郭晨峰，張 微，劉 寧，*

（1.東北農業(yè)大學國家乳業(yè)工程技術中心，黑龍江哈爾濱150086；2.東北農業(yè)大學乳品科學教育部重點實驗室，食品學院，黑龍江哈爾濱150030）

制備乳脂肪球膜磷脂-維生素A脂質體的工藝優(yōu)化

郭晨峰1，2，張 微1，2，劉 寧1，2，*

（1.東北農業(yè)大學國家乳業(yè)工程技術中心，黑龍江哈爾濱150086；2.東北農業(yè)大學乳品科學教育部重點實驗室，食品學院，黑龍江哈爾濱150030）

目的：制備可添加于嬰兒液態(tài)配方乳的乳脂肪球膜磷脂-維生素A脂質體，并優(yōu)化其制備參數(shù)。方法：本實驗采用薄膜水合-高壓均質法，應用乳脂肪球膜磷脂為膜材，制備維生素A脂質體，在單因素實驗基礎之上，探討制備脂質體過程中磷脂濃度、主藥與磷脂比例、膽固醇與磷脂比例、維生素E占磷脂百分比濃度、反應溫度等制備因素對形成脂質體后包封率的影響規(guī)律。采用二次旋轉正交組合實驗方法設計實驗，經SAS軟件與Matlab軟件處理數(shù)據(jù)得到配方原料指標和反應溫度對脂質體包封率的影響。結果：優(yōu)化得到制備脂質體工藝參數(shù)：磷脂濃度7.43%，磷脂與主藥比例28.95∶1，磷脂與膽固醇比例為6.53∶1，維生素E占磷脂百分比濃度為0.83%，反應溫度59.58℃，得到優(yōu)化后最高包封率為88.77%，脂質體在掃描電子顯微鏡下觀察，其超微結構為球狀囊泡。結論：本實驗首次以乳脂肪球膜磷脂作為膜材包埋維生素A制備脂質體，將傳統(tǒng)的薄膜水合法與高壓均質法相結合，成功制備出可添加于嬰兒食品的可食性脂質體。

乳脂肪球膜磷脂，維生素A，薄膜水合-高壓均質，脂質體

對于嬰兒來說，最理想的食物就是母乳，母乳是 大自然最好的食物。然而在發(fā)達和發(fā)展中國家已經有越來越多的嬰兒依賴于配方乳喂養(yǎng)，牛乳等或對其確定的修飾已經很大程度地應用于嬰兒喂養(yǎng)［1］。鑒于維生素A對視力、免疫系統(tǒng)，以及神經系統(tǒng)的有益作用，對嬰兒的發(fā)育來說充分攝入維生素A是非常重要的，所以應用藥劑學補充維生素A可以減少一些傳染性疾病和意外事件的發(fā)生。強化食品是另一個預防維生素A缺乏的辦法，但是由于多種原因，強化不是直接的。首先，維生素A積累到高水平是劇毒的，所以強化食品要避免維生素A攝入過量。其次，維生素A在水相系統(tǒng)中難溶，例如飲料和高水分含量的食品。最后，維生素A在多數(shù)環(huán)境條件下極不穩(wěn)定，這個問題影響了食品和藥品的補充途徑。在強化食品的制作、傳輸和貯存過程中可能發(fā)生大量維生素A的損失。而為了避免維生素A的損失而增加強化水平是不可取的，因為它存在著維生素A攝入過量的潛在風險［2］。脂質體在營養(yǎng)中最早的應用是受到母乳的啟發(fā)。在最近的母乳電子顯微研究中，研究結果表明作為母乳的微結構成分，脂質體在提供營養(yǎng)穩(wěn)定等方面發(fā)揮著不可替代的作用［3］。制藥工廠中使用的大豆和雞蛋磷脂大量的花費已經限制了他們在食品體系中的商業(yè)用途。像所有的磷脂材料的天然來源一樣，來源于酪乳中的乳脂肪球膜（milk fat globule membrane，MFGM）衍生的成分包括很多不同類型的磷脂。附有磷脂頭基的鏈脂肪酸也在不同的磷脂源材料之間變化并且乳脂肪球膜衍生的組分要比它們的大豆類似物更趨于高度飽和。這種乳脂肪球膜磷脂材料的獨特構成（特別是鞘磷脂類）可能會導致脂質體性能的不同以及有利于為消費者提供營養(yǎng)［4］。Thompson［5］等應用高壓均質法以乳脂肪球膜磷脂為膜材制備出空白脂質體。本研究以乳脂肪球膜磷脂為膜材，應用薄膜水合-高壓均質法制備維生素A脂質體。主要研究了制備過程中各不同參數(shù)對包封率的影響規(guī)律，從而優(yōu)化乳脂肪球膜磷脂維生素A脂質體的配方和反應溫度等工藝參數(shù)，將傳統(tǒng)的薄膜水合法與高壓均質法相結合，明顯地改善了脂質體的物理性狀。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳脂肪球膜磷脂 復合脂質700，新西蘭恒天然研究中心；維生素A醋酸酯（VA）、維生素E Sigma；咪唑 天津市科密歐科技有限公司；NaN3天津市福晨化學試劑廠；泊洛沙姆 德國BASF公司；膽固醇 天津市博迪化工有限公司；自制超純水。

NS1001L型高壓微射流均質機 意大利 Niro Soavi公司；H-7650透射電子顯微鏡 日本日立；TDA-8002水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；ZFQ85B旋轉蒸發(fā)儀 上海醫(yī)械專機廠；KQ32000DB型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；高速分散器 寧波新芝生物科技股份有限公司；離心超濾管 上海百賽生物；圓底燒瓶，移液器等。

1.2 實驗方法

1.2.1 脂質體的制備 按照不同比例稱取一定量的乳脂肪球膜磷脂、維生素A醋酸酯、維生素E、膽固醇溶解于無水乙醇，置于圓底燒瓶中。將圓底燒瓶置于水浴中，在旋轉蒸發(fā)儀上減壓蒸發(fā)除去乙醇，直至乙醇蒸發(fā)完畢。加入咪唑緩沖液，振搖使薄膜溶解，形成乳白色溶液，將此溶液置于高速剪切器中處理（150r/s）即得較均勻溶液。樣品通過高壓均質機在103MPa下循環(huán)3次。

1.2.2 包封率的測定 用離心超濾法結合RP-HPLC（反向-高效液相色譜法）測定。

1.2.3 粒徑的測定 采用動態(tài)光散射粒度儀測定脂質體的粒徑分布。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 SAS軟件回歸的方法。最優(yōu)方案采用Matlab中fmincon函數(shù)尋優(yōu)的方法。

在單因素實驗基礎上，根據(jù)影響脂質體包封率的五個因素：磷脂濃度、主藥與磷脂比例、膽固醇與磷脂比例、維生素E占磷脂百分比濃度、反應溫度為自變量，以脂質體包封率為響應值進行實驗研究，實驗因素水平編碼表見表1。

表1 實驗因素水平編碼表

2 結果與分析

2.1 各反應因素對脂質體包封率的影響

應用二次旋轉正交組合實驗設計方法，實驗設計及結果見表2。用SAS軟件回歸得到包封率方程：

Y1=84.11333+2.571667X1+1.2275X2+1.6775X3+ 1.305X4+5.095X5-2.395X1X2-1.95X1X4-1.04375X1X5-1.488958X2X2+1.1425X2X3-1.843958X3X3+1.72625X3X5-4.315208X4X4+2.64625X4X5-2.761458X5X5

其中，X1、X2、X3、X4、X5取水平值。

對方程分析可以得到各因素對脂質體包封率的影響。

由表3可知，從F值可以看出各因素貢獻率為：X5＞X1＞X2＞X3＞X4。即反應溫度＞磷脂濃度＞磷脂∶主藥＞磷脂∶膽固醇＞維生素E占磷脂百分比濃度。根據(jù)各因素對包封率的貢獻率可以看出，反應溫度和磷脂濃度對包封率影響比較顯著，這與應用大豆磷脂作為膜材包封脂質體的貢獻程度有所區(qū)別，原因可能是乳脂肪球膜磷脂與大豆磷脂在成分組成和捕集效率上的不同所致。該模型 R2= 94.78%，Y1（包封率）最優(yōu)值為88.77%。

應用Matlab尋優(yōu)方法對回歸模型進行分析，尋找最優(yōu)結果是當磷脂濃度為7.43%，磷脂∶主藥= 28.95∶1，磷脂∶膽固醇=6.53∶1，維生素E占磷脂比例0.83%，反應溫度為59.58℃時，包封率有最優(yōu)值為88.77%。由圖1可以得到交互項的響應面圖。

2.2 驗證和對比實驗

在二次旋轉正交組合設計實驗得到的最優(yōu)反應條件下，為了實驗操作簡便，將各實驗反應條件參數(shù)按如下數(shù)值進行操作：磷脂濃度為7.5%，磷脂∶膽固醇=29∶1，磷脂∶膽固醇=7∶1，維生素E占磷脂比例0.80%，反應溫度為60℃時，重復5個平行樣，求平均值，測定得到包封率的平均值為87%，誤差為2%，可以認為優(yōu)化所得結果可信。

表2 實驗設計及結果

圖1 響應面圖

表3 回歸與方差分析結果

2.3 脂質體經過高壓均質前后粒徑的變化

應用薄膜水合法制備的乳脂肪球膜磷脂維生素A脂質體在形成初期經常出現(xiàn)相對渾濁、不均一等物理性狀。經預實驗研究發(fā)現(xiàn)，若直接將脂質體進入高壓均質機循環(huán)，會由于溶液內存在不均勻性狀而對高壓均質機造成損耗，所以將應用薄膜水合法制備出的脂質體通過高速分散器分散剪切50s后上樣高壓均質機進行高壓剪切循環(huán)。經過高壓均質機處理的脂質體樣品澄清，均一，性質相對穩(wěn)定。由圖2、圖3可知，經過高壓均質機處理后的脂質體樣品平均粒徑明顯小于未經高壓均質機處理的脂質體樣品，且粒徑分布比較均勻。

圖2 應用薄膜水合法制備乳脂肪球膜磷脂維生素A脂質體的粒徑分布

2.4 應用掃描電子顯微鏡對凍干脂質體進行微觀結構的觀察分析

將最優(yōu)條件下應用薄膜水合法制備的脂質體先通過高速分散器分散剪切50s后上樣高壓均質機在103MPa壓力下進行高壓剪切循環(huán)。得脂質體樣品后，在樣品中加入濃度為15%的海藻糖作為凍干保護劑進行冷凍干燥（預凍方式為-18℃預凍24h）制得凍干脂質體。采用掃描電鏡（Scanning Electron Microscopy，SEM）觀察凍干脂質體的超微結構。置于掃描電鏡下觀察，拍照。工作參數(shù)為：加速電壓5kV，物鏡孔徑20μm。將凍干脂質體經掃描電鏡得到照片如圖4所示，凍干脂質體經過放大2500倍后可以看到，脂質體表面較光滑，分布比較均勻，呈球狀囊泡結構。

圖3 應用薄膜水合-高壓均質法制備乳脂肪球膜磷脂維生素A脂質體的粒徑分布

圖4 凍干脂質體掃描電鏡照片

3 結論

在單因素實驗的基礎之上，以磷脂濃度、磷脂與主藥比例、磷脂與膽固醇比例、維生素E占磷脂百分比濃度和反應溫度為自變量，以脂質體包封率為因變量，采用二次旋轉正交組合實驗方法設計實驗，用SAS軟件和Matlab軟件處理數(shù)據(jù)，優(yōu)化得到最佳制備參數(shù)為磷脂濃度7.43%，磷脂與主藥比例28.95∶1，磷脂與膽固醇比例為6.53∶1，維生素E占磷脂百分比濃度為0.83%，反應溫度59.58℃，所得最高包封率值為88.77%。本研究在薄膜水合法基礎之上建立了薄膜水合-高壓均質法，有效降低脂質體平均粒徑，并使脂質體粒徑分布比較均勻，提高脂質體物理穩(wěn)定性，從而開發(fā)制備出較高包封率，較低粒徑的可食性脂質體。

［1］ThompkinsonD K，KharbS.AspectsofInfantFood Formulation［J］.Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety，2007（6）：161-167.

［2］Loveday S M，Singh H.Recent advances in technologies for vitamin A protection in foods［J］.Trends in Food Scienceamp; Technology，2008，19：657-668.

［3］Thompson A K，Singh H.Preparation of Liposomes from Milk Fat Globule Membrane Phospholipids Using a Microfluidizer［J］. Journal of Dairy Science，2006，89：410-419.

［4］Thompson A K，Hindmarsh J P.Comparison of the Structure and Properties of Liposome Prepared from Milk Fat Globule Membrane and Soy Phospholipids［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2006，54：3704-3711.

［5］Thompson A K，Mozafari M R，Singh H.The properties of liposomes produced from milk fat globule membrane material using different techniques［J］.EDP Sciences，2007，13：349-360.

［6］陳建明，張仰眉，高申，等.維生素A前體脂質體的研制及其特性考察［J］.第二軍醫(yī)大學學報，2003，22：203-207.

［7］林強，劉國川.維生素E脂質體的制備與性能研究［J］.日用化學品科學，2006（1）：22-25.

［8］李慧良，高申，陳建明，等.維生素A神經酰胺脂質體的初步研究［J］.日用化學品科學，2007（9）：15-18.

［9］Argov N，Lemay D G，German J B.Milk fat globule structure and function：nanoscience comes to milk production［J］.Trends in Food Scienceamp;Technology，2008，19：617-623.

［10］Singh H.The milk fat globule membrane-A biophysical system for food applications［J］.Current Opinion in Colloidamp; Interface Science，2006（11）：154-163.

［11］田艷燕，段相林，常彥忠.番茄紅素脂質體的制備［J］.食品科學，2007（4）：128-133.

［12］李博群，梁冰，劉寧.乳脂肪球膜磷脂-免疫球蛋白G脂質體的制備［J］.中國農業(yè)科技導報，2009（3）：642-649.

Optimization of technology for preparing vitamin A liposomes from milk fat globule membrane phospholipids

GUO Chen-feng1，2，ZHANG Wei1，2，LIU Ning1，2，*
（1.Northeast Agricultural University，National Dairy Industry Engineering and Technique Center，Harbin 150086，China；2.Northeast Agricultural University，Key Laboratory of Dairy Science，Ministry of Education，College of Food Science，Harbin 150030，China）

Objective：To produce the vitamin A（VitA）liposomes from milk fat globule membrane（MFGM）phospholipids which were added into infant liquid laboratory milk and optimize the parameter of the product. Methods：VitA liposomes MFGM was produced using the thin film hydration-high pressure homogenization method，and MFGM phosphatide as film material.Based on the single-factor experiment，the influencing rule of phosphatide concentration，the ratio between phosphatide concentration and principal agents，phosphatide concentration and cholesterol，the percentage of Vitamin E in phosphatide concentration and reaction temperatures and other preparation factors were discussed.The optimal technical conditions were investigated by the quadratic regression rotatable orthogonal design，and using SAS and Matlab to disposal data.Results：The phosphatide concentration was 88.77%，the ratio of phosphatide and principal agent was 28.95∶1，the ratio of phosphatide and cholesterin was 6.53∶1，the percentage concentration of VitE was 0.83%，temperature was 59.58℃，and the ultramicrostructure of the liposome was sphere vesicle.Conclusions：This study confirmed that the method of thin film hydration-high pressure homogenization could be used in producing VitA liposomes MFGM which were added into infant food.

milk fat globule membrane phospholipids；vitamin A；thin film hydration-high pressure homogenization；liposomes

TS201.1

B

1002-0306（2011）02-0195-04

2010-02-02 *通訊聯(lián)系人

郭晨峰（1983-），男，碩士研究生，研究方向：脂質體在嬰兒食品中應用。

國家863計劃項目（2008AA10Z331）；黑龍江省“十一五”攻關課題（GB07B407）。