠的。數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明，pH、溫度和液料比對水飛薊粕蛋白提取率具有極顯著的影響，但各因素之間的交互作用不顯著。

2.2.3 最優(yōu)提取工藝參數(shù)的確定及驗(yàn)證 綜合考慮各種因素的相互作用，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和二次多項(xiàng)回歸方程，利用Design Expert 7.0軟件分析得到了水飛薊粕蛋白提取率最高時(shí)的工藝條件為：pH11，液料比16.18∶1，溫度49.6℃，在此條件下蛋白的提取率為55.06%?？紤]到實(shí)際生產(chǎn)情況，將最佳條件修正為pH11，液料比16∶1，溫度50℃，在此條件下進(jìn)行三次實(shí)驗(yàn)，平均值為54.52%。與理論值接近，說明采用RSM法優(yōu)化得到的提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

2.3 pH對水飛薊粕蛋白沉淀率的影響

圖5 pH對水飛薊粕蛋白沉淀率的影響

由圖5可知，水飛薊粕蛋白的沉淀率隨pH的增加呈先增加后降低的趨勢，在pH為5.5左右時(shí)的沉淀率最高，因此我們選用蛋白質(zhì)酸沉淀時(shí)的pH為5.5。

2.4 水飛薊粕及提取蛋白的主要組分分析

對脫脂后的水飛薊粕和所提取的蛋白進(jìn)行成分測定，結(jié)果如表4所示。由表可見，水飛薊粕中蛋白質(zhì)含量較高，具有較高的利用價(jià)值。蛋白提取液經(jīng)冷凍干燥得到的蛋白粉，其蛋白含量為84.53%。提取的蛋白達(dá)到了分離蛋白的含量水平，可以作為優(yōu)質(zhì)蛋白利用。

表4 水飛薊粕及提取蛋白的各組分含量（%）

3 結(jié)論

本研究結(jié)合所篩選的關(guān)鍵因素利用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，擬合了pH、液料比、溫度與水飛薊蛋白提取率之間的相互關(guān)系，并通過響應(yīng)面分析，得到了提取水飛薊粕蛋白的最佳工藝條件：pH11，液料比16∶1，溫度50℃，在該條件下蛋白提取率達(dá)到54.52%，所提取的蛋白含量為84.53%。

［1］R Agarwal，C Agarwal，H Ichikawa，et al.Anticancer potential of silymarin：from bench to bed side［J］.Anticancer Res，2006，26：4457-4498.

［2］G Deep，R Agarwal.Chemopreventive efficacy of silymarin in skin and prostate cancer［J］.Integr Cancer Ther，2007（6）：130-145.

［3］A Tyagi，N Bhatia，MS Condon，et al.Antiproliferative and apoptotic effects of silibinin in rat prostate cancer cells［J］. Prostate，2002，53：211-217.

［4］G Sharma，RP Singh，DC Chan，et al.Silibinin induces growth inhibition and apoptotic cell death in human lung carcinoma cells［J］.Anticancer Res，2003，23：2649-2655.

［5］尚煒，才松，楊彥春.水飛薊種殼與種子總黃酮含量比較［J］.中國中醫(yī)科技，1995，2（5）：24-25.

［6］陳毓荃，王春梅，張文.水飛薊綜合利用基礎(chǔ)研究Ⅱ果實(shí)油脂和蛋白質(zhì)［J］.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，1998，7（1）：79-81.

［7］宋俊英.茶薪菇總糖、還原糖和多糖的測定［J］.中草藥，2006，37（9）：1421-1422.

［8］王多寧，趙雁武，田芙蓉.考馬斯亮藍(lán)微盤比色法測定蛋白質(zhì)含量［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，22（6）：528-529.

［9］TANG C H.Functional properties and in vitro digestibility of buckwheat protein products：influence of processing［J］.Journal of Food Engineering，2007，82：568-576.

Optimized technology for extracting milk thistle cake protein by response surface methodology

ZHU Shu-yun，DONG Ying
（School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，China）

Based on single-factor test analysis，the optimum conditions including pH，liquid-solid ratio，temperature and extraction time of milk thistle cake protein by alkaline extraction and acid precipitation were determined through response surface methodology.The condition were as follows：pH11，liquid-solid ratio16∶1，temperature50℃and extraction time 1h.The protein extraction rate was 54.52%under the condition.

milk thistle cake；protein；extraction technology；response surface methodology

TS201.1

B

1002-0306（2011）02-0256-03

2010-01-26

朱淑云（1975-），女，講師，在讀博士，研究方向：食品科學(xué)。

江蘇大學(xué)高級(jí)人才科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目（09JDG027）。