陳學(xué)麗，葉立斌，勵(lì)建榮，*，孫金才，陳 衛(wèi)，許慶炎，Zhou K.

（1.浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江杭州310035；2.浙江海通食品集團(tuán)，浙江慈溪315300；3.Department of Food Scienceamp;Technology，Virginia Polytechnic Institute and State University，Blacksburg Virginia 24061）

楊梅渣黃酮類化合物提取及其抗氧化活性研究

陳學(xué)麗1，葉立斌1，勵(lì)建榮1，*，孫金才2，陳 衛(wèi)1，許慶炎2，Zhou K.3

（1.浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江杭州310035；2.浙江海通食品集團(tuán)，浙江慈溪315300；3.Department of Food Scienceamp;Technology，Virginia Polytechnic Institute and State University，Blacksburg Virginia 24061）

楊梅是我國(guó)的特產(chǎn)水果，年產(chǎn)量約為100萬(wàn)t，其中楊梅渣約占果實(shí)總重的10%。目前以楊梅為資源的食品工業(yè)已初具規(guī)模，然而在楊梅深加工過程中，楊梅渣都作為廢物進(jìn)行處理，對(duì)其開發(fā)利用仍然一片空白?；诖耍詶蠲吩鼮檠芯繉?duì)象，對(duì)楊梅渣中黃酮類化合物進(jìn)行提取、濃縮、萃取，分成四個(gè)級(jí)分（石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相）；用DPPH法、Fenton反應(yīng)法和還原能力評(píng)價(jià)了四個(gè)不同級(jí)分的楊梅渣提取物的體外抗氧化能力。結(jié)果表明，楊梅渣粗提物正丁醇相和乙酸乙酯相具有較強(qiáng)的清除DPPH自由基能力，其半抑制濃度（IC50）分別為30、40μg/mL，分別是維生素C（IC50=110μg/mL）的3.67、2.75倍。

楊梅渣，總黃酮，提取，抗氧化

楊梅中含豐富的蛋白質(zhì)、維生素、檸檬酸、多糖和多酚類等多種營(yíng)養(yǎng)和功效成分［1］，具有消食、御寒、消暑、止瀉、治療痢疾以及生津止咳、清腸胃等多種藥用價(jià)值，是水果中的醫(yī)藥珍品?，F(xiàn)代研究表明，其中所含的黃酮類化合物［2-3］，如楊梅素、二氫楊梅素、槲皮素等具有明顯的抗?jié)?、抗炎、抗菌、抗氧化、增?qiáng)機(jī)體免疫力、軟化血管、降血糖、降血脂等生理活性作用［4］。楊梅渣是楊梅榨汁或釀酒后的副產(chǎn)物，占楊梅總重的10%，年產(chǎn)量約為10萬(wàn)t，且呈逐年上升趨勢(shì)，但均作為廢物處理，污染環(huán)境。開發(fā)利用楊梅渣資源，不但解決了廢渣處理所帶來(lái)的環(huán)境污染問題，而且延長(zhǎng)了楊梅產(chǎn)業(yè)鏈。因此，以楊梅渣為研究對(duì)象，提取其中的黃酮類化合物，開發(fā)其藥用價(jià)值功能，對(duì)進(jìn)一步利用楊梅資源具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。鑒于此，本文對(duì)楊梅渣的黃酮類物質(zhì)進(jìn)行了提取并對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行了初步研究，為楊梅渣的進(jìn)一步開發(fā)提供一定的科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

楊梅渣 浙江海通食品集團(tuán)股份有限公司提供；DPPH（2，2-Diphenyl-1-Picrylhydrazyl） Sigma公司（Germany）。

MODULYOD-230型真空冷凍干燥機(jī) Thermo Co.，Ltd.；UV-2550紫外可見光分光光度計(jì)SHIMADZU Co.，Ltd.；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、循環(huán)水式多用真空泵 SHB-ⅢA 上海亞榮生化儀器廠；KQ-100型超聲波 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 楊梅渣黃酮類化合物的提取 稱取一定量的楊梅渣粉末，與70%的乙醇按料液比1∶30混勻，60℃超聲提取30min，提取兩次，真空抽濾，除去濾渣，合并濾液。濾液再經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（45℃）濃縮至浸膏狀。

1.2.2 楊梅渣黃酮類化合物的萃取 用三倍的去離子水溶解浸膏，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分別萃取兩次，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（45～55℃）濃縮至呈浸膏狀，冷凍干燥，即得石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相，于超低溫冰箱保存，待用。

1.2.3 粗提物中總黃酮含量的測(cè)定

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取 10mg蘆?。?20℃干燥至恒重），用30%的乙醇溶液溶解，置于100mL容量瓶中，加30%的乙醇溶液定容，得100μg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。

準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，分別置于10mL刻度試管中，各加30%的乙醇至5.0mL，加5%的亞硝酸鈉0.4mL，搖勻，放置5min，再加10%的硝酸鋁溶液0.4mL，搖勻，放置5min，加4%的氫氧化鈉溶液4.0mL，搖勻，最后加30%的乙醇定容至刻度，搖勻，放置10min。在波長(zhǎng)510nm處測(cè)定其吸光度。以濃度C（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3.2 粗提物中總黃酮含量的測(cè)定［5-6］稱取0.1g粗提物，用30%的乙醇溶液溶解，置于100mL的容量瓶中，加30%的乙醇溶液定容得1mg/mL的樣品溶液，備用。每次準(zhǔn)確量取2.0mL置于10mL刻度試管中，按照上述方法測(cè)定510nm處的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出濃度，計(jì)算總黃酮含量。

1.2.4 抗氧化作用

1.2.4.1 清除DPPH自由基的能力測(cè)定［7-10］將楊梅渣黃酮粗提物稀釋成不同濃度梯度：50、100、200、400、600μg/mL，各取2mL上述濃度的粗提液于比色管中，再加入2mL 0.1mmol/L的DPPH甲醇溶液，混合均勻，30℃避光靜置30min后測(cè)定517nm處的光吸收值。同時(shí)以相同濃度梯度的VC作為對(duì)照，重復(fù)上述操作。

DPPH自由基清除能力的計(jì)算公式為：

式中，Ab為2mL乙醇或水+2mL DPPH溶液的吸光值，Ac為2mL樣品溶液+2mL甲醇的吸光值，As為2mL樣品+2mL DPPH溶液的吸光值。

1.2.4.2 清除羥基自由基的能力測(cè)定［11］參照Fenton反應(yīng)的方法建立反應(yīng)體系模型，利用H2O2與二價(jià)鐵離子混合后產(chǎn)生·OH。Fenton反應(yīng)為：H2O2+Fe2+=OH-+·OH+Fe3+，但·OH具有很強(qiáng)的反應(yīng)活性，存活時(shí)間短，若在反應(yīng)體系中加入水楊酸，能有效地捕捉·OH并產(chǎn)生有色產(chǎn)物。該產(chǎn)物在510nm處有較強(qiáng)吸收，若加入具有清除·OH功能的被測(cè)物便會(huì)與水楊酸競(jìng)爭(zhēng)·OH，從而使有色產(chǎn)物的生成量減少，采用固定反應(yīng)時(shí)間法，在510nm處測(cè)定吸光度，并做空白對(duì)照，便能測(cè)定被測(cè)物對(duì)·OH的清除作用。

式中：A損傷為反應(yīng)體系原來(lái)的吸光度，A未損傷為加入提取液但不加入H2O2的吸光度，A加樣為反應(yīng)體系加入提取液后的吸光度。

將楊梅渣黃酮粗提物稀釋成不同濃度梯度：50、100、200、400、600μg/mL。取6mmol/L水楊酸1mL于10mL試管中，加入2mmol/L的FeSO41mL，搖勻，再加入6mmol/L H2O21mL，搖勻，于37℃水浴中恒溫15min后，測(cè)定其吸光度A損傷（用水作為參比）。測(cè)定后，各加入上述濃度的粗提液 1mL，搖勻，放置10min，再測(cè)定其吸光度 A加樣，并用水代替 H2O2的A未損傷做參照，使用公式進(jìn)行計(jì)算即可得清除率。同時(shí)以相同濃度的BHT和VC作為對(duì)照，重復(fù)上述操作。

1.2.4.3 還原能力的測(cè)定［12-16］將楊梅渣黃酮粗提物配成400μg/mL，取2.5mL樣品于試管中，依次加入2.5mL 0.2mol/L PBS和2.5mL 1%六氰合鐵酸鉀溶液，于50℃水浴保溫20min后快速冷卻，再加入2.5mL 10%三氯乙酸溶液。然后取2.5mL于10mL比色管中，依次加入2.5mL蒸餾水，0.5mL 0.1%三氯化鐵，充分混合后，靜置10min，在700nm處［17］測(cè)定其吸光值A(chǔ)（以蒸餾水作參比）。吸光度值越大，表示還原力越強(qiáng)（以BHT和VC作對(duì)照，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)）。

2 結(jié)果與分析

2.1 總黃酮的測(cè)定

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 從圖1可以看出，蘆丁濃度在0～50μg/mL范圍內(nèi)，與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)性達(dá)到0.9996，線性回歸方程為：y=0.0133x +0.0023，式中：y表示波長(zhǎng)在510nm處的吸光度，x表示蘆丁的濃度。

2.1.2 粗提物中總黃酮含量的測(cè)定 根據(jù)測(cè)定結(jié)果得出各樣品中總黃酮含量，結(jié)果見表1。

表1 樣品總黃酮含量

2.2 抗氧化能力的測(cè)定

2.2.1 清除DPPH自由基的能力 DPPH自由基是一種很穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，對(duì)其清除的效果表明，樣品能有效降低羥自由基、烷自由基或過氧自由基和打斷脂質(zhì)過氧化鏈反應(yīng)。楊梅渣黃酮類化合物的粗提物對(duì)DPPH自由基的清除效果見圖2。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 粗提物對(duì)DPPH自由基的清除作用

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著粗提物濃度的增加，清除DPPH自由基的效果越好。乙酸乙酯相和正丁醇相對(duì)DPPH自由基的清除能力大于VC，而水相和石油醚相的清除能力相對(duì)較弱。根據(jù)線性回歸方程，可以求出正丁醇相和乙酸乙酯相的IC50（即清除率達(dá)到50%時(shí)所需藥物的濃度）分別為30、40μg/mL，清除能力分別是VC的3.67倍和2.75倍（VC的 IC50為110μg/ mL），表明楊梅粗提物的乙酸乙酯相和正丁醇相表現(xiàn)出很強(qiáng)的清除DPPH自由基的能力。

2.2.2 清除羥基自由基的能力 由圖3可知，楊梅渣粗提物對(duì)·OH有著一定的清除作用，且隨著提取液濃度的增加，清除效果越好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，石油醚相在清除·OH方面表現(xiàn)出比另外三相更好的清除效果，清除效果小于VC，但大于BHT。

圖3 粗提物對(duì)羥基自由基的清除作用

2.2.3 還原力的測(cè)定 還原力的測(cè)定，是檢驗(yàn)樣品是否為良好的電子供應(yīng)者。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在濃度為400μg/mL時(shí)，乙酸乙酯相的還原能力略小于VC，但大于BHT。實(shí)驗(yàn)表明，乙酸乙酯相可能是良好的電子供應(yīng)者，其供應(yīng)的電子可使Fe3+還原為Fe2+，也可參與自由基反應(yīng)，使其成為穩(wěn)定的物質(zhì)。

3 結(jié)論

3.1 蘆丁濃度在0～50μg/mL范圍內(nèi)，與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，楊梅渣粗提物乙酸乙酯相和正丁醇相中總黃酮含量較高，分別為13.0%，6.5%。

3.2 抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，楊梅渣粗提物對(duì)DPPH自由基、羥基自由基的清除效果和還原能力都在一定濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)濃度依賴性，隨著樣品濃度的增加而增大。楊梅渣粗提物正丁醇相和乙酸乙酯相具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力，其清除率IC50相應(yīng)為30、40μg/mL，分別約為VC的3.67倍、2.75倍。

3.3 楊梅渣粗提物對(duì)DPPH自由基表現(xiàn)出很強(qiáng)的清除效果，乙酸乙酯相＞正丁醇相＞水相＞石油醚相，這與四個(gè)提取相總黃酮含量是呈正相關(guān)的。結(jié)合清除DPPH自由基能力和還原力來(lái)看，楊梅渣提取物正丁醇相和乙酸乙酯相有待進(jìn)一步分離純化及鑒定，以確定楊梅渣中抗氧化活性成分。

3.4 楊梅渣粗提物表現(xiàn)出良好的抗氧化性，具有廣闊的開發(fā)前景，有望通過進(jìn)一步研究開發(fā)純天然的食品抗氧化劑，這對(duì)楊梅產(chǎn)業(yè)的發(fā)展大有裨益。

圖4 粗提物還原力測(cè)定

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Research on the extraction and anti-oxidation of flavonoids in Myrica rubra marc

CHEN Xue-li1，YE Li-bin1，LI Jian-rong1，*，SUN Jin-cai2，CHEN Wei1，XU Qing-yan2，Zhou K.3
（1.College of Food Science and Biotechnology Engineering，Zhejiang Gongshang University，Hangzhou 310035，China；2.Zhejiang Haitong Food Group，Cixi 315300，China；3.Department of Food Scienceamp;Technology，Virginia Polytechnic Institute and State University，Blacksburg Virginia 24061，USA）

Myrica rubra is a specific fruit species in China，annual production of which is about 1 million tons，and Myrica rubra marc accounts for 10%of total weight of the fruit.At present，the food industry based on Myrica rubra resources has a certain scale，while the utilization of Myrica rubra marc is still blank.The fractions were acquired from Myrica rubra marc by a series of steps including extraction and concentration，followed by extraction with petroleum ether，ethyl acetate，n-butanol.The anti-oxidative activities of the extracts were evaluated in vitro，including DPPH radical scavenging activity，F(xiàn)enton action and reducing power methods.The results showed that n-butanol fraction and ethyl acetate fraction of Myrica rubra marc crude extracts exhibited strong scavenging abilities for DPPH free radical，their half-inhibitory concentration（lC50）were 30μg/mL and 40μg/mL，respectively，and were approximately 3.67 times and 2.75 times as much as that of Vitamin C（110μg/mL）.

Myrica rubra marc；total flavonoids；extraction；anti-oxidation

TS201.1

A

1002-0306（2011）02-0085-04

2010-01-08 *通訊聯(lián)系人

陳學(xué)麗（1985-），女，碩士，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。

“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（2006BAD27B03）；寧波市農(nóng)業(yè)攻關(guān)國(guó)際科技合作項(xiàng)目（2008C10042）。