馮 立

（上海體育職業(yè)學(xué)院，上海 200237）

運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠心肌細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響

馮 立

（上海體育職業(yè)學(xué)院，上海 200237）

目的：研究運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)SHR心肌細(xì)胞中HSP－72、Bcl－2和蛋白激酶β（PKB）、Bax、糖原合成激酶－3（GSK－3）的影響，以探討其對(duì)運(yùn)動(dòng)引起心肌細(xì)胞凋亡的作用。方法：以SHR大鼠中等強(qiáng)度訓(xùn)練為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，采用Western bloting技術(shù)檢測(cè)了大鼠心肌細(xì)胞中調(diào)控蛋白HSP－72、Bcl－2和蛋白激酶β（PKB）、Bax、糖原合成激酶－3（GSK－3）的表達(dá)。結(jié)果：長(zhǎng)期中等強(qiáng)度訓(xùn)練可以提高心肌細(xì)胞中抑凋亡蛋白HSP－72、Bcl－2和蛋白激酶β（PKB）的表達(dá)，凋亡蛋白Bax、糖原合成激酶－3（GSK－3）表達(dá)顯著降低，Bcl－2／Bax的表達(dá)沒有顯著變化，從而抑制心肌細(xì)胞的凋亡。結(jié)論：心肌細(xì)胞中HSP－72、Bcl－2和蛋白激酶β（PKB）、Bax、糖原合成激酶－3（GSK－3），Bcl－2／Bax在運(yùn)動(dòng)后的不同表達(dá)對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生有明顯的抑制作用。

Bax；Bcl－2；血壓；糖原合酶－3；心臟；HSP－72；蛋白激酶－β；自發(fā)性高血壓大鼠

運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練是降低高血壓的有效的非藥理學(xué)方法。大量研究結(jié)果表明，長(zhǎng)期中等強(qiáng)度的有氧訓(xùn)練可以使收縮壓平均降低11mmHg（5－25mmHg），舒張壓平均降低8mmHg（3－15）［1］。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以防止心肌線粒體不成比例的增長(zhǎng)，防止肥大心臟左心室心肌膠原纖維的不成比例的增長(zhǎng)［2］。心肌細(xì)胞的凋亡在血壓升高的加速期以及高血壓向心衰期過度時(shí)期，對(duì)于心肌細(xì)胞的重塑起到了非常重要的作用［3］。調(diào)控細(xì)胞凋亡的蛋白包括熱休克蛋白72（HSP－72）和Bcl－2蛋白家族，抑凋亡蛋白Bcl－2和凋亡前蛋白Bax是高血壓大鼠心肌細(xì)胞凋亡過程中心肌線粒體功能的主要調(diào)節(jié)者［45］。

研究表明，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)于凋亡通路的影響作用都涉及到胰島素抵抗和細(xì)胞凋亡。而絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶β，肝糖原合成激酶β，在自發(fā)性高血壓大鼠還有待研究［6］。既往研究表明，通過運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以使糖尿病大鼠左心室PKB、GSK－3v殘基磷酸化水平明顯下降并且恢復(fù)到正常水平［7］。PKB抑制凋亡級(jí)聯(lián)，是通過Bcl－2家族前凋亡蛋白Bad的失活、Bcl－2蛋白和PKB的磷酸化使線粒體轉(zhuǎn)換空關(guān)閉以及蛋白激酶β促進(jìn)葡萄糖和氨基酸的吸收，從而導(dǎo)致蛋白的合成和GSK－3的失活實(shí)現(xiàn)的。而GSK－3又是PKB下游重要的靶點(diǎn)，它的失活將會(huì)促進(jìn)糖原的合成并且提供一個(gè)可能促凋亡的機(jī)制［8］。GSK－3在跑臺(tái)訓(xùn)練大鼠的骨骼肌中并沒有被胰島素激活。研究表明，自發(fā)性高血壓大鼠在4周齡的時(shí)候，平均動(dòng)脈壓開始上升，而運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)這個(gè)時(shí)期大鼠的心功能和血壓都有有益的影響［9］。并且發(fā)現(xiàn)凋亡前蛋白表達(dá)升高以及病理性心臟重塑［10］。有關(guān)運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌細(xì)胞中PKB／GSK－3通路、抑凋亡元素HSP－72、Bcl－2以及凋亡蛋白Bax的影響，國(guó)內(nèi)外尚沒有較全面的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)試圖研究運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌細(xì)胞中PKB／GSK－3通路、抑凋亡元素HSP－72、Bcl－2以及凋亡蛋白Bax的影響，以探討凋亡調(diào)控基因?qū)\(yùn)動(dòng)引起心肌細(xì)胞凋亡的作用，為進(jìn)一步研究運(yùn)動(dòng)性疲勞的機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

14只遺傳性自發(fā)性高血壓雄性大鼠，3周齡，常規(guī)分籠喂養(yǎng)，自然光照，飼養(yǎng)環(huán)境溫度（23±4）℃，自由飲水進(jìn)食（自發(fā)性高血壓大鼠血壓升高的加速期在4～9周齡期間，因此，建立13周動(dòng)物模型）［11］。

1．2 分組和訓(xùn)練方法

大鼠購(gòu)進(jìn)后，先適應(yīng)性喂養(yǎng)2天，稱重后隨機(jī)分成2組，運(yùn)動(dòng)組（8只）和安靜組（6只），SHR大鼠每周訓(xùn)練5天，周一至周五，跑臺(tái)訓(xùn)練8周，在第4周開始訓(xùn)練。適應(yīng)期每分鐘15m，每天15min，適應(yīng)期后每分鐘18m，每天120min［11］。

1．3 實(shí)驗(yàn)方法

1．3．1 每周血壓的測(cè)定 安靜狀態(tài)下每周記錄大鼠的收縮壓，從第2周到第8周，在第5周的時(shí)候，在訓(xùn)練后1、3、12小時(shí)后補(bǔ)測(cè)3次，用來檢測(cè)訓(xùn)練對(duì)大鼠收縮壓的急性影響。

1．3．2 樣本采集 各組大鼠斷頭處死后，迅速取出心臟洗盡殘血，取心室肌。對(duì)照組也以同樣方法收集標(biāo)本。

1．3．3 骨骼肌細(xì)胞色素C氧化酶和心肌糖原含量 左心室糖原濃度測(cè)定用分光光度計(jì)來測(cè)定。骨骼肌細(xì)胞色素C氧化酶活性，被常用來驗(yàn)證訓(xùn)練效果的重要的標(biāo)記物。細(xì)胞色素氧化酶的測(cè)定通過分光光度計(jì)測(cè)定［11］。

1．3．4 勻漿和樣品制備 取左心室前壁全層心肌組織，分兩份，一份即刻存至－70℃冰箱，用作免疫印跡檢測(cè)；一份用4%多聚甲醛固定24h后蔗糖沉淀過夜，取左心室近心尖處心肌組織作10um厚冰凍切片，每個(gè)標(biāo)本取兩張不連續(xù)切片，用作TUNEL檢測(cè)。將左室心肌及骨骼肌剪成碎片，以針頭輕輕劃碎。清洗3次；15min后棄上清，以含0．6mmoL／L CaCl2的無鈣K－H液清洗沉降細(xì)胞；10min后以含1．0mmoL／L CaCI，的無鈣K—H液清洗沉降細(xì)胞后備用［12］。

1．3．5 免疫印跡法檢測(cè)心肌組織中Bax、Bcl2、PKB的表達(dá)

①蛋白樣品的制備：取凍存的心肌標(biāo)本100mg，加裂解液1 ml及PMSF，protcase inhibitor cocktail，phosphatase inhibitor cocktail各10μl，冰上勻漿30min，4℃12 000r／min離心15min，取上清，測(cè)定蛋白濃度后與等體積2×上樣緩沖液混勻后煮沸3min，－20℃保存以備用。②免疫印跡：按照實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法配制10%SDS—PAGE，以總蛋白量30ug／lane上樣，電泳；轉(zhuǎn)膜，以1∶400鼠抗bax單克隆抗體或1∶400鼠抗Bcl－2單克隆抗體及1∶5000辣根過氧化物酶標(biāo)羊抗鼠IgG孵育，用ECL發(fā)光劑顯示陽(yáng)性條帶，在Ty2phoon分子成像系統(tǒng)上記錄結(jié)果。以β－actin為內(nèi)參照，目標(biāo)蛋白條帶及β－actin條帶為同次電泳所得，以兩者的比值進(jìn)行半定量［13］。

1．3．6 數(shù)理統(tǒng)計(jì)法 使用SPSS 17．0統(tǒng)計(jì)軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間比較采用T檢驗(yàn)，相關(guān)性的評(píng)價(jià)采用皮爾遜積差測(cè)試。結(jié)果顯著程度用P＜0．05表示。

2 結(jié)果與分析

2．1 血壓和左心室功能

SHR在訓(xùn)練過程中收縮壓和舒張壓在第6周之前顯著上升，而訓(xùn)練方式對(duì)血壓的變化沒有顯著性影響（圖1）。相反，訓(xùn)練后麻醉狀態(tài)下大鼠收縮壓和舒張壓升高的更高，與安靜組比較（表1）。心率和壓力最大速率以及舒張最大速率訓(xùn)練組和運(yùn)動(dòng)組差異沒有顯著性（表1）。雖然訓(xùn)練對(duì)高血壓大鼠的平均動(dòng)脈壓沒有長(zhǎng)期影響，但卻有急性的影響。在第5周訓(xùn)練期間，血壓在訓(xùn)練后3～12h下降明顯。

圖1 訓(xùn)練對(duì)血壓的影響

表1 訓(xùn)練組大鼠和安靜組大鼠各項(xiàng)生理指標(biāo)的比較

訓(xùn)練組大鼠與安靜組大鼠相比，訓(xùn)練對(duì)SHR心臟以及跖肌重量、骨骼肌細(xì)胞氧化酶的活性以及心肌糖原含量的變化影響表現(xiàn)為心臟重量的變化差異沒有顯著性，但是HW／BW顯著升高（表1）。同樣，跖肌重量變化差異沒有顯著性，而跖肌重量與體重（P／BW）相比卻顯著升高（表1）。訓(xùn)練組大鼠跖肌細(xì)胞色素氧化酶的活性顯著增強(qiáng)，心肌糖原的濃度增加了39%（圖3），GSK－3β、PKB－Ser473的磷酸化，PKB下游重要的靶點(diǎn)沒有顯著的變化。然而，GSK－3β、PKBSer473的磷酸化與PKB Thr308和PKB－Ser473的磷酸化密切相關(guān)（（r＝0．60and 0．58，P＜0．05）。

圖2 訓(xùn)練結(jié)束1、3、12h后大鼠血壓變化、訓(xùn)練前后血壓的變化

圖3A 訓(xùn)練組以及安靜組大鼠蛋白激酶β的變化，蛋白質(zhì)印跡分析蛋白激酶的表達(dá)，PKB Thr308 and Ser473的磷酸化

圖3B 訓(xùn)練組和安靜組大鼠蛋白激酶β磷酸化的比較

2．2 訓(xùn)練對(duì)高血壓大鼠左心室HSP72以及Bcl－2／Bax蛋白表達(dá)的影響

與安靜組相比較，訓(xùn)練組大鼠Bax的表達(dá)下降了91%。Bcl－2蛋白的表達(dá)升高了106%（圖4），訓(xùn)練組大鼠與安靜組大鼠Bcl－2／Bax差異沒有顯著性；與安靜組相比，訓(xùn)練組大鼠HSP72蛋白的表達(dá)升高了71%。

圖4A 訓(xùn)練組大鼠和安靜組大鼠Bcl－2，Bax變化的比較。A Western blotting檢測(cè)Bcl－2，Bax蛋白表達(dá)的結(jié)果

圖4B 兩組大鼠Bcl－2，Bax蛋白表達(dá)變化結(jié)果

3 分析與討論

由于自發(fā)性高血壓大鼠的血壓在第4周的時(shí)候顯著增加，驗(yàn)證了在這個(gè)時(shí)間點(diǎn)上運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)血壓的影響，以及心功能、線粒體功能相關(guān)的蛋白的表達(dá)，以及心肌細(xì)胞的存活［14］。長(zhǎng)時(shí)間的跑臺(tái)訓(xùn)練對(duì)心肌的適應(yīng)性以及蛋白的表達(dá)具有非常明顯的影響［15］。

本研究中，長(zhǎng)期的跑臺(tái)訓(xùn)練在大鼠血壓的急速升高期并沒有下降，相反表現(xiàn)出升高的趨勢(shì)。大量研究表明，耐力訓(xùn)練可以降低高血壓患者的血壓。然而許多研究就耐力訓(xùn)練對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠血壓的影響報(bào)道不一致［16－17］。許多研究者采用跑臺(tái)訓(xùn)練、游泳訓(xùn)練和跑輪訓(xùn)練模型，研究運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)大鼠血壓的影響。有的學(xué)者研究結(jié)果表明運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)血壓的升高有明顯的影響，而有的研究結(jié)果表明對(duì)血壓的影響有降低的趨勢(shì)，而有的研究結(jié)果則表明沒有明顯的差別［18］。這些研究結(jié)果的差異可能與運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度、運(yùn)動(dòng)時(shí)間、運(yùn)動(dòng)模型、應(yīng)激以及環(huán)境因素的影響有關(guān)。并且，訓(xùn)練對(duì)大鼠血壓升高的機(jī)制還不清楚。有學(xué)者研究認(rèn)為，在訓(xùn)練的刺激下，去甲腎上腺素分泌升高可能是其中的原因之一［19］。相比之下，很多學(xué)者研究表明低強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以降低SHR的收縮壓、舒張壓、平均動(dòng)脈壓［20］。

國(guó)外學(xué)者研究結(jié)果表明，低強(qiáng)度訓(xùn)練引起血壓下降，高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練引起血壓升高可能與心率的變化有密切的關(guān)系，而心率的變化與交感神經(jīng)緊張性有密切的聯(lián)系，它使心輸出量降低而不改變外周阻力［21－22］。這些研究結(jié)果與我們的研究相比較發(fā)現(xiàn)，兩種運(yùn)動(dòng)模型的運(yùn)動(dòng)速度相似，但我們的運(yùn)動(dòng)模型運(yùn)動(dòng)持續(xù)時(shí)間較短。一個(gè)可能的原因就是在訓(xùn)練的條件下應(yīng)激的影響可能是血壓升高的一個(gè)因素。實(shí)際上，在對(duì)SHR進(jìn)行跑臺(tái)訓(xùn)練的過程中，電刺激的作用對(duì)大鼠血壓的變化就是一個(gè)很大的影響因素。然而，在一個(gè)星期之后，我們通過對(duì)SHR大鼠的血壓的測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SHR的血壓組間并沒有顯著的差異。在對(duì)電刺激對(duì)SHR的影響進(jìn)行嚴(yán)格的控制后，我們發(fā)現(xiàn)麻醉狀態(tài)對(duì)運(yùn)動(dòng)大鼠的血壓的影響也是一個(gè)重要的因素。因此，訓(xùn)練時(shí)間可以對(duì)血壓變化的影響加以解釋。事實(shí)上，訓(xùn)練大鼠的血壓在3～12小時(shí)時(shí)候就開始下降，表明訓(xùn)練的形式對(duì)血壓的下降有明顯的影響，雖然運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)血壓影響不是長(zhǎng)期的。

運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練和高血壓誘導(dǎo)的生理性和病理性心肌肥厚模型都是心臟對(duì)血流動(dòng)力學(xué)超負(fù)荷的反應(yīng)。生理性心臟肥大對(duì)心功能是有益的，而病理性心肌肥厚對(duì)心功能的影響是負(fù)面的。在我們的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，?xùn)練并沒有進(jìn)一步增加心臟的肥大程度［23］。與安靜組比較，訓(xùn)練組SHR左心室收縮指數(shù)沒有顯著的變化，因此，長(zhǎng)期的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)SHR心功能并沒有產(chǎn)生影響，盡管有證據(jù)表明訓(xùn)練可以提高骨骼肌細(xì)胞色素氧化酶的活性。研究表明，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)心臟的功能、線粒體、糖原具有許多良好的影響［24］。研究結(jié)果表明，訓(xùn)練組SHRPKB磷酸化的程度顯著升高，PKB的磷酸化與GSK－3βSer9的磷酸化密切相聯(lián)系。

細(xì)胞凋亡在SHR血壓增加期向心力衰竭過度期在心臟的重塑過程中起到非常關(guān)鍵的作用，我們檢測(cè)了訓(xùn)練后Bax和Bcl－2蛋白的表達(dá)，SHR心肌層抑凋亡蛋白Bcl－2和Bax的比率顯著降低，從而誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的凋亡，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練并沒有改變Bcl－2／Bax，但是，安靜組與運(yùn)動(dòng)組SHR大鼠相比，Bcl－2和Bax的表達(dá)都升高了，訓(xùn)練組SHR心肌層Bax蛋白表達(dá)的升高可能與較低的糖原濃度以及慢性血壓的升高導(dǎo)致心臟負(fù)荷增加有關(guān)。糖原的濃度在訓(xùn)練結(jié)束后48h仍保持很低的濃度，SHR心臟胰島素抵抗以及脂肪酸氧化的損傷，更說明了糖原濃度的重要作用。

國(guó)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)糖原濃度的降低會(huì)導(dǎo)致Bax結(jié)構(gòu)染色體畸變［25］。在本研究中，還不清楚Bax表達(dá)的升高是否是因?yàn)锽ax從胞漿轉(zhuǎn)移到線粒體。然而，Bcl－2的表達(dá)升高仍然是一個(gè)保護(hù)性機(jī)制，在線粒體的外膜阻止Bax的寡居化從而降低Bax結(jié)構(gòu)染色體畸變。HSPS抗凋亡的作用機(jī)制獨(dú)立于Bcl－2，HSP70通過阻止半光天冬酶的水解來阻止壓力誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，此外，HSP72通過阻止GSK－3β在細(xì)胞核的集聚來抑制細(xì)胞的凋亡。以前的研究表明，正常血壓大鼠訓(xùn)練后心肌層HSP72mRNA表達(dá)顯著升高，同樣，HSP72蛋白在訓(xùn)練后SHR心肌層表達(dá)明顯升高。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后大鼠心肌層HSP72表達(dá)顯著升高的機(jī)制還不清楚［26］。但是，HSP72表達(dá)的升高支持了運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練有益于抑制細(xì)胞凋亡的通路，從而保護(hù)心肌層。

4 結(jié)論

細(xì)胞凋亡是一個(gè)高度調(diào)控的過程，主要通過死亡受體和線粒體兩條途徑進(jìn)行。心肌細(xì)胞的凋亡在心臟疾病中的作用是不容忽視的。目前各種生活方式疾病——高血壓、糖尿病、肥胖等都直接或間接與心臟的受累相關(guān)。導(dǎo)致其死亡率增加。而運(yùn)動(dòng)可能通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、上調(diào)HSP蛋白的表達(dá)和激活PKB等途徑調(diào)控心肌凋亡，包括心肌層PKB和HSP－72通路；抗凋亡蛋白HSP－72和Bcl－2的表達(dá)的增加。但是運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練沒有提高Bcl2／Bax，提示在SHR心肌抗凋亡機(jī)制有效地代償了促凋亡基因的表達(dá)。總之，心肌細(xì)胞中凋亡調(diào)控蛋白Bcl－2、Bax和HSP－72，PKB，GSK－3在運(yùn)動(dòng)后的不同表達(dá)對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生有明顯的調(diào)控作用。

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Exercise Training Influence on Myocardial Apoptosis of Spontaneously Hypertensive Rat’s Protein Expression

FENG Li（Shanghai Sports Institute，Shanghai 200237，China）

Objective：To study exercise training on SHR cardiomyocytes HSP－72，Bcl－2 and protein kinaseβ（PKB），Bax、Bcl－2，glycogen synthase kinase－3（GSK－3）to investigate its effect on exercise－induced myocardial cell apoptosis．Methods：taking SHR rats as the experimental model of moderate－intensity training，detected by Western bloting a regulatory protein in rat heart cells HSP－72，Bcl－2 and protein kinaseβ（PKB），Bax、glycogen synthase kinase－3（GSK－3）expression．Results：Long－term moderate intensity training can improve myocardial cells antiapoptotic protein HSP－72，Bcl－2 and protein kinaseβ（PKB）expression，Bax、glycogen synthase kinase－3（GSK－3）was significantly decreased，Bcl－2／Bax expression did not change significantly，thereby inhibiting apoptosis of myocardial cells．Conclusion：Different expression of Myocardial cells of HSP－72，Bcl－2 and protein kinaseΒβ（PKB），Bax、glycogen synthase kinase－3（GSK－3），Bcl－2／Bax expression arfter exercise has significantly inhibited on myocardial cell apoptosis．

Bax；Bcl－2；blood pressure；glycogen synthase－3；heart；HSP－72；protein kinase－β；spontaneously hypertensive rats

G804．5

A

1004－0560（2011）03－0064－04

2011－03－15；

2011－04－25

馮 立（1976－），男，講師，碩士，主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)。

喬艷春

?運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)