賀曉光，辛世華，方海田

（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川750021）

耐高糖度枸杞酒酵母菌的選育

賀曉光，辛世華，方海田

（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川750021）

以自然選育的酵母菌為出發(fā)菌，對其進(jìn)行紫外輻照誘變育種，從中選育出在較高的糖濃度下發(fā)酵良好的菌株，結(jié)果表明最佳誘變條件是：稀釋率為10-6，輻照距離d=15cm，輻照時(shí)間t=30s，該誘變菌在30%的初始糖濃度下生長良好，在溫度20～22℃條件下的鮮枸杞汁中發(fā)酵，產(chǎn)酒產(chǎn)香效果好。

枸杞酒酵母，高糖分離，誘變選育，紫外輻照

枸杞作為中藥藥用歷史悠久，現(xiàn)代科學(xué)研究證明枸杞有效成分為枸杞多糖，枸杞多糖具有激活T細(xì)胞，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫，抑制小鼠S-180腫瘤，抗衰老，促進(jìn)生長發(fā)育等多項(xiàng)機(jī)能［1］。以枸杞為原料釀造的枸杞酒含有枸杞諸多營養(yǎng)成分，它以誘人的色澤、獨(dú)特的口感、卓越的保健功效，填補(bǔ)了葡萄酒市場功能單一的缺憾［2］，枸杞酒的造法主要有浸泡法和釀造法兩種。目前市場上主要為浸泡酒，枸杞發(fā)酵酒的研究還少見［3］。生產(chǎn)中，酵母發(fā)酵采用多次補(bǔ)糖法以提高發(fā)酵效率，根據(jù)實(shí)際經(jīng)驗(yàn)，當(dāng)枸杞汁的初始糖濃度達(dá)到30%時(shí)，枸杞酵母發(fā)酵周期明顯變長，口感下降，發(fā)酵效果差。目前對于枸杞酵母的研究還很少見，所以選育出一株耐高糖度的酵母菌可以提高生產(chǎn)效率，減少生產(chǎn)環(huán)節(jié)中的污染可能，為枸杞酒的生產(chǎn)提供了新的菌株［4］，減少了生產(chǎn)成本，達(dá)到可觀的經(jīng)濟(jì)效益。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

枸杞 寧夏回族自治區(qū)中寧縣枸杞種植園無公害枸杞；砂糖 一級，市售；PDA培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基［5］、亞甲基藍(lán)酵母培養(yǎng)基 現(xiàn)配；出發(fā)菌株 通過自然分離。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料預(yù)處理 采摘新鮮無公害枸杞，榨汁后調(diào)整成分，將果汁中添加亞硫酸，添加濃度為0.01mol/L，添加量為6%，同時(shí)加入葡萄糖，調(diào)節(jié)糖度為30%，以檸檬酸調(diào)節(jié)pH=5.6。將調(diào)配好的枸杞汁自然發(fā)酵24h，將醪液以傾注法培養(yǎng)分離，使用孟加拉紅培養(yǎng)基，培養(yǎng)10h后將培養(yǎng)皿中生長旺盛的菌落挑取若干株，接入PDA培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)12h，分離獲得單個(gè)菌株生長出的菌落，在電子顯微鏡下觀察菌株形態(tài)，選與酵母菌形態(tài)相同的菌株，在PDA培養(yǎng)基上劃線分離6株，經(jīng)驗(yàn)證為酵母菌，保存，并標(biāo)記為：G、H、S、T、X、Y株。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)流程 自然發(fā)酵→篩選→出發(fā)菌株→物理誘變（紫外線）→分離正誘變株→發(fā)酵實(shí)驗(yàn)→性能測定

1.2.3 出發(fā)菌的酒精發(fā)酵實(shí)驗(yàn) 對分離出的6株菌株進(jìn)行模擬發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，觀察菌株的產(chǎn)酒率。將6株菌株分別接種到調(diào)整好的枸杞汁中25℃下恒溫發(fā)酵，一周后停止發(fā)酵，測酒精度，從中選出三株（X、S、G）產(chǎn)酒高、反應(yīng)快的菌作為誘變出發(fā)菌。

1.2.5 誘變菌株的耐糖度實(shí)驗(yàn) 對輻照誘變得到的6株酵母菌進(jìn)行耐糖度實(shí)驗(yàn)，選取5個(gè)枸杞汁濃度梯度，糖度從30%至50%，在20℃下進(jìn)行恒溫發(fā)酵，繪制生長曲線，觀察菌株的生長情況，結(jié)束時(shí)測定酒精度，比較在不同糖濃度下的生長情況和酒精轉(zhuǎn)化率，記錄數(shù)據(jù)，保存正向輻照誘變菌株。

2 結(jié)果與分析

2.1 出發(fā)菌株懸液濃度的選擇

菌懸液的濃度大小對輻照實(shí)驗(yàn)有很大影響。從培養(yǎng)基上挑取標(biāo)準(zhǔn)菌落溶于10mL，7%的NaCl無菌溶液中，制成原始菌種溶液，進(jìn)行稀釋制成稀釋度為10-4、10-5、10-6、10-7、10-8的5種菌體懸濁液，在同一條件下進(jìn)行輻照誘變（15W紫光燈，距離為15cm，時(shí)間為45s）。各組稀釋率下的致死率（見表1），確定稀釋率為10-6為最佳［6］。

表1 不同稀釋度對誘變的影響

2.2 輻照時(shí)間的確定

取標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，挑取每個(gè)菌落，均用7%無菌食鹽溶液1mL溶解，在紫光燈下輻照，取相同距離，然后用傾倒法培養(yǎng)24h，觀察生長出來的菌落數(shù)［7］；同樣方法，取30s輻照時(shí)間，取不同距離，觀察生長出的菌落數(shù)，以標(biāo)準(zhǔn)菌株生長出的菌落數(shù)為參照。

輻照實(shí)驗(yàn)過程要進(jìn)行避光處理，輻照結(jié)束后應(yīng)保持無光狀態(tài)1h，輻照時(shí)還應(yīng)注意溫度變化，溫度應(yīng)保持恒定，不易變化過大，影響結(jié)果。單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，確定最佳輻照時(shí)間t=30s。

圖1 不同輻照時(shí)間產(chǎn)生菌落數(shù)

根據(jù)輻照后觀察菌落數(shù)的個(gè)數(shù)在30s時(shí)，曲線出現(xiàn)最大斜率［8］，故選擇輻照時(shí)間為30s。

2.3 照射距離的確定

根據(jù)輻照誘變的基本要求，控制致死率在50%左右，從而篩選正向誘變耐高糖度的酵母菌，最終確定輻照時(shí)間為30s，輻照距離為15cm［9］。（見圖2）

由以上實(shí)驗(yàn)，確定輻照實(shí)驗(yàn)單因素條件為：稀釋率為10-6為最佳，最佳輻照距離d=15cm，輻照時(shí)間t =30s，在最佳條件下，對已誘變的菌株進(jìn)行分離，三代后能正常生長，不衰退即為誘變穩(wěn)定株，為：X-Ⅰ型，X-Ⅱ型，S-Ⅰ型，S-Ⅱ型，S-Ⅲ型，G-Ⅰ型六種亞型。

2.4 不同糖度下誘變菌株生長的影響

選取5個(gè)枸杞汁濃度梯度，糖度從30%至50%，對已分離的六種亞型菌株進(jìn)行培養(yǎng)，在25℃下進(jìn)行恒溫培養(yǎng)，48h后觀察菌落生長情況［10］。結(jié)果見表2。

圖2 不同距離對致死率的影響

表2 不同糖濃度下菌株在固體培養(yǎng)基上的生長情況

由表2看出，通過對輻照誘變得到的6株酵母菌進(jìn)行耐糖度實(shí)驗(yàn)，在 25℃下進(jìn)行恒溫培養(yǎng)［11］，在30%的糖度下6個(gè)菌株均能生長，而超過糖濃度35%，滲透壓增大，菌體不能正常代謝［12］。

2.5 生長速度曲線

使用調(diào)整好成分的枸杞汁使糖度保持在35%，分裝后接入分離后的6株菌，發(fā)酵48h，24h后每隔4h使用分光光度計(jì)，繪制菌種生長曲線［13］。

圖3 35%糖濃度下不同酵母的生長曲線

由圖3生長曲線可知，S-Ⅱ型酵母菌在高糖濃度枸杞汁條件下，能正常發(fā)酵生長。

2.6 產(chǎn)酒情況

在35%的糖度下發(fā)酵72h后，每8h測定一次酒精度，做6個(gè)菌株的酒精曲線，S-Ⅱ型酵母菌產(chǎn)酒曲線最高，最后得出此菌為輻照誘變目的菌株［14］。

圖4 六種不同酵母產(chǎn)酒精曲線

根據(jù)上圖連續(xù)曲線觀察可知S-Ⅱ型酵母菌在高糖濃度條件下產(chǎn)酒精效果最佳。

3 結(jié)論

通過對本實(shí)驗(yàn)自然分離的酵母進(jìn)行紫外照射誘變處理，誘變選育出S-Ⅱ型菌株的耐糖度可高達(dá)35%以上，產(chǎn)酒精速度快。研究中采用的紫外誘變的條件為稀釋率為10-6為最佳，最佳輻照距離d= 15cm，輻照時(shí)間t=30s，所得誘變株的耐糖度高于分離發(fā)酵菌株，有效地提高了菌株的生產(chǎn)酒精效率，是一株很有開發(fā)前景的釀酒酵母菌。

［1］劉云秀.酒用酵母菌紫外線誘變［J］.釀酒，2006（9）：33-35.

［2］刁小琴，關(guān)海寧，唐龔惕，等.濃香型枸杞酒釀造酵母的選育［J］.中國釀造，2008（18）：30-33.

［3］趙祥杰，楊榮玲.桑葚果酒酵母的誘變選育研究［J］.食品科技，2006（2）：33-37.

［4］趙超敏，車振明.工業(yè)有益微生物育種技術(shù)的研究進(jìn)展［J］.食品研究與開發(fā)，2008（2）：172-174.

［5］楊明琰，郭愛蓮.高產(chǎn)SOD酵母菌的誘變選育及發(fā)酵條件研究［J］.食品科學(xué)，2005（10）：147-150.

［6］劉云鶴.高效乳酸菌增殖培養(yǎng)的篩選［J］.淮海工學(xué)院學(xué)報(bào)，2003（12）：59-61.

［7］杜金華，張開利，杜連祥.UV誘變法選育pof-糖化酵母［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，1995（6）：33-38.

［8］肖冬光，劉青，李靜，等.釀酒酵母單倍體制備方法的優(yōu)化［J］.釀酒科技，2004（4）：21-22.

［9］高雯.食品酶學(xué)原理與分析方法［M］.黑龍江科學(xué)技術(shù)出版社，1991.

［10］寧正祥.食品成分分析手冊仁［M］.北京：中國輕工業(yè)出版社，1997.

［11］鄭懷林，本草述較注［M］.北京：中醫(yī)古籍出版社，2005.

［12］張偉，朱會(huì)霞，李英軍，等.Co60誘變原生質(zhì)體選育高產(chǎn)酒精酵母［J］.釀酒科技，2006（1）：23-26.

［13］鐘娟，周金燕，譚紅.抗真菌多肽-捷安肽素高產(chǎn)菌的選育［J］.應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2004，10（1）：104-107.

［14］楊明琰，張曉琦，沈儉，等.微生物發(fā)酵法生產(chǎn)超氧化物歧化酶的研究進(jìn)展［J］.微生物學(xué)雜志，2004，24（1）：49-51.

Breeding of Lycium barbarum’s yeast with high-sugar resistance

HE Xiao-guang，XI Shi-hua，F(xiàn)ANG Hai-tian
（College of Agriculture，Ningxia University，Yinchuan 750021，China）

A high-yield yeast which can fermen（tgrow）well under the high sugar density has been screened and bred by UV mutagenization.The result showed when the yeast was irradiated for 30s with 15cm away from it under the dilution ratio 10-6，the yeast would grow best.At the same time，when the initial sugar density was 30%and the temperature was 20～22℃，the mutafacient yeast grew best，it would produce the best favor wine.

Lycium barbarum’s yeast；sifting by high concentration ofsugar；mutation breeding；ultraviolet radiation

TS262.91

A

1002-0306（2011）02-0181-03

2010-01-27

賀曉光（1963-），男，教授，主要從事食品物性學(xué)研究。