楊海麟，王長城，張 玲，辛 瑜，孫 艷，王 武

（江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇無錫214122）

高密度培養(yǎng)重組E-COLI產(chǎn)膽固醇氧化酶的乳糖誘導(dǎo)策略

楊海麟，王長城，張 玲，辛 瑜，孫 艷，王 武*

（江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇無錫214122）

研究了乳糖誘導(dǎo)重組大腸桿菌表達(dá)膽固醇氧化酶。結(jié)果表明，乳糖不僅可以作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)外源蛋白的合成，而且能作為碳源促進(jìn)菌體的生長。通過對誘導(dǎo)條件的優(yōu)化，實現(xiàn)了重組大腸桿菌的高密度培養(yǎng)，最高密度達(dá)68.9（OD600）；在此基礎(chǔ)上確定了最佳的誘導(dǎo)時機(jī)為發(fā)酵中期，菌體產(chǎn)酶水平達(dá)6005.66U/L，生產(chǎn)強(qiáng)度為200.19U/L·h，實現(xiàn)了膽固醇氧化酶的高效生產(chǎn)。

膽固醇氧化酶，乳糖，補(bǔ)料流加，誘導(dǎo)時機(jī)

膽固醇氧化酶（COD）是一類黃素蛋白，屬于GMC氧化還原酶體系［1］，是膽固醇代謝過程中的一個關(guān)鍵酶。它能夠快速準(zhǔn)確地檢測出血清中膽固醇的濃度，用來診斷動脈硬化和其他脂質(zhì)紊亂疾病［2］。體內(nèi)過多的膽固醇是引起冠心病、動脈硬化和心肌梗塞的危險因素之一［3］。目前歐美等發(fā)達(dá)國家冠心病的死亡率已經(jīng)超過所有癌癥死亡率的總和，占總死亡率的27.4%［4］。我們一直嘗試將膽固醇氧化酶作為食品添加劑來降低食品中的膽固醇含量［5］。本實驗室桑吉等通過復(fù)合誘變使短桿菌產(chǎn)酶水平提高到1210U/L［6］，原始菌株必須在膽固醇的誘導(dǎo)下產(chǎn)酶，而膽固醇不易溶于水，不利于下游的分離提取。為了解決此問題，王龍剛、張玲等［7-8］構(gòu)建了重組大腸桿菌產(chǎn)膽固醇氧化酶，產(chǎn)酶水平可達(dá)700U/L。本人前期采用IPTG誘導(dǎo)重組大腸桿菌表達(dá)膽固醇氧化酶，經(jīng)過發(fā)酵優(yōu)化，產(chǎn)酶水平達(dá)到6436.56U/L，生產(chǎn)強(qiáng)度為459.75U/L·h，實現(xiàn)了膽固醇氧化酶的高效生產(chǎn)。在實驗室小規(guī)模的制備中，IPTG是常用的誘導(dǎo)劑，但是由于其昂貴的價格和潛在的毒性，極大地限制了IPTG在工業(yè)化生產(chǎn)中的應(yīng)用。乳糖是一種二糖，其價格低廉，無毒，也是乳糖操縱子的天然誘導(dǎo)劑，因此成為國內(nèi)外研究的熱點。Kweon［9］等發(fā)現(xiàn)，在搖瓶中 1mmol/L的乳糖誘導(dǎo)表達(dá) PIP（Ribosome-Inactivating Protein，pMS質(zhì)粒，E.coli TG1），發(fā)酵液中目的蛋白的含量達(dá)到IPTG誘導(dǎo)的55%；而 Woyski等［10］使用乳糖誘導(dǎo)表達(dá)細(xì)胞色素P450，表達(dá)量超過了1mmol/L的IPTG的誘導(dǎo)效果。張毅等［11］研究表明在搖瓶中乳糖的誘導(dǎo)效果與IPTG相近，但是在高密度發(fā)酵中，乳糖的誘導(dǎo)效果不及IPTG；李春麗等［12］使用乳糖誘導(dǎo)表達(dá)人β-防御素3達(dá)到IPTG的誘導(dǎo)效果；李兆鵬等［13］研究了高密度發(fā)酵中乳糖誘導(dǎo)表達(dá)人B淋巴細(xì)胞刺激因子（hBLyS），乳糖的誘導(dǎo)效果達(dá)到IPTG的55%。本人研究了高密度發(fā)酵中乳糖誘導(dǎo)重組大腸桿菌表達(dá)膽固醇氧化酶，使產(chǎn)酶水平達(dá)到6005.66U/L，為本人研究的IPTG（6436.56U/L）誘導(dǎo)效果的93%。

表1 乳糖濃度對菌體量和產(chǎn)酶的影響

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

E.coli JM109/pTrc99a-COD 本實驗室構(gòu)建并保存，構(gòu)建方法參考文獻(xiàn)［8］；LB培養(yǎng)基（g/L） 蛋白胨10，酵母提取物5，氯化鈉10，pH7.0，加入20g/L瓊脂為LB固體培養(yǎng)基；2-YT培養(yǎng)基（g/L） 蛋白胨16，酵母粉10，NaCl 5；發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L） 胰蛋白胨10，酵母提取物5，KH2PO42，K2HPO44，Na2HPO4· 12H2O 7，（NH4）2SO41.2，NH4Cl 0.2，MgSO4·7H2O 1，甘油10mL/L，微量元素［14］；補(bǔ)料基質(zhì)（g/L） 乳糖60，胰蛋白胨40，酵母提取物20，MgSO4·7H2O 6，甘油200mL/L；乳糖誘導(dǎo)液（g/L） 乳糖200，胰蛋白胨20，酵母提取物10，MgSO4·7H2O 3；培養(yǎng)基均添加過濾除菌的氨芐青霉素100mg/L；以上試劑 均為國產(chǎn)分析純。

BIOFLO110發(fā)酵罐 美國NBS公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

1.2.1.1 一級種子的制備 平板挑取單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)9h。

1.2.1.2 二級種子的制備 一級種子以5%的接種量接到2-YT培養(yǎng)基中，培養(yǎng)9h。

1.2.1.3 5L發(fā)酵罐中分批補(bǔ)料培養(yǎng) 取二級種子，按發(fā)酵罐起始工作體積的5%接種（罐中的起始工作體積為3L）。相關(guān)參數(shù)控制如下：溶氧及轉(zhuǎn)速：空氣流速3L/min，最低攪拌轉(zhuǎn)速為400r/min，分批階段控制溶解氧在40%，補(bǔ)料階段控制在10%，發(fā)酵罐提高或降低轉(zhuǎn)速自動控制。pH：自動流加30%的氨水和50%磷酸，使pH保持在7.0。溫度：37℃，自動控制。補(bǔ)料的流加：溶解氧反饋流加與恒pH-stat法。發(fā)酵罐流加泵全開的流速為10mL/min。

1.2.2 菌體破碎 8000r/min，4℃離心5min收集菌體后，用0.1mol/L、pH7.0的磷酸鉀緩沖液洗滌懸浮菌，超聲波破碎儀400W，工作5s，間歇5s，99個循環(huán)，超聲破碎菌體。4℃，12000r/min離心15min，去除細(xì)胞碎片沉淀，取上清進(jìn)行酶活分析。

1.2.3 酶活的測定 酶活力單位定義：37℃，1min轉(zhuǎn)化1μmol膽固醇生成膽甾-4-烯-3-酮的酶量定義為1個酶活單位（U）。酶活：（U/mL）=0.1315A500× 3.2×20/5=1.6832×A500。參考文獻(xiàn)［15］。

1.2.4 細(xì)胞濃度分析 將菌懸液作適當(dāng)稀釋，用紫外/可見分光光度計，于 600nm下測定吸收值（OD600）。OD600=OD600讀數(shù) ×稀釋倍數(shù)。菌體干重測定如下，取不同OD600的菌液20mL，8000r/min離心10min，清洗兩次，105℃烘干至恒定值，稱細(xì)胞干重，光密度值與細(xì)胞干重呈線性；一個單位的OD600約為干菌0.44g/L。

1.2.5 甘油質(zhì)量濃度的測定 高碘酸氧化法［16］。分別取0.50mL，加入2.50mL 6.6%偏高碘酸鈉溶液，混勻，在室溫靜置反應(yīng)20min，冰浴至0℃，加入0.50mL硝酸鉀飽和溶液，0℃保持10min，取1.00mL上層澄清溶液，加入2.00mL新鮮配制的1%鹽酸苯肼和1.00mL 2%鐵氰化鉀，混勻。在0℃靜置反應(yīng)20min后，邊攪拌邊緩緩加入5.00mL經(jīng)預(yù)冷卻的鹽酸和5.00mL乙醇，混勻，在室溫靜置反應(yīng)15min。在波長570nm進(jìn)行光密度測定，對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出甘油濃度。如圖1所示。

圖1 高碘酸氧化法測定甘油濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線

該方法雖然簡單且有一定的誤差，但可作為高密度發(fā)酵中精確度要求不高的甘油濃度的測定［16］。

2 結(jié)果與討論

2.1 分批發(fā)酵

以發(fā)酵培養(yǎng)進(jìn)行分批發(fā)酵，中途不補(bǔ)料，待甘油耗盡（以溶解氧為標(biāo)志）后，饑餓1h后一次性補(bǔ)入乳糖至終濃度分別為10、20、30g/L，實驗結(jié)果如表1。

從表中可以看出，乳糖加入發(fā)酵體系后，存在一個很長時間的適應(yīng)期，隨著乳糖濃度的提高其適應(yīng)期延長，可能是高濃度的乳糖對菌體的生長有一定的抑制作用，菌體需要更多的時間來排除抑制作用。實驗數(shù)據(jù)還表明隨著乳糖濃度的提高，乳糖對菌體的得率有所下降，酶活卻有所上升，這說明乳糖一部分被分解為葡萄糖和半乳糖，作為菌體生長的碳源，另一部分異構(gòu)化為異構(gòu)乳糖，誘導(dǎo)外源蛋白的合成。

此次實驗菌體密度較低，可能是營養(yǎng)不足，影響了菌體的生長，導(dǎo)致酶活較低，故打算采用流加乳糖的方法，提高菌體密度達(dá)到提高產(chǎn)酶水平的目的。

2.2 分批發(fā)酵中乳糖誘導(dǎo)策略

以發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行分批發(fā)酵，待甘油耗盡（以溶解氧為標(biāo)志）后，開始流加乳糖誘導(dǎo)液，根據(jù)分批發(fā)酵的經(jīng)驗可知，低濃度的乳糖其適應(yīng)期較短，所以在適應(yīng)期階段乳糖的流加策略定為，在10h內(nèi)補(bǔ)入乳糖至終濃度為10g/L（共計150mL乳糖誘導(dǎo)液），補(bǔ)料方法恒速流加。待大腸桿菌開始利用乳糖時，依據(jù)溶解氧的變化流加乳糖，使溶解氧維持在10%以上。實驗結(jié)果如圖2所示。

從圖中可以看出，乳糖流加的8h內(nèi)菌體沒有生長，屬于菌體對乳糖的適應(yīng)期，隨后菌體開始緩慢生長，在第27h菌體密度和酶活均達(dá)到最高，分別為44.21（OD600）和 1400.42U/L；單位菌體產(chǎn)酶量為71.99U/g；生產(chǎn)強(qiáng)度為51.87U/L·h。

圖2 流加乳糖誘導(dǎo)表達(dá)COD的發(fā)酵過程曲線

菌體在度過對乳糖的適應(yīng)期后，開始利用乳糖，生物量繼續(xù)增長，比生長速率為0.079/h，由于初始的菌體密度低，可能菌體仍有很大的生長空間，乳糖優(yōu)先作為碳源供菌體繼續(xù)生長，導(dǎo)致不能高效誘導(dǎo)外源基因的表達(dá)。故打算先將菌體密度培養(yǎng)到一定的濃度，再流加乳糖進(jìn)行誘導(dǎo)。

2.3 高密度發(fā)酵中乳糖的誘導(dǎo)策略

在前期實驗的基礎(chǔ)上，采用流加限制性機(jī)制（甘油）將菌體密度分別培養(yǎng)至 35.93，48.32，59.01（OD600），分別饑餓1h消耗盡殘留的甘油，再流加乳糖誘導(dǎo)外源基因的表達(dá)。實驗結(jié)果如下。

從圖3可以看出，菌體經(jīng)過9h的乳糖適應(yīng)期，菌體量開始繼續(xù)增長，比生長速率為0.037/h，在第34h菌體密度和酶活均達(dá)到最高，分別為66.1（OD600）和3400.06U/L；單位菌體產(chǎn)酶量為116.90U/g；生產(chǎn)強(qiáng)度為100.00U/L·h?？赡苁钦T導(dǎo)時的菌體密度依然偏低，導(dǎo)致乳糖主要用于菌體的生長，影響了乳糖的誘導(dǎo)效果。

圖3 乳糖早期誘導(dǎo)發(fā)酵過程曲線

從圖4可以得出，菌體在經(jīng)過8h的乳糖適應(yīng)期，菌體量開始繼續(xù)增長，比生長速率為0.023/h，在第34h菌體密度和酶活均達(dá)到最高，分別為70.1（OD600）和5817.14U/L；單位菌體產(chǎn)酶量為188.60U/g；生產(chǎn)強(qiáng)度為171.09U/L·h。在實驗的范圍內(nèi)為比較理想的條件，選取誘導(dǎo)時的菌體密度比較合理，兼顧到了菌體量和單位菌體產(chǎn)酶量。獲得了較高的產(chǎn)酶水平，生產(chǎn)強(qiáng)度有待進(jìn)一步的提高。

從圖5可以得出，菌體在經(jīng)過13h的乳糖適應(yīng)期，菌體量開始繼續(xù)增長，比生長速率為0.013/h，在第34h菌體密度和酶活均達(dá)到最高，分別為68.3（OD600）和2888.37U/L；單位菌體產(chǎn)酶量為96.11U/g；生產(chǎn)強(qiáng)度為84.95U/L·h。過晚地流加乳糖誘導(dǎo)，由于菌體的老化和溶解氧的不足，嚴(yán)重地影響了單位菌體產(chǎn)酶量，且乳糖的適應(yīng)期變長，發(fā)酵產(chǎn)酶時間短，導(dǎo)致發(fā)酵水平低。綜合分析圖3～圖5的數(shù)據(jù)，可以得出：a.低密度流加乳糖誘導(dǎo)，乳糖主要用于細(xì)胞生長，使膽固醇氧化酶的生產(chǎn)能力受到限制。b.誘導(dǎo)的菌體密度選擇過高時，雖然乳糖用于的細(xì)胞生長較少，但是菌體的老化和環(huán)境條件的不適宜，嚴(yán)重影響了單位菌體產(chǎn)酶量，使得發(fā)酵水平較低。c.在一定的菌體密度（48.32，OD600）流加乳糖誘導(dǎo)，乳糖在充當(dāng)碳源和誘導(dǎo)劑兩個功能中達(dá)到平衡，提高了發(fā)酵水平。

圖4 乳糖中期誘導(dǎo)發(fā)酵過程曲線

圖5 乳糖末期誘導(dǎo)發(fā)酵過程曲線

2.4 高密度發(fā)酵中縮短乳糖適應(yīng)期提高生產(chǎn)強(qiáng)度

乳糖的適應(yīng)期是關(guān)于二次生長的問題，乳糖前期不被利用，需要菌體在無其他碳源基質(zhì)的條件下才能分泌相關(guān)的酶來利用乳糖，所以考慮采用甘油和乳糖復(fù)合流加，縮短乳糖的適應(yīng)期，提高生產(chǎn)強(qiáng)度。前期的菌體生長階段采用恒pH-stat法和溶解氧反饋流加法，對兩種不同的流加策略進(jìn)行研究。

2.4.1 恒pH-stat法流加復(fù)合碳源基質(zhì) 在分批發(fā)酵結(jié)束后采用恒pH-stat法流加補(bǔ)料基質(zhì)（含甘油和乳糖兩種碳源），當(dāng)pH7.0時流加補(bǔ)料基質(zhì)，培養(yǎng)菌體密度至45（OD600）左右。該方法在復(fù)合流加階段菌體生長慢，甘油濃度能維持在一個較低的水平，實驗結(jié)果如圖6。

圖6 恒pH-stat法復(fù)合流加補(bǔ)料基質(zhì)

從圖6可以得出，在復(fù)合流加階段菌體的比生長速率為0.084/h，甘油基質(zhì)濃度低于2g/L，在第15h以后甘油濃度降到1g/L以下，在第18h菌體密度達(dá)到41.04（OD600），以后開始流加乳糖誘導(dǎo)液，此時乳糖適應(yīng)期不明顯，開始單一流加乳糖時，菌體量繼續(xù)增長，比生長速率為0.043/h；在第30h菌體密度和酶活均達(dá)到最高，分別為68.6（OD600）和6005.66U/L；單位菌體產(chǎn)酶量為198.97U/g；生產(chǎn)強(qiáng)度為200.19U/L·h。

2.4.2 溶解氧反饋流加法流加復(fù)合碳源基質(zhì) 在分批發(fā)酵結(jié)束后，根據(jù)溶解氧變化控制底物的流加速率，培養(yǎng)菌體密度至45（OD600）左右。該方法在復(fù)合流加階段菌體生長較快，甘油基質(zhì)濃度將維持在較高水平。

從圖7可以得出，在復(fù)合流加階段菌體的比生長速率為0.278/h，甘油基質(zhì)濃度高于3g/L，在第10h復(fù)合流加結(jié)束，以后開始流加乳糖誘導(dǎo)液，菌體經(jīng)過10h的乳糖適應(yīng)期后，菌體量開始繼續(xù)增長，比生長速率為0.021/h，在第34h菌體密度和酶活均達(dá)到最高，分別為69.8（OD600）和5938.33U/L；單位菌體產(chǎn)酶量為193.36U/g；生產(chǎn)強(qiáng)度為174.66U/L·h。

圖7 溶解氧反饋流加法復(fù)合流加補(bǔ)料基質(zhì)

綜合分析圖6和圖7的結(jié)果可以得出，a.當(dāng)甘油濃度低于2g/L時，菌體開始識別乳糖，當(dāng)甘油耗盡時，菌體開始利用乳糖，這樣可以避免因為菌體經(jīng)歷適應(yīng)期的饑餓而產(chǎn)生的負(fù)面影響，有利于外源基因的表達(dá)。b.當(dāng)甘油濃度高于3g/L時，雖然發(fā)酵培養(yǎng)基中有乳糖存在，但在甘油耗盡后，菌體依然要經(jīng)過一個適應(yīng)期，則說明在甘油濃度高于3g/L時菌體不識別乳糖；但從兩組實驗數(shù)據(jù)均可以分析出，當(dāng)菌體開始識別乳糖時，都需要約10h才能利用乳糖。

3 結(jié)論

3.1 本工作采用乳糖代替IPTG作為誘導(dǎo)劑，發(fā)現(xiàn)乳糖不僅可以誘導(dǎo)外源基因的表達(dá)，還可以促進(jìn)菌體的生長，菌體在利用乳糖時有一個適應(yīng)期約需10h。

3.2 在低濃度的甘油條件下，菌體可以提前識別乳糖，從而避免適應(yīng)期的饑餓，有利于外源基因的表達(dá)，提高生產(chǎn)強(qiáng)度。采用恒pH-stat法復(fù)合流加補(bǔ)料基質(zhì)，使得生產(chǎn)強(qiáng)度相對于單一碳源基質(zhì)流加，提高了17%。

3.3 優(yōu)化了乳糖的誘導(dǎo)策略，使得菌體的產(chǎn)酶水平達(dá)到6005.66U/L；生產(chǎn)強(qiáng)度為200.19U/L·h，為優(yōu)化后的IPTG誘導(dǎo)水平的93.3%（6436.56U/L，具體數(shù)據(jù)未列出），乳糖誘導(dǎo)表達(dá)膽固醇氧化酶的生產(chǎn)強(qiáng)度為IPTG誘導(dǎo)的47.4%（459.75U/L·h，具體數(shù)據(jù)未列出）。

乳糖誘導(dǎo)效果已經(jīng)相當(dāng)于IPTG的水平，但是生產(chǎn)強(qiáng)度低，還需要進(jìn)一步的優(yōu)化，大腸桿菌利用乳糖的β-半乳糖苷酶是誘導(dǎo)酶，可嘗試通過基因工程的手段將其改造為組成酶以達(dá)到縮短乳糖適應(yīng)期，實現(xiàn)提高生產(chǎn)強(qiáng)度的目的。

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High cell density culture of recombinant E.coli producing cholesterol oxidase as lactose induced strategy

YANG Hai-lin，WANG Chang-cheng，ZHANG Ling，XIN Yu，SUN Yan，WANG Wu*
（Key Laboratory of Industry Biotechnology of Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

The high cell density culture of recombinant E.coli producing cholesterol oxidase as lactose induced strategy was studied.lt was found that lactose could induce foreign protein expression and enhance cell growth during the induction period.Through proper optimization of culture and induction conditions，the cell density reached 68.9（OD600）.At the basic，the best induction time was identified as intermediate cell density.Under the optimized cultivation condition，the highest cholesterol oxidase activity（6005.66U/L）and highest cholesterol oxidase productivity（200.19U/L·h）were achieved.

cholesterol oxidase；lactose；Fed-batch；induction time

TS201.1

A

1002-0306（2011）02-0162-04

2009-12-25 *通訊聯(lián)系人

楊海麟（1971-），男，博士，副教授，研究方向：發(fā)酵工程。

國家863計劃課題資助項目（2006AA10Z305）；江南大學(xué)青年科學(xué)基金（2009LQN03）；工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室基金資助項目（KLI-KF200505）。