高義霞，楊 聲，周向軍，張 繼，2，*，張 花

（1.天水師范學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，甘肅天水741001；2.西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅蘭州730070）

羅望子多糖硫酸酯的制備及表征

高義霞1，楊 聲1，周向軍1，張 繼1，2，*，張 花1

（1.天水師范學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，甘肅天水741001；2.西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅蘭州730070）

利用水提醇沉、Sevage法及木瓜蛋白酶法從食品級(jí)的羅望子膠中分離、純化羅望子多糖，得到的羅望子多糖純度為92.7%。采用氯磺酸-吡啶法合成羅望子多糖硫酸酯，元素分析法測(cè)得其取代度為1.4；紅外表征發(fā)現(xiàn)硫在合成產(chǎn)物中以S=O雙鍵和C-O-S形式存在。

羅望子，硫酸化多糖，紅外光譜，元素分析

多糖硫酸酯是多糖大分子鏈中單糖分子鏈上的某種羥基被硫酸根所取代而形成的一類(lèi)化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜、生物活性多樣、構(gòu)效關(guān)系鮮明的多糖衍生物。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)硫酸酯化多糖具有多種生物活性，如增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、抗腫瘤、抗病毒等［1］。天然的硫酸多糖主要來(lái)源于動(dòng)物、植物、微生物的不同組織中，但其種類(lèi)和含量少。1988年，日本學(xué)者M(jìn)izumoto等人首次將硫酸基團(tuán)引入到一些均多糖結(jié)構(gòu)中，發(fā)現(xiàn)硫酸化多糖能抑制T淋巴細(xì)胞病毒，至此，硫酸化成為多糖結(jié)構(gòu)修飾中的一個(gè)重要方面［2］。為了提高多糖的生物活性，可通過(guò)硫酸化修飾等方法對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，獲取更多的多糖硫酸酯。羅望子膠是豆科羅望子屬植物（Tamarindus indica L.）果實(shí)中的果核胚乳部分，易分散于冷水中，加熱則形成粘稠狀液體［3］。通常約含有15%～22%的蛋白質(zhì)，0.7%～8%粗纖維，4%～7%油脂，2%～3%灰分及65%～72%左右的多糖。其多糖主要是由D-半乳糖、D-木糖、D-葡萄糖（1∶3∶4）組成的中性聚多糖，除多糖外，還有少量游離的L-阿拉伯糖。羅望子多糖的分子結(jié)構(gòu)中，主鏈為β-D-1，4-連接的葡萄糖，側(cè)鏈?zhǔn)铅?D-1，6-連接的木糖和β-D-1，2-連接的半乳糖，由此構(gòu)成了支鏈極多的多糖類(lèi)物質(zhì)［4］。羅望子多糖有良好的耐熱、耐鹽、耐酸、耐冷凍和解凍性，具有穩(wěn)定、乳化、增稠、凝結(jié)、保水、成膜的作用，其水溶液的粘稠性較強(qiáng)，黏度不受酸類(lèi)和鹽類(lèi)等的影響［5-6］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，羅望子多糖是葡聚木糖，它是一種理想的膳食纖維來(lái)源，可起到防治高血壓的作用，另外，還可增加小腸非擾動(dòng)層的厚度，減弱糖類(lèi)物質(zhì)的吸收，防止糖尿病的發(fā)生發(fā)展，具有無(wú)明顯毒副作用以及應(yīng)用過(guò)量不致產(chǎn)生低血糖等特性。但由于羅望子多糖粘度較高，影響了其在體內(nèi)的吸收，進(jìn)而影響了其活性作用，因此制備羅望子多糖硫酸酯，改變其物理特性，增加其生物活性，意義重大。本研究對(duì)羅望子多糖進(jìn)行硫酸酯化研究并利用紅外光譜掃描、元素分析等方法對(duì)酯化多糖進(jìn)行表征，為后續(xù)的藥理研究奠定理論基礎(chǔ)。硫酸酯化的方法很多，常用方法包括：濃硫酸法、三氧化硫-吡啶法、氯磺酸-吡啶法、氯磺酸-甲酰胺法等［7］，有研究發(fā)現(xiàn)氯磺酸-吡啶法操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)物回收容易、收率較高，是硫酸化多糖較為理想的一種方法［8］。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅望子膠 食品級(jí)，甘肅省弘諾科技貿(mào)易有限公司；氯磺酸、吡啶、二甲基甲酰胺 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

PLPHR 1-4LD真空冷凍干燥機(jī)，NOCOLET FT-IR360，Elementar Analysensysteme GmbH，722可見(jiàn)分光光度計(jì)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 羅望子多糖制備 準(zhǔn)確稱(chēng)取羅望子膠10g，溶脹于1000mL水中，80℃水浴提取2h。4層紗布過(guò)濾，棄濾渣，濾液離心后，上清液濃縮至200mL，加入4倍量75%乙醇4℃沉淀過(guò)夜，離心，沉淀冷凍干燥至恒重得粗多糖。取上述粗多糖，以固液比1∶100（m/v）加入蒸餾水于70℃水浴中溶解，用Sevage+木瓜蛋白酶法除蛋白［9］，上清液依次用流水和蒸餾水各透析1d（用1%AgNO3檢測(cè)蒸餾水透析后的袋內(nèi)及袋外物無(wú)白色沉淀生成），透析后的糖液濃縮至原體積的1/4倍后，加入乙醇使其濃度達(dá)到75%～80%，置4℃冰箱過(guò)夜，離心分離，收集沉淀并依次用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚洗滌兩次，冷凍干燥至恒重，得羅望子多糖。

1.2.2 多糖含量的測(cè)定 利用蒽酮硫酸法［10］對(duì)上述制備的羅望子多糖含量進(jìn)行測(cè)定。分別取0.1g/L的葡萄糖溶液0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.60、0.80mL，用蒸餾水補(bǔ)到1.00mL；分別加入4.00mL蒽酮試劑，迅速浸于冰水浴中冷卻，各管加完后一起浸于沸水浴中，管口加蓋玻璃球，以防蒸發(fā)。自水浴重新沸騰起，準(zhǔn)確煮沸10min取出，用自來(lái)水冷卻，室溫放置10min左右，于620nm比色。以同樣處理的重蒸餾水為空白，進(jìn)行比色。以光密度為縱坐標(biāo)，糖的含量（μg/mL）為橫坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。取40μg/mL羅望子多糖溶液1.00mL，加入蒽酮試劑，同標(biāo)準(zhǔn)曲線操作，比色測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品濃度計(jì)算含量。

1.2.3 羅望子多糖硫酸酯的制備

1.2.3.1 酯化試劑的制備 將附有冷凝、攪拌和恒壓漏斗裝置的反應(yīng)器置于0℃冰鹽浴中，加入24mL預(yù)冷的無(wú)水吡啶到三頸燒瓶中，攪拌使之充分冷卻。打開(kāi)恒壓漏斗的活塞，再將約4mL氯磺酸30min內(nèi)逐滴加入，見(jiàn)燒瓶中出現(xiàn)大量淡黃色固體，停止反應(yīng)，-20℃保存?zhèn)溆茫?1］。

1.2.3.2 酯化反應(yīng) 稱(chēng)取0.5g上述制備的羅望子多糖加入到約15mL的二甲基甲酰胺（DMF）中，超聲處理20min后，加入盛有上述酯化試劑的三頸燒瓶中，立即將其移入沸水浴，密封，恒溫磁力攪拌反應(yīng)2h。取出三頸燒瓶，冷卻至0℃，用0℃的2.5mol/mL的氫氧化鈉中和pH至中性，加入3倍體積無(wú)水乙醇，析出沉淀，過(guò)夜離心收集沉淀，并將沉淀用適量水溶解，用自來(lái)水透析2d，蒸餾水透析1d。袋內(nèi)物濃縮，冷凍干燥，得羅望子多糖硫酸酯。

1.2.4 羅望子多糖硫酸酯的鑒定

1.2.4.1 紅外光譜分析 采用溴化鉀壓片法對(duì)硫酸基進(jìn)行定性分析。

1.2.4.2 元素分析法 利用元素分析法測(cè)定硫酸酯化多糖中碳、氫、氮及硫含量，并計(jì)算取代度。取代度公式：DS=（1.62×S%）/（32-1.02×S%），其中，DS為取代度，S%為硫的百分含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 羅望子多糖含量測(cè)定

取40μg/mL羅望子多糖水溶液，以上述制作標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測(cè)定其吸光度為0.228，由回歸方程可計(jì)算出，純化的羅望子多糖純度為92.7%。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 紅外光譜分析

羅望子多糖及其硫酸酯紅外光譜見(jiàn)圖2，可知羅望子多糖在3436.04cm-1處有一強(qiáng)而寬的峰，是分子鍵氫鍵締合的羥基O-H的伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的，它是多糖的特征吸收峰；而經(jīng)硫酸化修飾后，可看出此處的峰移向3438.20cm-1，并且峰變窄變?nèi)酰砻饔捎诹蛩峄娜〈?，改變了局部的空間位置情況，使得羥基參與分子氫鍵的狀態(tài)發(fā)生了變化，有利于提高多糖的水溶性。峰高度的削弱表明硫酸基發(fā)生了取代，使羥基的數(shù)量減少。硫酸酯化后的多糖峰中1262.78、821.04cm-1是硫酸基的特征吸收。1262.78cm-1處的峰是O-SO3-的S=O雙鍵的伸縮振動(dòng)，821.04cm-1峰是C-O-S的伸縮振動(dòng)。

圖2 羅望子多糖及其硫酸酯紅外光譜

2.3 元素分析

由表1可知，經(jīng)元素分析，硫酸化羅望子多糖及其硫酸酯含氮量都為0，表明它們都不含有蛋白質(zhì)；硫酸化后，S的含量達(dá)14.7%，由取代度公式計(jì)算出其取代度為1.4。

表1 N、H、C、S元素分析結(jié)果

3 結(jié)論

本研究利用氯磺酸-吡啶法合成羅望子多糖硫酸酯，元素分析法檢測(cè)含硫量可計(jì)算出取代度為1.4；利用紅外光譜表征可知，硫在合成產(chǎn)物中以S= O雙鍵和C-O-S形式存在。對(duì)羅望子多糖硫酸酯化的修飾，旨在生產(chǎn)成本低廉、產(chǎn)物量大、生物學(xué)活性高、應(yīng)用廣泛的羅望子硫酸多糖，為羅望子的深度開(kāi)發(fā)和其在醫(yī)藥方面的應(yīng)用提供參考。

［1］田龍.獼猴桃果水溶性多糖硫酸酯的制備及抗氧化活性［J］.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2007，26（4）：570-573.

［2］向道斌，李曉玉.硫酸化多糖：一類(lèi)治療AIDS的新藥［J］.國(guó)外醫(yī)藥藥學(xué)分冊(cè)，1992，19（1）：1-5.

［3］詹曉北.食用膠的生產(chǎn)、性能與應(yīng)用［M］.北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，2003：199-227.

［4］蒲彪，鄧?yán)^堯，蔣華曾，等.羅望子果肉的營(yíng)養(yǎng)成分分析［J］.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1994（4）：455-457.

［5］胡國(guó)華.功能性食品膠［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2004：50-59.

［6］周家華.食品添加劑［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2001.

［7］栗衍華，譚成玉，王秀武，等.硫酸化多糖的制備及其生物活性的研究進(jìn)展［J］.精細(xì)與專(zhuān)用化學(xué)，2006，21（8）：6-9.

［8］徐文清.硫酸酯化多糖研究的新進(jìn)展［J］.天津藥學(xué)，2002，14（6）：1-4.

［9］張繼，高義霞，武光朋，等.沙蒿多糖的提取、純化工藝研究［J］.食品科學(xué)，2007，28（5）：125-127.

［10］張惟杰.糖復(fù)合物生化研究技術(shù)［M］.第二版.浙江：浙江大學(xué)出版社，1994：12-13.

［11］楊鐵虹，賈敏，商澎，等.當(dāng)歸硫酸酯的合成及其對(duì)脾細(xì)胞增值的作用［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001（5）：432-434.

Preparation and characterization of sulfated tamarind polysaccharide

GAO Yi-xia1，YANG Sheng1，ZHOU Xiang-jun1，ZHANG Ji1，2，*，ZHANG Hua1
（1.College of Life Science and Chemistry，Tianshui Normal University，Tianshui 741001，China；2.College of Life Science，Northwest Normal University，Lanzhou 730070，China）

A water-soluble polysaccharide was extracted from tamarind seed gum by method of boiling water and ethanol deposition.The crude polysaccharide was deproteined by Sevage combined with papain.The content of polysaccharides was 92.7%.Tamarind seed polysaccharides were sulfated by chlorosulfonic-pyridine methods，and its substitution degree was 1.4 measured by methods of elemental analysis.lR characterization showed that sulfur existed in the title products in the form of S=O and C-O-S.

Tamarindus indica L.；sulfated polysaccharide；lR；elemental analysis

TS201.1

A

1002-0306（2011）02-0142-03

2010-01-25 *通訊聯(lián)系人

高義霞（1982-），女，助教，研究方向：資源植物學(xué)。