盧傳兵 劉雨晴 薛 明 王洪濤

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植保學(xué)院1，泰安 271018)

(煙臺市植保站2，煙臺 264001)

(河南省科學(xué)院天然產(chǎn)物重點實驗室3，鄭州 450002)

黃荊精油的提取和對5種儲糧害蟲的致毒作用

盧傳兵1，2劉雨晴1，3薛 明1王洪濤1

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植保學(xué)院1，泰安 271018)

(煙臺市植保站2，煙臺 264001)

(河南省科學(xué)院天然產(chǎn)物重點實驗室3，鄭州 450002)

為明確不同提取方法對黃荊精油的提取效果和黃荊精油對主要儲糧害蟲的毒力差異，采用水蒸氣蒸餾法、二氯甲烷提取法和超臨界CO2萃取法，分別從泰山黃荊(Vitex negundo)葉片和種子中提取精油，研究了水蒸氣蒸餾提取的黃荊葉片精油對綠豆象、谷蠹、玉米象、鋸谷盜和赤擬谷盜的毒力及殺蟲作用方式。結(jié)果表明:黃荊葉片或種子中的精油均以超臨界CO2萃取的提取率最高，水蒸氣蒸餾的提取率最低，葉片精油的提取率前者是后者的5．39倍，但對玉米象成蟲的綜合毒力后者卻是前者的5．95倍。水蒸氣蒸餾法從黃荊葉片中獲得的精油對綠豆象、谷蠹、玉米象、鋸谷盜和赤擬谷盜，不僅具有很高的觸殺、驅(qū)避和綜合殺蟲毒效，且對種群有持續(xù)控制作用，作為儲糧保護劑的開發(fā)價值大。

黃荊 精油 提取方法 儲糧害蟲 致毒作用

植物精油是從植物中提取出的具有特征性氣味的一類小分子揮發(fā)性物質(zhì)，一般通過蒸餾、浸提、壓榨以及吸附等方法獲得。在我國發(fā)展利用植物精油的優(yōu)勢和潛力都較大。目前已知精油含量較為豐富的植物有:柏科、木蘭科、樟科、蕓香科、傘形花科、唇形花科、姜科、菊科、桃金娘科、龍腦香科和禾本科等。特別在云南、廣西、四川、江西、吉林、江蘇、山東、海南等省及西北各省區(qū)，植物資源非常豐富，更有發(fā)展前途［1］。植物精油的用途十分廣泛，不僅作為調(diào)香劑廣泛應(yīng)用在香料、化妝品和食品中，由于多數(shù)具有生物活性，也用于醫(yī)用、殺蟲、殺菌等方面［2］。國內(nèi)外利用植物精油防治害蟲已進行了許多研究，因其來源于天然植物，揮發(fā)性強，具有對人畜安全、環(huán)境友好、在谷物中殘留量低等優(yōu)點，是開發(fā)儲糧熏蒸劑和驅(qū)避劑難得的資源［3－4］。目前已證明許多植物精油對儲糧害蟲具有明顯的殺蟲活性，作用方式多樣，作用機制新穎，作為儲糧防護劑具有很大的應(yīng)用潛力［5］，一些國外公司已將精油類農(nóng)藥投放市場［6］。前期的研究發(fā)現(xiàn)泰山黃荊(Vitex negundo Linnaeus)種子二氯甲烷提取物對多種農(nóng)業(yè)害蟲具有較高的殺蟲和驅(qū)避活性［7－8］。本試驗研究了不同提取方法獲得的黃荊精油對5種主要儲糧害蟲的殺蟲活性和作用方式，為黃荊精油作為儲糧保護劑開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 試蟲的采集與飼養(yǎng)

玉米象(Sitophilus zeamais Motschulky)、谷蠹(Rhizopertha dominica Fabricius)、赤擬谷盜(Tribolium castaneum Herbst)和鋸谷盜(Oryzaephilus surinamensis Linnaeus)采自山東省泰安市郊面粉廠;綠豆象(Callosobruchus chinensis Linnaeus)從泰安糧食市場購買帶蟲卵的綠豆飼養(yǎng)獲得。將無蟲的小麥、粗麥粉或綠豆置80℃烘箱中消毒2 h，調(diào)整含水量至14%，將預(yù)處理后的小麥、粗麥粉和綠豆分別裝入玻璃罐頭瓶中，在小麥中接入玉米象或谷蠹成蟲，粗麥粉中接入赤擬谷盜或鋸谷盜成蟲，綠豆中接入綠豆象的成蟲，瓶口加蓋帶有120目的銅紗網(wǎng)的塑料瓶蓋，置于溫度為(28±1)℃，RH=(75±5)%，光照12 L∶12 D的養(yǎng)蟲室內(nèi)連續(xù)飼養(yǎng)。接蟲后7 d，將成蟲篩除，使產(chǎn)下的卵孵化并繼續(xù)飼養(yǎng)，至新一代成蟲大量出現(xiàn)約5 d后，以此成蟲作試蟲。

1．2 供試植物

黃荊葉片和種子均采自泰山山坡，室內(nèi)陰干，用萬能粉碎機粉碎至60目左右。

1．3 試驗方法

1．3．1 黃荊精油的提取

1．3．1．1 水蒸氣蒸餾

采用水蒸氣蒸餾法提取，將黃荊葉粉和蒸餾水按1∶3裝入10 L的燒瓶中，電熱套加熱，保持混合物充分沸騰4～5 h，用揮發(fā)油收集器收集精油，并經(jīng)無水硫酸鈉脫水，放于棕色磨口試劑瓶中，置于5℃冰箱中保存?zhèn)溆?，重?fù)3次。

提取率=精油質(zhì)量/樣品質(zhì)量×100%

1．3．1．2 超臨界 CO2萃取

將黃荊種粉3 kg投入超臨界萃取釜中，分別對萃取釜、解析釜Ⅰ和Ⅱ進行加熱，當溫度達到45、50、50℃時，通入CO2，并打開高壓泵對萃取釜、解析釜Ⅰ和Ⅱ加壓，當壓力分別達到30、5和5 000 MPa時，開始循環(huán)萃取，調(diào)節(jié)流量為40 kg/h，恒溫恒壓萃取3 h出料，從解析釜Ⅰ中得到黃色膏狀半固體，重復(fù)3次。

取黃荊葉粉2．5 kg投入萃取釜中，按上述方法萃取3 h，分別從解析釜Ⅰ和解析釜Ⅱ獲得黃色黏稠半固體和黃色黏稠液體，重復(fù)3次。

提取率=提取物質(zhì)量/樣品質(zhì)量×100%

1．3．1．3 有機溶劑提取

稱取粉碎后的黃荊種粉放于具塞三角瓶中，加入3倍量的二氯甲烷，在25℃恒溫條件下浸泡48 h，期間每隔幾小時振蕩1次，然后用布氏漏斗進行抽濾，并沖洗2次。濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(水浴鍋溫度35℃，旋轉(zhuǎn)速率為210 r/min)，得到膏狀黏稠物，重復(fù)3次。

提取率=提取物質(zhì)量/樣品質(zhì)量×100%

1．3．2 水蒸氣蒸餾提取的黃荊葉片精油對主要儲糧害蟲的生物活性測定

1．3．2．1 綜合殺蟲毒力

采用飼料拌藥法測定［4］，稱取經(jīng)預(yù)處理的無蟲小麥、粗麥粉或綠豆，分別放入500 mL三角瓶中，90 g/瓶。將供試藥劑分別用丙酮稀釋成5個系列濃度，每瓶加入藥液1．8 mL，以60 r/min的速度人工混搖10 min，使其與飼料充分混合，然后倒出晾至丙酮完全揮發(fā)。以丙酮處理的飼料為對照。將處理后的90 g飼料分裝于3個大試管(Φ 3 cm×20 cm)中，向裝有小麥的試管中分別接入谷蠹或玉米象成蟲，粗麥粉中接鋸谷盜或赤擬谷盜成蟲，綠豆中接綠豆象成蟲，每試管20頭，用黑布封試管口，置于溫度為(28±1)℃，RH=(75±5)%的恒溫養(yǎng)蟲室內(nèi)飼養(yǎng)。處理后72 h檢查活蟲數(shù)，計算死亡率和校正死亡率，用DPS統(tǒng)計軟件求出毒力回歸式和LC50。

1．3．2．2 觸殺毒力

采用濾紙藥膜法測定［9］，將藥劑分別用丙酮稀釋成5個系列濃度，取Φ 9 cm的定性濾紙，平放于用3根昆蟲針支起的支架上，用微量移液器在濾紙上滴加1 mL稀釋好的藥液，待丙酮自然揮發(fā)后，將之平鋪于Φ 9 cm玻璃培養(yǎng)皿底部，在濾紙藥膜上放置玻璃環(huán)(Φ 8 cm×20 cm)，內(nèi)壁用滑石粉處理，以防止試蟲上爬。每玻璃環(huán)內(nèi)接入羽化5～10 d的同種成蟲20頭，以丙酮處理作對照，重復(fù)3次。置于溫度為(28±1)℃的養(yǎng)蟲室中，處理后72 h檢查活蟲數(shù)，計算死亡率和校正死亡率，用DPS統(tǒng)計軟件求出毒力回歸式和LC50。

1．3．2．3 驅(qū)避作用

采用Jilani等［10］方法。拌藥方法同綜合毒力測定。先將每一處理的90 g飼料等分成3份，再將1份處理與1份對照分別對稱放于Φ 12 cm培養(yǎng)皿內(nèi)的邊緣。用滑石粉處理培養(yǎng)皿內(nèi)壁，通過漏斗向培養(yǎng)皿中心部接入羽化5～10 d的同種試蟲20頭，使其自行向處理和對照的飼料上擴散，重復(fù)3次。處理后的試蟲放于(28±1)℃恒溫養(yǎng)蟲室內(nèi)，上部用黑布覆蓋。處理后48 h檢查試蟲在處理與對照飼料中的分布情況。按以下公式計算驅(qū)避率。

驅(qū)避率=(對照試蟲數(shù)－處理試蟲數(shù))/對照試蟲數(shù)×100%

1．3．2．4 種群的控制作用

采用綜合殺蟲毒力測定的方法，分別于接蟲后第15 d將成蟲篩去，保留卵，待對照的F1代蟲全部發(fā)育至成蟲期，檢查新一代成蟲(F1)數(shù)量，按下列公式計算其種群繁殖抑制率［4］。

繁殖抑制率=(對照F1代成蟲數(shù)－處理F1代成蟲數(shù))/對照F1代成蟲數(shù)×100%

2 結(jié)果與分析

2．1 三種提取方法的黃荊精油提取率和殺蟲活性比較

2．1．1 黃荊精油不同提取方法的提取率

由表1看出，提取率和提取方法密切相關(guān)，超臨界CO2萃取黃荊葉片中精油的提取率為1．24%，是水蒸氣蒸餾提取率0．23%的5．39倍;超臨界CO2萃取黃荊種子精油的提取率為12．90%，分別是二氯甲烷提取率7．85%和水蒸氣蒸餾提取率0．04%的1．64倍和322．50倍。表明黃荊葉片或種子中的精油均以超臨界CO2萃取的提取率最高，水蒸氣蒸餾法的提取率最低。水蒸氣蒸餾不適合用于提取黃荊種子中的精油。

表1 黃荊精油不同提取方法的提取率比較

2．1．2 不同提取方法的黃荊精油對玉米象的綜合毒力

由表2可知，葉片水蒸氣蒸餾、種子水蒸氣蒸餾、種子二氯甲烷提取、葉片超臨界CO2萃取和種子超臨界CO2萃取的黃荊精油，對玉米象成蟲72 h的LC50分別為 1．36、3．19、6．01、4．40、8．08 g/kg，種子超臨界CO2萃取黃荊精油的毒力最低，葉片水蒸氣蒸餾、種子水蒸氣蒸餾、種子二氯甲烷提取和葉片超臨界CO2萃取精油的毒力分別是種子超臨界CO2萃取的5．95、2．53、1．34、1．84 倍。雖然超臨界 CO2萃取黃荊葉片中精油的提取率是葉片水蒸氣蒸餾提取率的5．39倍，但是后者的毒力卻是前者的5．95倍，對玉米象的殺蟲毒力最高，說明水蒸氣蒸餾更適合用來直接提取黃荊葉片中具有殺蟲活性的精油。

表2 不同方法提取的黃荊精油對玉米象成蟲的綜合毒力比較

2．2 水蒸氣蒸餾提取的黃荊葉片精油對幾種儲糧害蟲的毒力和作用方式

2．2．1 對5種儲糧害蟲成蟲的綜合殺蟲毒力

由表3看出，處理后72 h，水蒸氣蒸餾提取的黃荊葉片精油對綠豆象、谷蠹、玉米象、鋸谷盜和赤擬谷盜5 種成蟲的 LC50分別為 0．73、1．02、1．36、1．62、2．23 g/kg，其中對赤擬谷盜的毒力最低，對綠豆象、谷蠹、玉米象和鋸谷盜的毒力分別是赤擬谷盜的3．05、2．19、1．65、1．38 倍，說明綠豆象和谷蠹對該精油較為敏感。

表3 水蒸氣蒸餾葉片的精油對5種儲糧害蟲成蟲的綜合殺蟲毒力

2．2．2 對4種儲糧害蟲成蟲的觸殺作用

由表4看出，水蒸氣蒸餾提取的黃荊葉片精油對谷蠹、玉米象、鋸谷盜和赤擬谷盜4種成蟲的LC50分別為 0．32、0．34、1．57 和 2．94 mg/cm2，其中也以對赤擬谷盜的毒力最低，對谷蠹、玉米象和鋸谷盜毒力分別是赤擬谷盜的9．16、8．71、1．87 倍。表明水蒸氣蒸餾提取的黃荊葉片精油對谷蠹和玉米象更敏感。Huang等［12］用濾紙浸漬法測定了肉豆蔻油對玉米象的觸殺作用，其72 h的LC50值為1．70 mg/cm2，與之相比，黃荊精油的毒力是肉豆蔻油的5倍，對玉米象的觸殺毒力更高。

表4 水蒸氣蒸餾提取的黃荊葉片精油對4種儲糧害蟲成蟲的觸殺毒力

2．2．3 對4種儲糧害蟲成蟲的驅(qū)避作用

圖1和圖2表明水蒸氣蒸餾提取的黃荊葉片精油對谷蠹、玉米象、鋸谷盜和赤擬谷盜4種成蟲均有很高的驅(qū)避作用，尤其對赤擬谷盜成蟲的驅(qū)避作用最強。在1～4 g/kg處理劑量下，對赤擬谷盜48 h的驅(qū)避率達82．15%～98．69%，顯著大于對其他3種成蟲的驅(qū)避率，對鋸谷盜、谷蠹和玉米象48 h的驅(qū)避率可達66．27%～92．79%。處理24 h后的驅(qū)避率均明顯高于48h。水蒸氣蒸餾提取的黃荊葉片精油對多種儲糧害蟲具有很高的驅(qū)避活性，作為儲糧害蟲驅(qū)避劑的開發(fā)價值大。

圖1 水蒸氣蒸餾提取的黃荊葉片精油不同濃度處理24 h對4種儲糧害蟲成蟲驅(qū)避作用

圖2 水蒸氣蒸餾提取的黃荊葉片精油不同濃度處理48 h對4種儲糧害蟲成蟲驅(qū)避作用

2．2．4 對5種儲糧害蟲的種群控制作用

圖3表明水蒸氣蒸餾提取的黃荊葉片精油對綠豆象、谷蠹、玉米象、鋸谷盜和赤擬谷盜5種儲糧害蟲均有很好的種群抑制作用，在2～4 g/kg處理劑量下，對綠豆象F1代的種群抑制率達100%;對谷蠹和玉米象F1代的種群抑制率達89．73%～100%;對鋸谷盜和赤擬谷盜F1代的種群抑制率達52．69%～90．18%。說明水蒸氣蒸餾提取的黃荊葉片精油對多種儲糧害蟲均有很好的種群控制效果。

圖3 水蒸氣蒸餾提取的黃荊葉片精油對5種儲糧害蟲的種群控制作用

3 討論與結(jié)論

三種提取方法相比，黃荊葉片或種子中的精油均以超臨界CO2萃取的提取率最高，水蒸氣蒸餾法的提取率最低。葉片和種子水蒸氣蒸餾、種子二氯甲烷提取、葉片和種子超臨界CO2萃取的黃荊精油，對玉米象成蟲72 h的都有明顯的綜合毒殺作用，LC50分別為 1．36、3．19、6．01、4．40、8．08 g/kg，其中以葉片水蒸氣蒸餾獲得的黃荊精油的毒力最高。采用水蒸氣蒸餾法從黃荊葉片中提取的精油，對綠豆象、谷蠹、玉米象、鋸谷盜和赤擬谷盜5種成蟲的的綜合毒力較高，處理后72 h的 LC50分別為0．73、1．02、1．36、1．62、2．23 g/kg;該精油對谷蠹、玉米象、鋸谷盜和赤擬谷盜4種成蟲還具有明顯的觸殺和驅(qū)避作用，處理后72 h 的觸殺 LC50分別為 0．32、0．34、1．57、2．94 mg/cm2;在 1 ～4 g/kg 劑量下，對赤擬谷盜48 h的驅(qū)避率達82．15%～98．69%。另外，該精油對綠豆象、谷蠹、玉米象、鋸谷盜和赤擬谷盜5種儲糧害蟲還有很好的種群抑制作用，在2～4 g/kg劑量下，對綠豆象F1代的種群抑制率達100%;對谷蠹和玉米象F1代的種群抑制率達89．73%～100%;對鋸谷盜和赤擬谷盜F1代的種群抑制率達52．69%～90．18%。說明水蒸氣蒸餾提取的黃荊葉片精油對多種儲糧害蟲均有很好的種群控制效果，作為儲糧害蟲保護劑的開發(fā)價值大。

植物精油是存在于植物不同組織(如果實、葉片、花和根)中的一類重要的次生物質(zhì)，常具有植物特征性氣味，通常含有低分子質(zhì)量的萜烯及生物酚類，一般是由幾十至幾百種化合物組成的復(fù)合物，常溫下多為油狀液體，易揮發(fā)，具有強烈的香味和氣味。許多種類已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和化妝品中，也有一些如桉樹油、薄荷油、菊蒿油、茼蒿油、蕓香精油、肉桂精油和豬毛蒿油等用于倉庫害蟲的防治［5］。植物精油可通過水蒸汽蒸餾法、壓榨法、溶劑萃取法和超臨界CO2萃取法等方法制備。雖然其提取方法較多，但因選擇的植物種類、部位不同，其提取方法不同對提取精油中的化合物組成影響較大。本研究證明從黃荊種子和葉片中提取精油，以超臨界CO2萃取黃荊種子的提取率最高，水蒸氣蒸餾提取黃荊葉片的精油提取率最低，超臨界CO2萃取黃荊葉片的精油提取率介于兩者之間;但所提取的精油對玉米象成蟲的毒力卻以葉片水蒸氣蒸餾的最高，種子超臨界CO2萃取的最小，前者為后者的5．95倍。水蒸氣蒸餾法難以從黃荊種子中提取精油，其提取率僅為0．04%;二氯甲烷提取精油不僅浪費大量有機溶劑、操作過程較繁瑣，而且因提取的精油成分較復(fù)雜，殺蟲毒力也較低。通過提取方法、植物器官、提取成本和殺蟲毒力的優(yōu)選，可獲得最佳提取方法。并證明利用水蒸氣蒸餾方法從黃荊葉片中提取精油最好。

Buiyah等［13］報道了黃荊葉粉與谷物混合在一起可以有效的防治谷物害蟲，Miah等［14］發(fā)現(xiàn)了黃荊葉粉可以顯著減少綠豆象的產(chǎn)卵和成蟲的發(fā)生;David等［15］發(fā)現(xiàn)了黃荊水蒸氣精油對麥蛾和致倦庫蚊具有強烈的驅(qū)避作用。這些研究結(jié)果充分表明了黃荊中含有對儲糧害蟲毒殺、驅(qū)避和抑制種群增長的物質(zhì)。陳振峰等［16］報道了采自秦嶺洛陽的黃荊葉片，利用水蒸氣蒸餾獲得的精油成分中99．14%為萜烯類物質(zhì);潘炯光等［17］報道了采自廣西龍州縣的黃荊葉片，上述同樣方法提取的精油中92．35%是萜烯類物質(zhì);盧傳兵等［18］前期研究已經(jīng)證明，水蒸氣蒸餾提取的泰山黃荊葉片精油成分中88．80%是萜烯類物質(zhì)，其中石竹烯、桉樹腦和 α － 蒎烯分別占 35．97、8．21、0．69%，另外還含有大牦牛兒烯D等。本研究進一步表明黃荊精油對5種主要儲糧害蟲成蟲殺蟲毒力高、作用方式多樣、對其種群抑制作用大。隨著溴甲烷(Methyl bromide)作為儲糧熏蒸劑和口岸檢疫除害處理劑的停用，磷化氫(Phosphine)將成為世界范圍內(nèi)登記使用的唯一熏蒸劑，但是由于長時間不合理使用磷化氫，導(dǎo)致主要儲糧害蟲對磷化氫普遍產(chǎn)生抗性，人們對殲滅儲糧害蟲的技術(shù)手段感到憂慮［19－20］，急需開發(fā)一種利用現(xiàn)有技術(shù)快速殺滅有害生物的熏蒸劑。因黃荊精油揮發(fā)性強，成分較多，可望從中篩選仿生合成的先導(dǎo)化合物。我國黃荊野生資源豐富，分布廣泛，其醫(yī)用價值在中藥研究方面已比較深入，但作為天然儲糧保護劑的潛力更大，應(yīng)大力開發(fā)利用。

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Extraction of Vitex negundo Essential Oil and the Intoxicating Actionof Extracts to Five Main Stored－Product Insect Pests

Lu Chuanbing1，2Liu Yuqing1，3Xue Ming1Wang Hongtao1

(Department of Entomology，College of Plant Protection Shandong Agricultural University1，Tai'an 271018)
(Plant Protecting Station of Yantai2，Yantai264001)
(Key Laboratory of Natural Products of Henan Academy of Science3，Zhengzhou 450002)

To determine the extraction efficiency of different extraction methods and the intoxicating action of Vitex negundo essential oil to main stored － product insect pests，the steam distillation，cold － dip and supercritical CO2methods were used to extract the essential oil in the seeds and leaves of V．negundo collected from Taishan Mountain．The virulence and action modes of the aqueous extract from V．negundo．leaves to Sitophilus zeamais Motschulky，Rhizopertha dominica Fabricius，Tribolium castaneum Herbst，Oryzaephilus surinamensis Linne．a(chǎn)nd Callosobruchus chinensis Linne．were also studied．The results were as follows:distilling efficiency of supercritical CO2methods was the highest and that of the steam distillation was the lowest．The distilling efficiency of essential oil from leaves was 5．39 times higher than that of the latter．However，the compositive toxicity to S．zeamais of the latter was 5．95 times higher than of the former．Aqueous extract from V．negundo．leaves to S．zeamais，R．dominica，T．castaneum，O．surinamensis and C．chinensis had not only high contact toxicity，repellent effect and compositive toxicity，but also sustainable population control effect．It indicated that it had produced high value as grain protectant．

Vitex negundo，essential oil，extraction method，stored － product insect pests，intoxicating action

S482．3+9

A

1003－0174(2011)03－0075－06

山東省自然科學(xué)基金(Y2006D13)，山東省教育廳項目(J04C06)

2010－01－07

盧傳兵，男，1980年出生，農(nóng)藝師，碩士，害蟲綜合治理

薛明，女，1961年出生，教授，博士生導(dǎo)師，昆蟲生態(tài)與害蟲綜合治理