陸美斌 李為喜 武 力 王步軍

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所農(nóng)業(yè)部谷物品質(zhì)監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心，北京 100081)

HPLC測定谷物中玉米赤霉烯酮的不確定度評(píng)定

陸美斌 李為喜 武 力 王步軍

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所農(nóng)業(yè)部谷物品質(zhì)監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心，北京 100081)

依據(jù)JJF 1059—1999《測量不確定度評(píng)定與表示》和JJF 1135—2005《化學(xué)分析中不確定度評(píng)定》原理及方法，通過分析谷物中玉米赤霉烯酮的測定過程，確定各個(gè)不確定度來源，建立不確定度評(píng)定數(shù)學(xué)模型，對(duì)單個(gè)不確定度分量進(jìn)行合成和擴(kuò)展，最終建立高效液相色譜法測定谷物中玉米赤霉烯酮的不確定度評(píng)定方法。結(jié)果表明:玉米赤霉烯酮含量=(57．82±2．67)μg/kg，K=2。測量不確定度的主要來源為4個(gè)方面，按引入的不確定度分量貢獻(xiàn)大小排序，依次為溶液測定、測量重復(fù)性、樣品定容、稱樣量。

高效液相色譜法 玉米赤霉烯酮 不確定度

玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)又稱F－2毒素，是主要由鐮刀菌產(chǎn)生的2，4一二羥基苯甲酸內(nèi)酯類化合物，它是糧食安全衛(wèi)生的重要理化指標(biāo)。目前許多國家對(duì)玉米赤霉烯酮含量都有嚴(yán)格規(guī)定，我國《糧食衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB 2715—2005)也明確要求小麥、玉米中玉米赤霉烯酮含量不能超過60 μg/kg［1］。在分析測試領(lǐng)域中，有效評(píng)定玉米赤霉烯酮測量結(jié)果質(zhì)量顯得尤為重要。不確定度作為一種科學(xué)方法，是實(shí)驗(yàn)室工作的重要質(zhì)量指標(biāo)，測量結(jié)果的可用性很大程度上取決于不確定度的大小。鑒于目前國內(nèi)幾乎沒有玉米赤霉烯酮測量不確定度研究的報(bào)道，本研究參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009．209—2008《谷物中玉米赤霉烯酮的測定》［2］，以玉米為例，對(duì)谷物中玉米赤霉烯酮的測定進(jìn)行分析評(píng)定，建立液相色譜法測定谷物中玉米赤霉烯酮的不確定度評(píng)定方法，以期為正確評(píng)價(jià)和使用檢測數(shù)據(jù)提供科學(xué)的依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料、試劑與儀器

樣品來源及處理:2009年大田玉米，晾干，手工脫粒，粉碎(20目)。

甲醇(HPLC級(jí))、乙腈(HPLC級(jí)):美國Fisher公司;氯化鈉:北京化工廠;玉米赤霉烯酮免疫親和柱:美國Vicam公司;玻璃纖維濾紙:美國Whatman公司、玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品(Z2125－10MG):日本Sigma公司。除另有規(guī)定外，所用試劑均為分析純，水為高純水。

LC－20AB高效液相色譜儀配有熒光檢測器:日本Shimadzu公司;1093型粉碎機(jī):瑞典 Vetcator公司;T18 basic均質(zhì)機(jī):德國IKA公司;BF－2000M型氮吹儀:北京八方世紀(jì)科技有限公司;ACO－5503型超靜強(qiáng)力氣泵:廣東海利集團(tuán)有限公司;玻璃注射器(20 mL):北京中檢維康技術(shù)有限公司;1702型電子天平(感量0．1mg):西德Sartorius公司。

1．2 測量原理與方法

1．2．1 測量原理

試樣中玉米赤霉烯酮用乙腈－水提取，提取液經(jīng)免疫親和柱凈化、濃縮后，用配有熒光檢測器的液相色譜儀進(jìn)行測定，外標(biāo)法定量。

1．2．2 測定過程

稱取樣品40 g，置于250 mL具塞三角瓶中，加入4 g氯化鈉和100 mL乙腈－水(9+1)，高速攪拌提取2min，用折疊快速定性濾紙過濾，移取10．0 mL濾液并加入40 mL水稀釋均勻，經(jīng)玻璃纖維濾紙過濾1～2次，至濾液澄清。將免疫親和柱連接20 mL玻璃注射器。準(zhǔn)確移取10 mL提取濾液，注入玻璃注射器中，連接空氣壓力泵與玻璃注射器，調(diào)節(jié)壓力使溶液以1～2滴/s的流速緩慢通過免疫親和柱，直至有部分空氣通過柱體。以5 mL水淋洗柱子1次，棄去全部流出液，并使部分空氣通過柱體。準(zhǔn)確加入1．5 mL甲醇洗脫，流速為1 mL/min，手機(jī)洗脫液于玻璃試管，55℃以下氮?dú)獯蹈桑?．0 mL流動(dòng)相溶解殘?jiān)?，供液相色譜測定。同時(shí)做空白試驗(yàn)。

1．2．3 工作曲線繪制

0．1 mg/mL玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)溶液配制:準(zhǔn)確稱取10 mg玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈溶解定容至100 mL。由0．1 mg/mL玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)溶液用流動(dòng)相逐級(jí)稀釋配置成200、100、50、20、10 ng/mL 系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。以空白作參比，同測量步驟選定的儀器條件測定峰面積。以濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線。

1．3 數(shù)據(jù)處理

利用極差法、最小二乘法等統(tǒng)計(jì)方法計(jì)算分析，使用Excel 2003軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2．1 數(shù)學(xué)模型

根據(jù)測定原理及方法，測定結(jié)果和有關(guān)參數(shù)有如下函數(shù)關(guān)系:

式中:X為試樣中玉米赤霉烯酮含量/μg/kg;c為由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的試樣溶液中玉米赤霉烯酮的濃度/ng/mL;V為樣品最終定容體積/mL;m為樣液代表的試樣量/g;rec為回收率校正因子，由添加回收試驗(yàn)所得，表示測量結(jié)果系統(tǒng)偏差的參數(shù);rep為總重復(fù)性因子，由重復(fù)性試驗(yàn)所得，表示測量結(jié)果間一致性的參數(shù)。

從數(shù)學(xué)模型看出，各影響參數(shù)相互獨(dú)立，各參數(shù)的不確定度直接對(duì)被測量X的不確定度產(chǎn)生影響，根據(jù)JJF1135—2005《化學(xué)分析中不確定度評(píng)定》［3］，合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度可用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度進(jìn)行，公式如下:

2．2 不確定度來源

玉米赤霉烯酮測定的不確定度來源主要包括樣品稱量引入的不確定度、樣品定容體積引入的不確定度、測量用樣品溶液中玉米赤霉烯酮含量引入的不確定度、測量重復(fù)性引入的不確定度和分析程序的系統(tǒng)偏差引入的不確定度，因果關(guān)系如圖1所示。

樣品稱量引入的不確定度與天平稱量的最大允許誤差和重復(fù)性誤差有關(guān);樣品定容體積引入的不確定度與定容用容量瓶、移液器體積、定容溫度與校正溫度不同引起體積變動(dòng)有關(guān);測量用樣品溶液中玉米赤霉烯酮含量引入的不確定度與擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線求玉米赤霉烯酮含量、玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)溶液和配制標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定度有關(guān)。

圖1 不確定度的因果關(guān)系圖

重復(fù)性引入的不確定度:分析方法本身的變動(dòng)性通常難以量化，尤其是復(fù)雜的分析過程，很難用技術(shù)文件數(shù)據(jù)進(jìn)行不確定度評(píng)定，應(yīng)盡可能進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，將結(jié)果進(jìn)行量化統(tǒng)計(jì)得出不確定度。

分析程序的系統(tǒng)偏差引入的不確定度:分析程序的系統(tǒng)偏差可以通過加標(biāo)回收試驗(yàn)進(jìn)行研究評(píng)定。

2．3 不確定度分量評(píng)定

2．3．1 樣品稱量引入的不確定度U(m)

根據(jù)天平鑒定證書，其最大允許誤差為0．4 mg，按照矩形分布［1］，引入的不確定度為 0．4÷31/2=0．230 9 mg?？紤]到天平有去皮操作，稱量一次引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度 U(m)為21/2×0．230 9=0．326 5 mg。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度Urel(m)=U(m)÷m=0．326 5 mg÷40 g=8．16 ×10－6。

2．3．2 定容體積引入的不確定度U(V)

按照 JJG646—2006《移液器檢定規(guī)程》［4］和相關(guān)產(chǎn)品證書，用最大允差計(jì)算不確定度，假設(shè)為三角分布(表1)。

合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度 Urel(V)=［(3．54×10－3)2+(6．94 ×10－4)2+(2．04 ×10－3)2+(2．04 ×10－3)2］1/2=4．62 ×10－3。

表1 樣品定容引入的不確定度

試驗(yàn)室環(huán)境溫度一般為20℃，由于溫度波動(dòng)引起的液體體積膨脹導(dǎo)致的不確定度忽略不計(jì)。

2．3．3 測定樣品溶液中玉米赤霉烯酮含量引入的不確定度U(c)

2．3．3．1 擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線求玉米赤霉烯酮含量引入的不確定度

乙腈溶解玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品配制成0．1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，使用前用流動(dòng)相稀釋成適當(dāng)質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，進(jìn)行2次重復(fù)測定，結(jié)果如表2所示。

表2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線測定結(jié)果

根據(jù)表2結(jié)果，用線性最小二乘法［3］擬合校準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=814．0X－810．4，相關(guān)系數(shù)r=0．999 96，記為 Y=BX+A，其中 B=814．0，A=－810．4。對(duì)測定用樣品溶液中玉米赤霉烯酮含量進(jìn)行 2 次測定，結(jié)果分別為 44．65、47．87 ng/mL，平均值為46．26 ng/mL。

C的標(biāo)準(zhǔn)不確定度由下式［2］可得:

從計(jì)算公式可以看出，樣品溶液濃度偏離標(biāo)準(zhǔn)工作曲線濃度平均值越大，不確定度就越大，與平均值相等情況下，不確定度值最小。這是由線性最小二乘法本身所決定的。在試驗(yàn)過程中應(yīng)選擇適當(dāng)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，有利于減小由此引入的不確定度。

2．3．3．2 配制玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)工作曲線引入的不確定度

用乙腈溶解10 mg玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品定容于100 mL容量瓶，配制成0．1 mg/mL玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品證書未提供不確定度信息，假定其不確定度為0．100 mL，容量瓶最大允差為 ± 0．01 mL［5］，按照三角分布計(jì)算不確定度0．01÷61/2=0．004 08 mL，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0．004 08 ÷100=4．08 ×10－5。0．1 mg/mL 玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為［(4．08×10－5)2+(0)2］1/2=4．08 ×10－5。

分別移取5、10、25、50、100 μL 至50 mL 容量瓶，定容，此溶液為玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。按照J(rèn)JG 646—2006［4］和 JJG 196—2006［5］，用最大允差計(jì)算不確定度，假設(shè)為三角分布(表3)。合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為［(1．22 × 10－2)2+(4．08 × 10－3)2+(2．04 ×10－3)2+(2．45 ×10－3)2+(6．12 ×10－3)2+(9．13 ×10－4)2］1/2=1．47 ×10－2。

表3 配制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線時(shí)量器校準(zhǔn)引入的不確定度

由表3數(shù)據(jù)得出相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為［(4．08×10－5)2+(1．47 ×10－2)2］1/2=1．47 ×10－2。

2．3．3．3 配制過程溫度變化產(chǎn)生的不確定度

實(shí)驗(yàn)室溫度控制嚴(yán)格，一般為20℃，波動(dòng)很小，由此引入的不確定度忽略不計(jì)。

2．3．3．4 合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

測定樣品溶液中玉米赤霉烯酮含量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度 U(c)=［(1．25 ×10－2)2+(1．47 ×10－2)2］1/2=1．93 ×10－2。

2．3．4 測量重復(fù)性引入的不確定度U(rep)

在重復(fù)性條件下，對(duì)同一樣品進(jìn)行5次獨(dú)立觀測，測量結(jié)果分別為 56．86、58．94、57．79、56．70、58．8 μg/kg，5 次測量的平均值為 57．82 μg/kg，用極差法［6］求得不確定度為 2．24 ÷ 2．33 ÷21/2=0．68 μg/kg，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為 U(rep)=0．68 ÷57．82=1．18 ×10－2，其中 2．33 為極差系數(shù)。

不確定度評(píng)定中應(yīng)盡可能進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，以取得包括化學(xué)反應(yīng)過程(如本試驗(yàn)中的提取凈化過程等)和各測量變動(dòng)性在內(nèi)的重復(fù)性數(shù)據(jù)。評(píng)定了測量重復(fù)性分量，則儀器本身的變動(dòng)性、器皿和天平讀數(shù)等的重復(fù)性不必再評(píng)定。一般情況下，重復(fù)性的不確定度分量貢獻(xiàn)較大，不容忽視。本研究將空白引入的不確定度放入到重復(fù)性引入的不確定度中一并考慮。

2．3．5 分析程序的系統(tǒng)偏差引入的不確定度U(rec)

進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，添加水平為50 μg/kg，11個(gè)樣品的平均回收率為97．9%，標(biāo)準(zhǔn)偏差4．1%，標(biāo)準(zhǔn)不確定度采用平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。U(rec)=4．1% ÷(11)1/2=1．24 ×10－2，Urel(rec)=1．24 ×10－2÷97．9%=1．26×10－2。顯著性檢驗(yàn)是用來確定平均回收率與期望值1是否存在顯著性差異［7］:1．694≤tcrit，10=2．228，其中 t是自由度為10時(shí)的雙邊臨界值，結(jié)果表明差異不顯著。所以該方法不存在系統(tǒng)偏差，公式中不需要加入校正因子1/rec。不確定度評(píng)定的數(shù)學(xué)模型修正為:Ur2(X)

若顯著性檢驗(yàn)結(jié)果為存在顯著性差異，則結(jié)果需要用回收率校正因子進(jìn)行修正，且在不確定度評(píng)定過程中應(yīng)考慮系統(tǒng)偏差引入的不確定度分量。

2．4 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

將各個(gè)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量(見表4)進(jìn)行合成，則合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為 Ucrel(X)=［(8．16×10－6)2+(4．62 ×10－3)2+(1．93 ×10－2)2+(1．18 ×10－2)2］1/2=2．31 ×10－2。

表4 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度一覽

2．5 擴(kuò)展不確定度

取包含因子K=2，擴(kuò)展不確定度U(X)/X=2×Ucrel(x)=4．62 ×10－2。則 U(X)=57．82 ×4．62 ×10－2=2．67 μg/kg。

2．6 不確定度報(bào)告

玉米赤霉烯酮含量 =(57．82 ±2．67)μg/kg，K=2。

2．7 不確定度分量統(tǒng)計(jì)直方圖

如圖2所示，測量不確定度的主要來源為4個(gè)方面(其中m所表示的稱樣量由于數(shù)值相對(duì)較小按圖中比例未能顯示出來)，按引入的不確定度分量貢獻(xiàn)大小排序，依次為溶液測定、測量重復(fù)性、樣品定容、稱樣量。

圖2 不確定度分量統(tǒng)計(jì)直方圖

3 結(jié)論

液相色譜法測定谷物中玉米赤霉烯酮含量，結(jié)果表示為玉米赤霉烯酮含量 =(57．82±2．67)μg/kg，K=2。結(jié)果符合國標(biāo)［3］規(guī)定的誤差要求，本次評(píng)定合理有效。測量不確定度的主要來源為4個(gè)方面，按引入的不確定度分量貢獻(xiàn)大小排序，依次為溶液測定、測量重復(fù)性、樣品定容、稱樣量。稱樣引入的不確定度貢獻(xiàn)很小，基本可以忽略。溶液測定引入的不確定度貢獻(xiàn)最大，測定時(shí)要引起充分的重視。

［1］GB 2715—2005，糧食衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)［S］

［2］GB/T 5009．209—2008，谷物中玉米赤霉烯酮的測定［S］

［3］JJF 1135—2005，化學(xué)分析中不確定度評(píng)定［S］

［4］JJG 646—2006，移液器檢定規(guī)程［S］

［5］JJG 196—2006，常用玻璃量器檢定規(guī)程［S］

［6］JJF 1059—1999，測量不確定度評(píng)定與表示［S］

［7］中國試驗(yàn)室國家認(rèn)可委員會(huì)．化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南［M］．北京:中國計(jì)量出版社，2002:66．

Uncertainty Evaluation in HPLC Determination of Zearalenone in Cereals

Lu Meibin Li WeixiWu LiWang Bujun

(Institute of Crop Science，Chinese Academy of Agriculture Sciences，Supervision and Testing Center of Cereal Quality，Ministry of Agriculture，Beijing 100081)

The base of this investigation is the principles and methods of JJF 1059—1999《Evaluation and Expression of Uncertainty in Measurement》and JJF 1135—2005《Evaluation of Uncertainty in Chemical Analysis Measurement》．The sources of uncertainty in determination of zearalenone in cereals by high performance liquid chromatography(HPLC)were established by analyzing the whole determination procedure．Each uncertainty component was modeled，synthesized and expanded to develop an evaluation method of the uncertainty in HPLC determination of zearalenone in cereals．Results:The zearalenone content in cereals determined is(57．82 ± 2．80)μg/kg，K=2．There are four main sources of uncertainty attributed，which rank in decreasing order of uncertainty contribution as solution determination，measurement repeatability，sample dilution，and sampling．

HPLC，zearalenone，uncertainty

O657．71

A

1003－0174(2011)03－0114－05

2009年農(nóng)業(yè)部無公害農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測(2130109)

2010－03－01

陸美斌，女，1979年出生，助理研究員，食品科學(xué)與工程

王步軍，男，1960年出生，研究員，博士生導(dǎo)師，農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與安全